RNAi（中文）

nullnull晶美生物工程有限公司1992年成立 总部：深圳 19个分支机构：遍布全国 研发中心：美国圣地亚哥 工厂培训基地：北京 产品：免疫学 分子生物学 细胞生物学 临床检验试剂 科研临床仪器 网址：www.jingmei.com null1995 Guo 和 Kemphues , 导入par-1基因的反义RNA链抑制目标基因的表达,正义RNA链为阴性对照 1998 Fire 和 Mello , 目标基因正义RNA链和反义RNA链的混合导入，单独正义RNA链或单独反义RNA链导入RNA干扰现象首先在线虫中发现nullRNA干扰和shRNA文库内容提要内容提要 RNA干扰的基本作用机制和应用 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 有效 siRNA的遵循原则及获得siRNA的方法 shRNA文库 怎样有效地向细胞内递呈siRNA nullRNA干扰的基本作用机制和应用nullRNA 干扰 ( RNAi ) RNA干扰是双链RNA特异性抑制具有相应互补碱基序列的基因表达的机制。机体细胞通过该机制特异性切割降解目的基因转录体或抑制目的基因蛋白质表达以防御外来有害转座子或病毒的入侵siRNA( 小分子干扰RNA) 小分子干扰RNA是3‘端带有两个突出UU，大小约19~23bp的双链RNA，是RNA干扰通路上最重要的作用中介nullnulldsRNASynthetic siRNA duplexHairpin constructPre-miRNARNA干扰技术的应用RNA干扰技术的应用 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 基因功能 评估药物靶 解析细胞信号传导通路 制定基因治疗方案 nullRNA干扰技术与信号转导研究阻断特异性更强www.upstate.comnullRNA干扰技术与信号转导研究阻断特异性更强pKD Mammalian siRNA Expression Plasmids>长期目的基因沉默 >19bp 特异序列, 9bp loop环的信息资料和购买者共享 >Q-RT-PCR 或 western blot进行质控 结构： Human H1 promotor ,RNA polymerase III 一个基因多个质粒分别针对不同区域的序列 提供 Empty pKD plasmid 提供 pKD-NegCon-v1 siRNA plasmid 作为阴性对照，一样的backbone, 插入的序列和人基因无互补 null设计有效 siRNA的遵循原则 及获得siRNA的方法设计有效 siRNA的遵循原则 设计有效 siRNA的遵循原则 序列大小 19-21nt ，最好以A或G开始 当长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活，会引起非特异的基因表达抑制这种抑制是通过以下两种途径之一进行的：失活 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 起始因子eIF2a翻译抑制诱导细胞凋亡激活RNase L非特异的RNA降解 选取目的基因起始密码子下游100bp和终止密码子上游100bp之间的序列 设计2~4个序列, BLAST 比对基因序列以确保序列设计的特异性 优先选择 GC 含量30-50%的序列 设计适当的阴性对照序列 null随机变更特异性siRNA中的碱基排列顺序，且行BLAST基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6) ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6) 在特异性siRNA引入1~2个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG mismatch T and A设计适当的阴性对照序列获得siRNA的方法获得siRNA的方法1 化学合成siRNA 2 体外转录获取siRNA 3 利用Dicer或 RNaseⅢ切割长的dsRNA成siRNA 4 依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA 5 通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNAnull建议： 最适需要大量siRNA的实验，且确定基因沉寂效果好。 不宜筛选最佳siRNA序列及长期基因沉寂研究。1 化学合成siRNA特点： 即用型 纯度高 合成量不受限 能被标记 价格从 Proligo定购 siRNA从 Proligo定购 siRNA高质量，高纯度，可直接用于转染 可提供序列标记和修饰: fluorescein，biotin, phosphate PAGE 或 RP-HPLC 纯化 www.proligo.comnull特点 操作简单 经济实惠 产量 建议 筛选最佳siRNA序列。 不宜长期基因沉寂研究或需要大量siRNA的研究。2 体外转录获取siRNAnullnull特点 无需检测或筛选多个siRNA序列 多种 siRNAs 混合体，保证有效的目的基因沉默 理论上潜在的非特异性基因沉默效应建议 快速、经济地实现目的基因沉默 不能确定起效的单个siRNA序列及长期基因沉寂研究 3 利用Dicer或 RNaseⅢ切割长的dsRNA成siRNAnullnullGene Therapy SystemsDicer siRNA generation 试剂盒 包括体外转录和纯化试剂 可在24孔板上作50次转染实验 可产生多达5个目的基因的沉默null特点 RNA polymerase III (pol III)启动子介导发夹结构siRNA在哺乳细胞中表达 唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法，抗性标志可用于建立稳定转染的细胞株或一定程度富集已成功转染的细胞 病毒载体解决转染效率低下的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 建议 长期基因沉寂研究 不宜最佳siRNA序列的筛选4 依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNAnullpsiRNA- The Champion of Gene Knocckout www.invivogen.compsiRNA™ system psiRNA™ G2 cloning E.coli GT116 strain Sequencing primers E. coli Fast-Media® null特点 siRNA表达框架（SECs）包括RNA pol III 启动子、表达siRNA发夹结构的序列和RNA pol III 终止子 几次PCR循环获取SECs后可直接导入细胞，操作简单方便 . 