桔梗皂苷D对肺炎支原体增殖的抑制及其对抗肺炎支原体治疗后细胞生长的促进作用

桔梗皂苷D对肺炎支原体增殖的抑制及其对抗肺炎支原体治疗后细胞生长的促进作用 桔梗D是从桔梗根中提取的最重要单体之一，是已经被批准为第一批临床用于抗支原体肺炎的中药药剂。在中国每年用由黄芩和桔梗组成的芩百清肺浓缩丸进行治疗的临床病人有数千人。本研究以感染支原体肺炎的小鼠BALB/c和人肺II型上皮细胞系A549作为实验模型。通过实时定量PCR测定桔梗皂苷D的抗支原体肺炎效果，同时对感染支原体肺炎的小鼠模型，用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二甲基-4-吡咯烷酮（MTT）法和台盼蓝染色法测定含有苏木精和曙红的细胞的病理变化和生长恢复能力。 关键词：肺炎支原体，桔梗皂苷D，A549细胞，小鼠模型，细胞增长 由各种呼吸道感染引起的支原体肺炎在学龄儿童中非常常见。这会引起集体性肺炎或其他急性、慢性气管疾病(Waites and Talkington, 2004)。 由于肺炎支原体缺乏细胞壁，大多数抗生素包括青霉素在内，在治疗肺炎支原体方面并没有效果。大环内酯类药物仍然是治疗肺炎支原体感染的最有效的药物，因为它们有较强的抗菌性和抗炎性。大环内酯类抗菌作用机理是其可逆地结合到细菌核糖体的50S亚基的P位点后，导致多肽链延长和核糖体易位，从而抑制细菌蛋白质合成(Wikipedia, 2011)。 从黄芩和桔梗中提取出来的芩百清肺浓缩丸，是中国第一个临床用于治疗支原体肺炎的药物。 芩百清肺浓缩丸二期和三期试验，由八个GCP实验室选择653例患者跟踪6年进行的。未发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的数据结果显示，芩百清肺浓缩丸能够有效的治疗支原体肺炎，而无副作用和耐药性。早期的实验也证实了，当最小抑菌浓度MIC为100ug/ ml时，芩百清肺浓缩丸有较高的抗支原体肺炎疗效。芩百清肺浓缩丸可以改善上皮细胞中的EGF表达，防止由肺炎支原体引起的肺组织结构的损伤，有助于上皮修复和纤毛再生（Meng et al.，2012）。进一步的急性和慢性毒性实验表明芩百清肺浓缩丸是安全的。 因此，除了大环内酯类治疗肺炎衣原体感染外，还可以选择芩百清肺浓缩丸。 芩百清肺浓缩丸由黄芩和桔梗构成，已被用于治疗数千名中国患者。桔梗广泛用于治疗支气管炎，扁桃腺炎，喉炎，化脓性皮炎等炎性疾病。桔梗皂苷D是从桔梗的根中提取的，是芩百清肺浓缩丸庆菲微丸的单体之一。而桔梗被广泛用作中医药治疗各种疾病已数千年。最近的研究表明，桔梗皂苷D增强了MCF-7和MDA-MB-231细胞系中阿霉素的抗癌活性(Tang et al.,2014)，诱导细胞凋亡，并抑制细胞粘附，迁移和入侵肝细胞癌细胞(Li et al., 2014)。可以通过抑制NF-κB和STAT1和抑制TNF-α/IFN-γ诱导的TARC表达来缓解特应性皮炎样皮肤症状(Choi et al., 2014)。此外，桔梗皂苷D可以抑制IL-6和TNF-α的产生，从而治疗类风湿性关节炎（Kwon el al.，2014）。桔梗皂苷D也是杀精，避孕(Lu et al., 2013)和抗动脉粥样硬化作用（Wu et al.，2012）。据报道，桔梗皂苷D可以通过下调脂质积累来治疗肥胖（Lee et al.，2012），并将桔梗皂苷D鉴定为具有抗HCV的活性成分（Kim et al.，2013）。不过没有关于桔梗皂苷D抗肺炎支原体的报道。 本研究旨在研究桔梗皂苷D的抗肺炎支原体的效果及感染模型治疗后生物体内细胞的生长恢复情况。通过感染肺炎支原体的BALB/c小鼠和人肺II型上皮细胞系A549，证明桔梗皂苷D不仅可以体外抑制肺炎支原体，而且在体内也有相同的作用。我们的研究对桔梗皂苷D提出了深入的观点，这将阐明临床新药芩百清肺浓缩丸的主要药理作用。 