第十章血脂及血浆脂蛋白检验.

第十章  血脂及血浆脂蛋白检验 教学目的： 掌握：高脂蛋白血症WHO分型法。 熟悉：血清外观 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了解：血清脂蛋白电泳分析；血清载脂蛋白A1和B100测定 重点：脂蛋白的分类及其主要功能；高脂血症的分型及血液生化特点。 难点：各种脂蛋白的代谢途径、高脂血症的发病机理。 教学方法和手段：课堂讲授为主，多媒体教学为辅，课堂提问突出重点。 授课时数：6学时 教学内容及组织： 第一节  概    述 一、血脂和血浆脂蛋白                与生化内容重复    自学 二、脂蛋白代谢紊乱 （一）高脂蛋白血症  血脂含量超过正常称为高脂血症，由于血脂均以血浆脂蛋白的形式存在，故也称为高脂蛋白血症。按发病原因分为两大类。 1.按表型分类  以Fredrickson（1967）分类法为基础，经WHO（1970）修订的分类系统，根据血清TC、TG、外观和脂蛋白电泳图谱，将其分为6型。 （1）Ⅰ型高脂蛋白血症 又称高乳糜微粒血症。是一种常染色体隐性遗传病。由于LPL缺损或LPL活化因子（ApoCⅡ）缺损所致。婴儿期即可发生，但罕见。其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清上层为奶油状，下层清亮。 ②血清TG↑↑，达11mmol/L以上，血清TC正常或轻度↑。 ③血清LPL活性↓。 ④血清脂蛋白电泳，CM↑↑。 （2）Ⅱa高脂蛋白血症 又称高β-脂蛋白血症或高胆固醇血症。属常染色体显性遗传，有明显的家族史。病因LPL受体缺损，杂合子型发生频率为1/500，纯合子型发生频率为1/100 000。其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观清亮透明。 ②血清TC↑↑，＞15.6mmol/L尤其是LDL-C↑↑，TG正常。 ③血清脂蛋白电泳，β-LP↑↑。 临床表现，中青年常伴有冠状动脉硬化，结局为心肌梗塞。 （3）Ⅱb型高脂蛋白血症  在Ⅱa型基础上伴有VLDL（高LDL+VLDL血症），病因不明。其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观清亮或微混。 ②血清TC↑，TG↑。 ③血清脂蛋白电泳，β-LP↑，preβ-LP↑。 （4）Ⅲ型高脂蛋白血症  又称宽β-脂蛋白血症。属常染色体显性遗传病，发病率1/10 000，病因，ApoE异常，与相应受体结合率↓。其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观混浊，后形成蜡样黄色薄膜。 ②血清TC↑，TG↑。 ③血清脂蛋白电泳，β-LP↑，preβ-LP↑，IDL↑。融合形成宽β区带。 临床表现，早期易发生动脉粥样硬化和冠心病。 （5）Ⅳ型高脂蛋白血症  又称高前β-脂蛋白血症或家族性高甘油三脂血症。属常染色体显性遗传病，较常见，我国原发性高脂蛋白血症中一半属于此型。病因，ApoA2异常。其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观混浊。 ②血清TG↑↑，TC正常或稍↑。 ③血清脂蛋白电泳，preβ-LP↑。 临床表现，多见于中年人易发生冠心病。 （6）Ⅴ型高脂蛋白血症  属常染色体显性遗传病，病因不详，可能由几种遗传缺陷所致，较罕见。生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清上层为奶油状，下层混浊。 ②血清TG↑↑，TC↑。 ③血清脂蛋白电泳，CM↑↑，preβ-LP↑。 2.按是否继发于全身性疾病分类  分为原发性和继发性高脂血症。常继发于糖尿病、肝病、肾病、肥胖以及过量饮酒，成人发病率为3%～5%。 3.高脂血症的基因分型法  一部分高脂血症患者存在单一或多个遗传基因的缺陷，具有明显的家族聚集性，有明显的遗传倾向。 （二）低脂蛋白血症  主要有四种类型 1. 低LDL血症  是一种常染色体显性遗传病，病因ApoB100低下，血浆LDL减少，TC↓。 2. 无LDL血症  罕见的常染色体隐性遗传病，病因ApoB100、B48缺损，血浆中无LDL，TC↓↓。 3. 低HDL血症  病因不详，血清TG↑，动脉粥样硬化、冠心病的发病率高。 4. 无HDL血症（Tangier病）罕见的常染色体隐性遗传病，ApoAⅠ、AⅡ缺损，血浆TC↓，HDL-C↓。 第二节  血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定 血脂测定方法很多，目前临床实验室基本检验项目有：血清外观分析，TC，TG，HDL-C，LDL-C测定。进一步可做HDL亚组分，IDL，Apo（如ApoAⅠ、ApoB100），Lp（a）及脂蛋白电泳，LPL，LCAT测定，为保证分析结果的可靠性，标本的采集应在餐后12h以上。 一、血清外观分析（血清冷置试验） 二、血清总胆固醇测定 胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素D3胆汁酸，并构成细胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。 TC测定方法很多，约200多种，分为化学测定法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）。 （一）.