建议 筛选最佳siRNA序列 针对细胞筛选最适RNA pol III 启动子以构建质粒载体 克隆SECs入质粒载体后可用于长期基因沉寂研究5 通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNAnull几个巧妙的引物设计，几次PCR反应获得完整的siRNA表达框架（SECs）nullMirus Corporation>siXpress PCR Vector System >Label it siRNA Tracker intracellular Localization kit >TransIT-LT1 for DNA >TransIT-TKO for siRNAnull方法 优势结合您的实验目的或研究设计选择恰当的获取siRNA方法1 化学合成siRNA 2 体外转录获取siRNA 3 利用Dicer或 RNaseⅢ切割长的dsRNA成siRNA 4 依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA 5 通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA即用型 筛选最佳siRNA序列 无需检测或筛选多个siRNA序列 长期基因沉寂研究 筛选最佳siRNA序列和 针对细胞筛选最适RNA pol III 启动子RNA干扰方法总结null 还有更简单、更方便的方法吗？ 不要我设计序列就能保证有效的RNA干扰该多好啊！null 来自世界分子生物学权威 美国冷泉港 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 的厚礼Expression Arrest™ shRNA文库2004年3月30日，Open Biosystems公司发售nullA resource for large-scale RNA-interference-based screens in mammals Nature 428, 427 - 431 (25 March 2004)Gene silencing by RNA interference (RNAi) in mammalian cells using small interfering RNAs (siRNAs) and short hairpin RNAs (shRNAs) has become a valuable genetic tool. Here, we report the construction and application of a shRNA expression library targeting 9,610 human and 5,563 mouse genes. This library is presently composed of about 28,000 sequence-verified shRNA expression cassettes contained within multi-functional vectors, which permit shRNA cassettes to be packaged in retroviruses, tracked in mixed cell populations by means of DNA 'bar codes', and shuttled to customized vectors by bacterial mating. In order to validate the library, we used a genetic screen designed to report defects in human proteasome function. Our results suggest that our large-scale RNAi library can be used in specific, genetic applications in mammals, and will become a valuable resource for gene analysis and discovery.nullshRNA作用机理null》CSHL的Dr. Hannon设计、合成、测序并克隆了上千个小分子发夹RNA 》总共包括人和小鼠的上千个基因，以有疾病治疗等应用前景的基因为主（激酶，磷酸酶） 》每个基因包括1-4个shRNA克隆 》通过普通转染或者病毒介导（腺病毒或逆转录病毒）进入细胞。可以构建稳定转染细胞系，持久抑制目标基因表达。 》网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需耗时耗力的siRNA设计、合成和验证过程。 Expression Arrest™ Human & Mouse Short Hairpin RNA(shRNA)Libraries nullnull>遵循实验、经验及文献中总结出来的规则 >优化的发夹结构形态 >至少有和非靶基因错配的3个硷基 >有多聚酶的转录终止密码(4T),保证精确转录终止 New cutting edge design based on the human miR-30 microRNA. null siRNA和 shRNA的比较nullFigure 7. Customer validation. The target is an RNA transcribing a transmembrane protein. Transfected cells are stained with a polyclonal antibody to the protein of interest and visualized with FITC secondary antibody 72 and 96 hours post transfection. All cells are counterstained with DAPI. The cells transfected with shRNA to the gene of interest show almost no expression of the transmembrane protein (Panel B - 96 hours) compared with the untransfected or irrelevant shRNA controls (Panel A). nullhttp://www.openbiosystem.com/human_shRNA_data.xlsnull怎样购买?nullnullnull该文库正在发展壮大，将来的文库能包括目前所有证实的人和小鼠基因，且每个基因包括6-10个shRNA克隆。 