材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 道德声明 本研究严格按照“黑龙江省实验动物护理指南”进行。 所有研究方案均经黑龙江中医药大学动物实验伦理委员会批准（许可证编号：[2011] 93号）。所有手术均在戊巴比妥钠麻醉下进行，并尽力减少痛苦。通过颈部脱位人性地处死小鼠。 材料 PPLO肉汤购于美国的BD。新鲜酵母购于中国天使酵母公司。 RPMI 1640培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司。肺炎支原体DNA定量诊断试剂盒购自中国大安基因。Trizol购自美国Ambion。6孔板购自美国康宁。桔梗皂苷D购自中国成都中草药有限公司。 桔梗皂苷D制备 桔梗皂苷D购自成都草药有限公司（20 mg，J-，HPLC≥98％）。用超纯水制备10mg/ml桔梗皂苷D溶液，保存在-20℃，备用。在使用时，将储备溶液用含有20％胎牛血清的PPLO培养基稀释。 肺炎支原体细胞培养 购自美国典型培养物保藏中心的肺炎支原体（ATCC 15531）在含有20％胎牛血清的PPLO-酵母提取物-葡萄糖-青霉素培养基中，37℃培养，106CCu肺炎支原体用于下面的实验。将A549细胞在含有10％胎牛血清和5％CO2的1640培养基中于37℃培养，每3-4天通过胰蛋白酶消化进行传代培养。 CCU 变色单位（CCU）：采用十倍稀释法测定原代培养基中肺炎支原体浓度。含有100ul肺炎支原体的1ml培养基稀释10倍。样品在37℃下孵育1周，一个ccu被定义为颜色变化稳定的第一个稀释物的倒数。 细胞感染 使用106ccu肺炎支原体悬浮液感染105个A549细胞4小时，然后去除培养液中未结合的肺炎支原体。将细胞分为对照（未感染细胞），模型（未经治疗的感染细胞）和处理组（用16ug/ml或32ug/ ml桔梗皂苷D处理3天的感染细胞）。在每组中定量肺炎支原体DNA。 动物感染 BALB/c小鼠（20±1g）购自吉林大学实验动物中心，并保存在稳定25℃，湿度60％的GLP室中。将小鼠随机分为对照组（未感染小鼠），模型组（用盐水处理的感染小鼠）和实验组（用桔梗皂苷 D处理的感染小鼠）（每组10只小鼠）。模型组和实验组用20ul 106 cc肺炎支原体接种3d，实验组小鼠每天灌胃5 mg/kg.d（低剂量）或10 mg/kg.d（高剂量）桔梗皂苷D 6天，同时对照组和模型组的小鼠给予等体积的盐水。从每组收集相同量肺匀浆用于肺炎支原体DNA定量。小鼠高剂量桔梗皂苷D的制备（10mg/kg.d）：5.1g桔梗/d（相当于人体服用芩百清肺浓缩丸的剂量）×1.5％（提取率）×0.0026×50。低剂量桔梗皂苷D（5mg/kg.d）的制备：1/2高剂量桔梗皂苷D。 最小抑制浓度（MIC） 采用双重稀释法测定桔梗皂苷D的MIC。如果桔梗皂苷D浓度达到MIC水平，肺炎支原体代谢将被抑制，样品颜色无变化。首先用128 ug/ml的桔梗皂苷D处理含有100 ul 106cc肺炎支原体的1ml培养基，混合物经过双重稀释使桔梗皂苷D的浓度从128至2ug/ml。对照培养基中的颜色从红色变为黄色后，收集所得混合物用实时定量PCR分析（BIOER, Line Gene 9600,China）。 MTT 采用MTT 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物测定法评估细胞增殖。将96孔板（4×103细胞/孔）中的感染细胞用16 ug/ml或32 ug/ml桔梗皂苷D持续处理3天，未感染细胞用2-512 ug/ml桔梗皂苷D处理3天。然后将所得细胞与0.5％MTT试剂在37℃下孵育4小时，然后用150 ul DMSO处理10分钟（Twentyman and Luscombe，1987）。使用Tecan Infinite M200 PRO酶标仪在490nm处测定吸光度。 