化学测定法  主要有两类 1. Liberman-Burchard反应  简称L-B反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆烷六烯磺酸。呈色稳定性差。 2. Zak反应  胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较L-B反应高7倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析。 （二）.酶法 胆固醇酯 胆固醇 ＋ 脂肪酸 胆固醇 ＋ O2 胆烷-4-烯-3酮 ＋H2O2 H2O2 ＋ 4AAP ＋酚 红色亚胺醌＋H2O  Trinder反应 试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活CEH，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放。 酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析，但也存在有一些不足，CEH对胆固醇水解不完全，表面活性剂影响CEH活性，黄疸血清中过高的胆红素可还原H2O2使结果偏低。 【正常参考值】3.10～5.70mmol/L 【临床意义】血清TC含量受年龄、性别、饮食和运动等因素的影响。 （1）20岁以上随年龄↑而↑，70岁以后则有下降趋势。 （2）20～40岁阶段男性高于女性，但女性绝经后则高于男性。 （3）城市人群高于农村人群，与饮食和运动有关。 （4）脑力劳动者高于体力劳动者。 病理性高胆固醇血症  原发性高胆固醇血症，糖尿病、胆道阻塞、肾病综合症、甲状腺功能减退。 病理性低胆固醇血症  严重贫血、甲亢、营养不良。 三、血清甘油三脂测定 TG是有一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于VLDL和CM中临床化学中往往以测定甘油代表TG的含量。TG的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法。但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中。临床实验室主要用化学法和酶法。 （一）化学法  各方法的基本步骤可归纳为四步 1.提取：甘油三脂的提取  采用合适的溶剂，使脂蛋白变性将TG提取，同时去除干扰物质（磷脂、游离甘油、葡萄糖等）常用方法有： （1）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土）吸附。 （2）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂。 （3）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代替正壬烷。应用较广。 2.皂化：甘油三脂的水解  一般都采用KOH乙醇或异丙醇溶液，60℃，5～15min可使TG完全水解。 3.氧化：甘油的氧化  最常用的氧化剂是HIO4，甘油在酸性条件下被氧化成甲醛、甲酸。反应受α-磷酸甘油、葡萄糖、丝氨酸的干扰，故抽提时应尽量除去此类物质的干扰。 4.显色：显色测定甲醛。常用方法有： （1）甲醛与变色酸（4.5-二羟-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物。（570nm） （2）甲醛与乙酰丙酮在氨的存在下缩合成黄色的3.5-二乙酰-1.4-二氢-2.6-二甲基吡啶。（420nm） （二）酶法  常用的有： 1.磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法）  使用最普遍 TG ＋H2O 甘油 ＋ FA 甘油 ＋ ATP 3-磷酸甘油 ＋ ADP 3-磷酸甘油 ＋ O2 磷酸二羟丙酮 ＋ H2O2 H2O2 ＋ 4-AAP ＋ 酚 红色亚胺醌 ＋ H2O 试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素C可消耗H2O2使结果偏低。 2.乳酸脱氢酶法（GK-PK-LDH 法） TG ＋ H2O 甘油 ＋ FA 甘油 ＋ ATP 3-磷酸甘油 ＋ ADP ADP ＋ 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP ＋ 丙酮酸 丙酮酸 ＋ NADH＋H+ 乳酸 ＋ NAD+ 3.甘油氧化酶法 第一步消除血清中原有的甘油： 游离甘油 ＋ O2 甘油醛 ＋ H2O2 H2O2 ＋ EMAE 无色物质 EMAE称N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。是一种还原剂，灵敏度比酚高。第二步测定甘油三脂水解释放的甘油： TG ＋H2O 甘油 ＋ FA 甘油 ＋ O2 甘油醛 ＋ H2O2 H2O2 ＋ 4-AAP ＋ EMAE 有色化合物 【正常参考值】0.56～1.70mmol/L 【临床意义】血清TG一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高。 1. 病理性增高  原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期。 2. 病理性降低  甲亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤。 