null果蝇 RNAi 文库 RDM1189 - Drosophila RNAi Collection RDM1190 - Individual RNAi Constructs null包括7,000 DNA序列，可以直接用来体外转译产生RNA。 该文库中的dsDNA覆盖果蝇基因组的50％以上。 对于每个基因，均采用特异性引物扩增其外显子序列（约300-600个碱基）。 DmRNAi结构包括两个T7启动子，无RNase，可直接用于体外转译研究。 提供的dsDNA在一次体外转录反应就可以产生ug级的dsRNA，260/280的比值在1.8以上。 果蝇RNAi文库nullRDM1189 - Drosophila RNAi Collection由一套可以直接用于体外转录的DNA 模板组成,包括7000 DNA序列,该文库中的dsDNA覆盖果蝇基因组的50％以上。 以96孔PCR板的形式提供，干冰运输 每孔有10ulDNA，足以进行3~5次体外转录，产生1~3 ugRNA, 260/280的比值在1.8以上。 null标记 siRNA 设置转染阳性对照(EGFP siRNA) 选用表达siRNA的病毒载体 选用专门的siRNA转染试剂 稳定转染或短时间抗性筛选以富集转染细胞???您的转染效率是否足够好？ 是否真实反映siRNA的基因沉默效应呢Delivery of Rhodamine-labeled siRNADelivery of Rhodamine-labeled siRNAFluorescence microscopy 3 hours after delivery of labeled siRNAHL-60THP-1Amaxa’s nucelofector for transfection’s high effecinecynulljetSI™-Fluo• jetSI-FluoF • siRNA 50 nM24 h after transfection• jetSI-FluoR • siRNA 50 nMA549 cellsHeLa cellssiRNA Test KitsiRNA Test KitDownregulation of maxGFP in Jurkat cells after 24hWithout siRNA maxGFP siRNA Up to 75% knock-down!Kit principle: co-transfection of pmaxGFP and siRNA against maxGFP from QIAGEN easy analysis via microscopy nullIntroducing jetSilencing kits for control RNA interference experimentsjetSilencing control kits 2 nmoles of lyophilized positive siRNA duplexes 2 nmoles of lyophilized negative control siRNA duplexes 0.4 ml of jetSI™-ENDO transfection reagent 1 ml of RNase-free water to resuspend siRNAs Kit componentsnulljetSI™ : the best transfection reagent for transgene silencing jetSI™-ENDO : the powerful siRNA transfection reagent Fluorescent jetSI™ transfection reagents  Fluorescent jetSI™-ENDO transfection reagents      www.polyplus-transfection.comnullThe cell-type specific NucleofectorTM kits can be used with both siRNA Oligonucleotides and siRNA vectors in combination with the NucleofectorTM devicewww.amaxa.com A innovative gene transfer technology NucleofectorTM Gene Transfer Straight Into the NucleusnullMirus Corporation >Label it siRNA Tracker intracellular Localization kit >TransIT-TKO for siRNA Effectively transfer siRNA into cellsnull 进行成功的RNA干扰实验应该注意的几点 进行成功的RNA干扰实验应该注意的几点 针对每个待沉默的目的基因设计2~4个siRNA序列 保证待转染的细胞生长状态良好 确保高效转染 实验中设置适当的阳性对照和阴性对照 null晶美生物竭诚为大家提供以下核糖核酸干扰技术的相关试剂 0. Openbiosystem的shRNA文库 GTS公司的Dicer siRNA合成试剂盒 2. UPSTATE公司的siRNA/siAbTM试剂盒 3. Orbigen即用型siRNA寡聚体及siRNA转染试剂RNAi-ShuttleTM 4. Invivogen公司的psiRNA质粒、 LyoVec冻干粉式转染试剂和siRNA设计在线服务 5. Proligo公司的siRNA合成及标记服务 6. Amaxa 公司的NucleofectorTM技术在RNAi研究中的应用 7. Mirus公司的siXpress PCR vector systems 、siRNA labeling and delivery system 8. Polyplus-transfection公司的jetSI™ 、 jetSI™-ENDO 、 Fluorescent jetSI™ nullWelcome to www.jingmei.com to download electronic copies for relative newsletters null感谢大家的时间和倾听