实时定量PCR 肺炎支原体定量诊断试剂盒包括DNA提取试剂盒和扩增试剂盒（探针和引物），按说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行测定。即，将肺匀浆或3孔细胞与DNA提取物缓冲液，在100℃水中混合10分钟，然后将混合物以12000rpm离心5分钟。将上清液用于下列PCR反应。 PCR反应条件如下：在93℃初始变性2分钟，随后10个循环，93℃为45秒，55℃为1分钟，另外30个循环为93℃为30秒和55℃为45s。 生存细胞计数 测定对照组、模型组和实验组（分别为16 ug/ml和32 ug/ml的桔梗皂苷D组）存活细胞的数量。在各孔中加入等体积的台盼蓝染料，在光学显微镜下计数细胞。细胞浓度用下列公式计算：细胞数量/ ml =4个大方块细胞数量/ 4×稀释因子×104。 肺组织和细胞的病理学评估 A549细胞用10％福尔马林浸泡48小时，然后用苏木精和曙红（HE）染色。将固定的肺组织包埋在石蜡中，然后组织样品用HE染色，二甲苯和酒精水化后，切成5μm的载玻片。使用奥林巴斯显微镜（BX41-DP72）在20倍放大下进行显微镜分析。如前所述，数据存在于组织病理学炎症的评分系统中(Cimolai et al., 1992)。 统计分析 所有上述实验都进行重复。数据以平均值±SD表示，并用配对t检验进行分析。P <0.05被认为具有统计学意义。 结果 桔梗皂苷 D的细胞毒性作用 采用MTT法检测桔梗皂苷D的细胞毒作用。将细胞分为对照组和试验组，用2-512ug/ml桔梗皂苷D处理3天。 结果表明，在2-512ug/ml浓度范围内，桔梗皂苷D对细胞生长没有毒副作用。观察到桔梗皂苷D在2-128ug/ml时对细胞抑制率有微小变化，但是对照组和试验组之间的细胞抑制差异无统计学意义（P> 0.05）（图1）。 桔梗皂苷D的抗肺炎支原体特性 MIC 肺炎支原体在37℃下用2-128 ug/ml的桔梗皂苷D（连续双稀释）培养。红酚在对照组变成黄色时，才开始收集混合物。然后用实时定量PCR测定基因表达。肺炎支原体DNA定量诊断试剂盒的绝对 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的线性范围是103-108个基因组拷贝数/ ml。当细菌浓度超过108个基因组拷贝数/ ml时，定量结果为1010拷贝数/ml。桔梗皂苷D对肺炎支原体具有相当好的抑制能力，MIC为16ug/ml（图2）。我们的研究结果表明，桔梗皂苷D是肺炎支原体治疗的潜在候选者。 桔梗皂苷D对感染的A549细胞的抑制作用 收获感染肺炎支原体并用桔梗皂苷D处理的不同组中的A549细胞并对桔梗皂苷D的抗肺炎支原体感染效果进行分析。我们的研究结果表明，与模型组相比，用高剂量桔梗皂苷D的治疗组肺炎支原体数量少于用低剂量桔梗皂苷D处理的治疗组（图3）。 桔梗皂苷D对感染的BALB / c小鼠的抑制作用 采用荧光实时定量PCR技术分析低浓度或高剂量桔梗皂苷D处理的感染肺炎支原体BALB/c小鼠的DNA水平。我们的研究结果表明，与模型组相比，两组治疗组肺炎支原体数量的均有所降低，大剂量-桔梗皂苷D处理组下降最多（图4）。 抗肺炎支原体治疗后对细胞生长的影响。 治疗 感染的A549细胞中存活细胞量 除了在显微镜下以20倍放大的细胞成像方法之外，还采用台盼蓝染色法测量细胞量。与模型组相比，大剂量（32 ug/ml）和低剂量（16 ug/ml）桔梗皂苷D组的细胞数量均显著增加（图5）。 感染的A549细胞被桔梗皂苷D治疗后的生存能力 MTT检测法用于研究桔梗皂苷D对肺炎支原体感染A549细胞生长的影响。细胞增殖结果显示，处理组具有比模型组高的细胞生长，高剂量组具有最高的细胞生长（图6）。 A549细胞 的HE染色 感染的A549细胞HE染色结果显示，模型中细胞凋亡增加，细胞密度下降。此外，模型中还观察到细胞水肿变性，苍白细胞质，胞质内空泡和模糊细胞质边界。低剂量组细胞密度略有下降，细胞凋亡和细胞水解性变性增加，高剂量组与对照组相似（图7）。 