四、血清高密度脂蛋白胆固醇测定 测定步骤包括①HDL的分离；②测定HDL中胆固醇。 HDL的分离方法有：超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法。临床实验室常用沉淀法。沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖- Mg2+、磷钨酸- Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。 如：磷钨酸- Mg2+选择性地沉淀血清中的LDL和VLDL，经离心上清液中保留HDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表HDL中的胆固醇。 【正常参考值】男 1.28±0.33mmol/L 女 1.37±0.33mmol/L 【临床意义】HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危险因素。 五、血清高密度脂蛋白亚组分胆固醇测定 HDL有三个亚类（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亚类与冠心病危险度的相关程度比总HDL-C更密切。 HDL2 d = 1.063～1.125g/ml        HDL3 d = 1.125～1.210g/ml 脂类60%  蛋白质40%          脂类45%  蛋白质55% 高密度脂蛋白亚组分的分析方法有超速离心法、柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、多价阴离子分级沉淀法。 其中多价阴离子分级沉淀法具有快速、经济、简便更为实用，是目前临床实验室最常用的方法。常用的沉淀剂有硫酸葡聚糖- Mg2+、聚乙二醇（PEG）。 原理：用PEG做沉淀剂，以不同浓度的PEG在不同pH条件下分别将VLDL和LDL（沉淀剂Ⅰ 95g/L PEG，Ph6.5）HDL2（沉淀剂Ⅱ 170g/L PEG，Ph7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀剂Ⅰ）和HDL3（沉淀剂Ⅱ），然后用酶法测定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C减去HDL3-C的差即为HDL2-C的含量。 【正常参考值】HDL2-C 男 0.53±0.17mmol/L 女 0.62±0.22mmol/L HDL3-C 男 0.75±0.17mmol/L 女 0.75±0.16mmol/L 六、血清载脂蛋白AⅠ及B测定 脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白（apolipoprotein，Apo），可分为A、B、C、D、E、F、G、H八类，其中ApoA，B，C还有亚类。 ApoAⅠ是HDL的主要蛋白质，占HDL蛋白质的85%左右，它的血清浓度可代表HDL水平，ApoB是LDL的主要蛋白质，占LDL蛋白质的97%左右，ApoB浓度主要反映LDL水平。 Apo的测定方法主要有三类：①.层析分离，然后再按一般蛋白质定量；②.电泳分离后经染色光密度扫描定量；③.各种免疫分析法。 层析法操作麻烦，一般只用于研究；电泳法简便灵敏，但各类Apo染色性能不一致，重复性不好；免疫法特异性好，灵敏度高，不需预先分离脂蛋白，适合临床实验室的应用，但需特异抗血清。 目前常用的免疫学方法有： 1.单向免疫扩散法（RID） 方法简单，但需时间长，灵敏度较低。 2.火箭免疫电泳法（IE） 比RID快速、灵敏，抗血清用量少。 3.免疫比浊法 测定抗原抗体复合物形成而产生的混浊，方法简便、快速，适合于自动分析仪，灵敏度高于火箭电泳法，免疫比浊法又分为：散射比浊法和透射比浊法。 4.酶联免疫吸附法（ELISA） 需制备指示酶与Apo或其抗体的交联物（现有商品化试剂盒）和酶标仪。 5.放射免疫法（RIA） 用核素标记抗原作为示踪物，灵敏度可达3～5μg。 6.荧光免疫分析法（FIA） 7.化学发光免疫法（CLIA） 免疫透射比浊法：是根据光线通过特异性抗原抗体免疫复合物溶液时被吸收和散射，使透射光减弱，减弱程度与免疫复合物含量成正比，即与抗原含量成正比。 【正常参考值】：Apo AⅠ 1.156±0.146g/L Apo B  0.745±0.147g/L 七、血清脂蛋白电泳 临床实验室常用的支持介质有醋酸纤维薄膜和琼脂糖凝胶。 （一）血清脂蛋白醋酸纤维薄膜电泳 以醋酸纤维薄膜为支持介质，血清脂蛋白经电泳分离，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不饱和脂肪酸的双键断裂生成醛，再用亚硫酸品红染色，即生成紫红色区带。 （二）血清脂蛋白预染琼脂糖电泳 血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，进行电泳分离，即可得到清晰的兰色区带。 凝胶浓度一般为0.5%，超过1%，β-Lp与preβ-Lp不易分开，＜0.5%，凝胶机械强度太低。 血清：染料为9：1，染料过多稀释标本，而且染料中乙醇会引起蛋白质变性，影响分离效果。 结果判断，直观区带的着色深浅，宽窄，用浅染，稍浅染，深染及消失加以描述；或用光密度扫描仪测定。 【正常参考值】：α-Lp 31.8%±5.3% β-Lp 53.1%±5.1% preβ-Lp 15.1%±4.1% CM （－）