消减杂交

食品和化学毒物学63（2014）84-90 镉诱导基因姬松茸鉴定 通过抑制性消减杂交 文章信息 關鍵詞： 食用菌 ,姬松茸 ,鎘 ,基因表達 ,抑制性消減雜交 摘要: 镉（Cd）是最严重的环境污染物之一。丝状真菌是非常有前途的有机体用于控制和减少重金属的由释放的量的人力和工业活动。然而，参与镉积累和丝状宽容的分子机制真菌不完全理解。姬松茸，可食用蘑菇的药用价值，表明高耐受性的重金属，尤其是镉。调查的分子机制镉暴露后姬松茸的相关反应，我们构建了正向消减文库的代表了姬松茸镉诱导基因在4 ppm的镉胁迫对使用抑制子牵引杂交结合镜面方向选择14天。差异筛选允许我们确定39个基因表达上调，其中26都参与了代谢，蛋白质的命运，细胞运输，运输便利化和运输路线，电池救援，国防和毒力，转录和行动用绑定功能，和13种蛋白质的编码都假定蛋白质的功能尚不清楚。电磁炉的镉暴露后六个月姬松茸基因用RT- qPCR的进一步证实。分离出的cDNA在这项研究有助于我们参与的生化途径， partic - ipate在丝状真菌中，以镉暴露的应答基因的认识. 介绍食用担子菌姬松茸，普遍 被称为“Cogumelo做索尔”在巴西，日本，'Himematsutake'，或 “戎机歌”在中国，原产于巴西，和过气的小路tivated其药用用途多年在日本和中国广泛。 这种真菌被认为是一个最有价值的食用和 烹饪药用蘑菇品种及其生物技术 营养和药用价值也很高，有据可查 （Firenzuoli等，2008）。多糖植物复合物的 姬松茸被认为是负责其免疫刺激 和抗肿瘤性质（Firenzuoli等人，2008; Biedron等。 2012）。但是，重金属的积累（尤其是 镉）的姬松茸受到了关注，在过去增大而增大几 几十年来由于对食品安全的负面影响，马尔萨斯 潜在的威胁到消费者的健康。的收获子实体 姬松茸能积累高浓度的镉，范围 从10毫克公斤 1 到30毫克公斤 1 干物质（卡拉克，2010年，孙 等人，2012），阙比许多食用菌高得多 品种包括双孢蘑菇，香菇，平菇 平菇，黑木耳等。因此，一些中国 生态学家目前被认为是姬松茸作为一个潜在的镉mulator hyperaccu''''，阙可用于生态重金属 污染土壤的修复…. 对植物耐受机制最近的研究表明，谷胱甘肽（GSH）和其相关的代谢酶，蛋白质和 肽通过控制起到重金属耐受性的关键作用 不同植物的生理过程，包括活性氧 簇（ROS）和甲基乙二醛（MG）解毒，重金属 摄取，转运，螯合，和解毒（侯赛因等人， 2012）。虽然涉及到重金属的运输，车的相关特征研，以及诸如运输和重金属螯合分子 螯合剂是很好的候选积累和宽容， 关于全球基因表达的信息仍然非常LIM资讯科技教育。酿酒酵母是一个强大的模式生物 研究重金属毒性的分子机制和 耐受性真菌。虽然许多研究结果在最近几年有 改善了我们其中S.蜡，visiae和其他酵母菌应对重金属，分子洞察机制的理解 成金属生物学的许多方面仍然不明（威索基 和愚昧，2010）。这些未知的机制包括如何将这些 保护细胞免受重金属的毒性蛋白质调解 宽容，怎么重金属激活转录因子andsignaling蛋白质，以及如何将这些蛋白质，反过来，激活他们的 基因/蛋白指标。因此，进一步的调查，以查明 负责镉积累和宽容的关键基因 要了解所涉及的分子机制 在丝状真菌Cd胁迫的响应。此外，该关键基因 有关镉耐受性是很好的候选改变 镉在姬松茸的积累，通过遗传改良， 对于有关镉食品安全的一个重要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ….. 我们目前的研究目的是探讨增强表达 致镉曝光和对焦真菌姬松茸的基因 对负责Cd胁迫重新sponses关键基因的鉴定。我们使用基于抑制设备消减杂交法（SSH）结合镜实现这一目标 方向选择（MOS）。这项技术使我们能够确定 具体很少表达镉诱导性基因（Diatchenko 等人，1996; Rebrikov等人，2000）。我们还通过cDNA微阵列 作为杂交的反向Northern blot分析而达到消灭假阳性克隆，并提高选择效率的一种形式。 Addi-倚重，诱导姬松茸镉基因暴露后为 通过实时逆转录聚合酶进一步证实 链反应（RT-qPCR的）. 2材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 2.1。真菌物质和Cd处理 从三明真菌学院报，土特，福建，中国获得姬松茸AB002的应变。该菌株通常生长在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）的 媒体与0.5％（W / V）胰蛋白胨，转移到新的培养基中每 3个月。建立了两个疗程：姬松茸培养中存在镉 （测试样品）和真菌在无镉（驱动程序示例）的培养。氯化镉 2 加入到培养液中的4 ppm的终浓度。经过14天的 治疗时，CD-处理的和未处理姬松茸菌丝收获，请立即在液氮中冷冻，并保存于？ 80？ C，直到使用。 2.2。RNA提取和SSH/马鞍山 总RNA，姬松茸菌丝体两种治疗下提取（测试 司机样品）用Trizol ？ 试剂（Gibco公司，德国）根据制造商的指示。对于每个治疗，RNA的混合物中从在分离 至少有三个独立的文化。 RQ1无RNA酶的DNA酶（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州， 美国）被用于除去DNA污染的RNA样品中。 mRNA的是ISO-lated使用的Oligotex mRNA的Mini试剂盒（Qiagen公司，德国）。在第一个杂交化，测试样品进行杂交，在测试仪的比率超出司机：DRI-VER1:30在68？加热8小时。在第二次杂交，1 LL驱动混合物（1 LL 杂交缓冲液中，1 LL驱动器，以及2 LL水）杂交与所述第一 在68杂交液？