肺组织的HE染色 对BALB/c小鼠的肺部分进行HE染色以评估其形态的变化。模型组HE染色评分高于治疗组。模型组观察到上皮细胞脱屑，血管周间隙增厚，肺泡壁塌陷，毛细血管充血过多。低剂量组的上皮细胞脱落，肺泡壁塌陷，毛细血管充血，血红细胞过多，但高剂量组（图8）则较轻。 讨论 桔梗是每年销量最高的40种中药材之一，广泛应用于各种疾病，具有免疫调节，抗炎，祛痰和抗氧化作用(Song and Qi, 2006)。其主要活性成分包括三萜皂苷，黄酮，酚类化合物和脂肪酸。其单体包括桔梗皂苷A，B，C，D，D2，D3和远志皂苷D，D2（Jin，2007）。 根据最近的一些研究，桔梗皂苷D有抗癌活性(Chun et al., 2013)，抗风湿关节炎和免疫调节(Kwon et al., 2014)和抗肥胖症(Lee et al., 2012)。据报道，桔梗皂苷D可以调节气道粘蛋白的产生和分泌，以预防炎症性疾病，这可能是桔梗被广泛作为祛痰药和治疗炎性肺部疾病的原因(Ryu et al., 2014)。 然而，桔梗皂苷D治疗肺炎支原体特性仍有待解释。我们的研究 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 第一次完整描述了桔梗皂苷D的这种活性。首先，在本研究中，通过MTT法测定了桔梗皂苷D的细胞毒性作用，证明其安全性，试验结果表明，浓度为512 ug/ml桔梗皂苷D对细胞生长没有细胞毒作用。观察到桔梗皂苷D在2-128ug/ ml时对细胞抑制率的微小变化，但对照组和试验组之间的细胞抑制差异无统计学意义。显微镜下细胞图像的结果进一步表明，对照组和治疗组之间在形态和量方面差异无统计学意义。其次，测定了桔梗皂苷D的MIC对抗肺炎支原体能力的影响，其中桔梗皂苷D的实际MIC测定为16 ug/ml。 芩百清肺浓缩丸是一种包括6种成分和辅助材料的化合物。在100 ug/ml芩百清肺浓缩丸中的桔梗皂苷D浓度远低于16 ug/ml。因此，我们的研究表明，芩百清肺浓缩丸不同成分的组合导致肺炎支原体增殖的抑制和抗肺炎支原体后细胞生长的促进。此外，在用低剂量或高剂量的桔梗皂苷D治疗后，测定了感染的培养细胞和动物肺炎支原体的DNA水平。直到现在，用于监测细胞或组织中肺炎支原体浓度的方法包括免疫荧光和PCR DNA测试方法。 在这些方法中PCR是实验室中最常用的(Ossewaarde et al., 1996; Tang et al., 2000)。在我们的研究中，采用实时定量PCR测定肺炎支原体DNA水平。我们的结果表明，模型组肺炎支原体DNA水平高于治疗组（低剂量和高剂量组）。在体外，与模型组相比，治疗组肺炎支原体的量有所下降；在感染的动物模型中，与模型组中肺炎支原体相比，低剂量组和高剂量组均观察到相同的结果。 上述结果在体外和体内均进一步证实，桔梗皂苷D对肺炎支原体增殖具有抑制作用。本研究的第二个目的是研究桔梗皂苷D对抗肺炎支原体治疗后，对感染的A549细胞和肺组织生长的影响。MTT用于测量抗肺炎支原体后的细胞生长。肺炎支原体治疗的结果显示，治疗组细胞增殖明显好于模型组。HE染色通常用于观察细胞或组织损伤。通过这种方法可以清楚地显示肺组织损伤，如上皮细胞脱屑，肺泡壁塌陷和毛细血管堵塞。细胞形态的变化，包括细胞凋亡，细胞水性变性，以及不明确的细胞质边界也可以用这种方式测量。不同组的细胞和肺的形态学变化见图5,6。结果表明，治疗组与模型组比，细胞或组织增殖更好。台盼蓝染色和MTT分析产生相同的结果。我们的研究表明，桔梗皂苷D不仅抑制肺炎支原体增殖，而且促进抗肺炎支原体处理后的细胞生长。肺炎支原体治疗也显示出相同的体内效果。我们的工作为今后中医药机制的探索工作奠定了坚实的基础。 致谢 这项工作得到了国家自然科学基金（81374045），黑龙江科技研究与开发应用项目（PC13S09），黑龙江自然科学基金（A201002），哈尔滨特殊技术人才研究项目（2014RFQYJ040）和科技专项项目为新药创造（2010ZX09101-104）。