过夜。然后进行PCR扩增 用PCR引物1（5 0  -  CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 0 ），其次是巢式PCR 引物1（5 0  -  TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3 0 ）和引物2R（5 0  -  AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3 0 ），以扩增差异表达cDNA的那 对应姬松茸的基因在人群镉暴露的差异表达。在MOS技术被用来消除假阳性克隆 从下面的Rebrikov等人的方法SSH文库。 （2000年）。产品 MOS管被克隆到的pMD19-T载体（宝，大连，中国），然后 根据Inoue等人利用结扎反应重刑转化为ultracompetent JM109大肠杆菌细胞。 （1990）。超过1500个阳性克隆，随机 选择并转移至384孔板中，并培养在旋转摇床 （2000转/分），在37？下6小时. 2.3。消减杂交效率测试 为了评估抑制性消减杂交消减效率 过程中，使用PCR-选择cDNA的执行减法运算效率测试 减法试剂盒（BD Biosciences公司Clontech，美国）按照生产商的 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 。持家基因，甘油醛-3 - 磷酸脱氢酶 （GAPDH）从姬松茸通过根据使用的PCR引物克隆 Kreuzinger等。 （1996）。的引物组，然后在该实验中使用到的AM-GAPDH化了，其被选择作为阴性对照为减法效率测试。 将GAPDH的部分cDNA的核苷酸序列在GenBank联合国德保藏号KF650659. 2.4。cDNA微阵列和反向Northern blot分析 的cDNA阵列和反向Northern印迹分析，根据执行 Li等人。 （2013年）。在姬松茸GAPDH基因作为内标 2.5。的消减cDNA文库和序列注释测序 通过反向Northern印迹获得的阳性克隆进行测序 使用自动DNA测序仪（ABI377，应用生物系统公司，福斯特城， CA，USA）在海基康生物技术（上海，中国）。原cDNA序列 由Chromas2.30（Technely-sium，Tewantin的，澳大利亚昆士兰州）或通过目测最初修剪载体，引物，和适配器。短序列 超过100个碱基，模糊的序列被丢弃。修整后的cDNA SE-quences代表的SSH/ MOS库，然后进行同源性分析 使用基本局部比对搜索工具（BLAST）×算法在全国 生物技术信息中心（NCBI）网站（。 GOV/ Blast.cgi）。唯一的推导从减法文库的氨基酸序列 枝条值<10-4 被认为是代表已知基因或有偏 相似于已知基因。MIPS的数据库（。 德/ PROJ/ funcatDB）是用于定义功能类别的评价 序列。连续序列被使用的程序获得ContigExpress 软件（矢量NTI提前9.1.0，Invitrogen公司）。所有的表达序列标签 （个EST）序列，登录号在GenBank dbEST中 JZ494732-JZ494770。 2.6. Gene transcription analysis through RT-qPCR RT-qPCR的用在姬松茸尽头应该用针戳穿使用和不使用镉评估和比较基因表达。合成的cDNA使用上面所描述的 在SSH文库构建使用相同的真菌材料。所有实验wereperformed一式三份用RNA从至少三个不同的培养物，它也被用于在''2.2 RNA提取andSSH/ MOS''描述的SSH文库中分离。具体的引物组用于RT-qPCR的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与寡7软件（MBI，USA）。将cDNA稀释，并使用7500快速实时PCR系统（Applied Biosystems）和SYBR预混料前的Taq?（宝，大连放大， 中国）。相对 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线选择相对确定的方法 数量靶mRNA。扩增效率为标准曲线中计算得到通过使用StepOne软件V2.1（Applied Biosystems公司）。标准曲线 使用稀释系列的pMD19-T载体进行了计算个别个Unigenes 含有靶基因。在镉处理过的木耳与那些在未经处理的真菌相比，基因的相对表达水平进行了测定 基于与参考基因GAPDH的比较。因此，放大 的靶基因进行归一化与参照基因的扩增来 正确的放大变化。在RT-qPCR的分析中使用的引物组是 如表2所示。 3。结果 用减法的SSH结合MOS允许的高效和差异表达的转录快速克隆。使用 SSH和MOS管的组合，我们构建了正向消减 库代表的增强表达的基因 图。 1。该cDNA消减文库的效率测试。减法效率 通过分析目前在这两个GAPDH cDNA的产品量确定 消减cDNA和未消减cDNA，其周期18，23，28和33。泳道M， 分子标记（GeneRulerTM100 bp的DNA梯状条带加号），泳道1-4表示 ，消减样品在18，23，28和33周期分别为泳道5-8代表 未消减样品在18，23，28和33周期，分别为。在数字 图中左侧显示的kb（KB）的DNA大小标记。真菌姬松茸诱导镉暴露。减法的效率通过管家基因的PCR扩增进行评价，GAPDH 。我们观察到一个显着的降低放大减去的cDNA相对于未消减的cDNA （图1） ，由此表明该看家基因转录是有效的的抑制性消减杂交过程中减去。这结果证实了消减杂交效率和表现一个高质量的cDNA消减文库构造。