高效液相色谱

null第六章 高效液相色谱第六章 高效液相色谱null现代高效液相色谱法的特点：三高 (1)高压：高效液相色谱法工作压力高达20MPa~30MPa。 (2)高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。 (3)高效：一般气相色谱法的色谱往是数千塔板／米，高效液相色谱法的塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高。 (4)高灵敏度：紫外光度检测器的检测限可达10－9g，荧光检测器的灵敏度可达10－11g 。一、HPLC与经典LC区别一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测 2．HPLC：分离和分析 柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形,均匀装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测二、HPLC与GC差别二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 相对分子质量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%null2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）null教学内容  1. 液相色谱仪的组成和各系统的工作原理 2. 液相色谱柱的分离原理 3. 液相色谱的类型 重点与难点 1. 高效液相色谱与气相色谱的异同点 2. 高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用 3. 分离柱和流动相的选择和匹配 4. 不同种类液相色谱分离的原理上的差异null教学目标 1. 掌握液相色谱分离的工作原理 2. 了解液相色谱仪器各个系统的组成以及工作原理 3. 熟练掌握液相色谱中的反向和正相色谱的分离原理和工作条件 4. 了解各种液相色谱分离方法以及色谱柱的工作原理 5. 掌握液相色谱分离分析中的定性和定量方法null对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素： 1.涡流扩散项 同GC法 2.纵向扩散项 在LC中可略,GC中重要； 3.传质阻力项：a.固定相传质阻力项； b.流动相传质阻力项. 柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展. a.柱前展宽：主要由进样所引起； b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小。 null影响色谱峰扩展的因素 第二节 高效液相色谱第二节 高效液相色谱 2.1 液相色谱的特点 2.2 液相色谱仪的部件 2.3 液相色谱的流动相和固定相 2.4 离子交换色谱 2.5 离子对色谱 2.6 体积排阻色谱 2.7 亲和色谱 null液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph （HPLC）（1）HPLC（2）HPLC（2）高效液相色谱法的特点 Feature of HPLC高效液相色谱法的特点 Feature of HPLC特点：高压、高效、高速 应用：高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 及主要部件 process and main assembly of HPLC流程及主要部件 process and main assembly of HPLC流程三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图null 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 第二节 反相键合相色谱第二节 反相键合相色谱1．分离机制：疏溶剂理论 2．固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）null3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈， 许多反相高效液相色谱的分离要求使用一定pH的缓冲溶液，缓冲溶液中盐的浓度要适当的高，这样可避免出现不对称的峰和分叉的峰。所选择的缓冲溶液应具有以下一些性能：     (1) 在pH=2～8之间要有大的缓冲容量；     (2) 能透过检测器使用的光波；     (3) 能和有机溶剂相溶；     (4) 能促进平衡速度的提高；     (5) 可以掩蔽吸附剂 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面上的硅醇基。 null4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ k=C固 / C流 5．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）第三节 正相键合相色谱第三节 正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力 2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3．流动相：极性小 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 为了洗脱极性较强的溶质，往基础溶剂中加入极性溶剂，如二氯甲烷，短链醇，四氢呋喃等。 null4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱 6．适用： 主要应用于分离甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸以及其他有机物。化学键合固定相化学键合固定相化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； (3) 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （5）有利于梯度洗脱； 不易流失、热稳定性好存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；液液色谱固定相液液色谱固定相 1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；流动相类别流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。流动相选择流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。（5）低粘度。高粘度溶剂，会增高压力，不利分离。常用的低粘度溶剂有如丙酮等。但粘度过于低的易形成气泡，影响分离。如戊烷、乙醚等。null 为了测定邻氨基苯酚中微量杂质苯胺，现有下列固定相：硅胶，ODS键合相，流动相有：水-甲醇，异丙醚-己烷，应选用哪种固定相，流动相？为什么？ 邻氨基苯酚中微量杂质苯胺测定,为了良好分离,应让苯胺先出峰,由于苯胺的极性小于邻氨基苯酚,因此应采用正相色谱法,选用硅胶为固定相,异丙醚-己烷为流动相.null色谱分离条件选择 减小柱内展宽，提高柱效 （1）固定相：①粒度小，均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力；②改进结构，采用大孔径和浅孔道的表面多孔型载体或全多孔微粒型载体，减少滞留流动相传质阻力。 （2）流动相：选用低粘度的流动相，有利于增大组分在溶剂中的扩散系数Dm，减少传质阻力。 （3）流速：从H-U曲线可知，HPLC的最佳流速在流速很小处，减少流速有利于提高柱效，但为加快分析速度，常采用比最佳流速高数倍的流速。 （4）柱温：提高柱温，可降低流动相粘度，减少传质阻力，但柱温升高将使分辨率降低，柱寿命短，易产生气泡，一般在室温下进行。null色谱分离条件选择 柱外展宽(又称“柱外效应”) 指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起的色谱峰展宽，柱效下降。可分为： （1）柱前展宽：主要由进样引起，减小进样器的死体积，用阀门进样可减少柱前谱带展宽，提高柱效。 （2）柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间等因素所引起。因此，用短而内径细的接管，减少流通池体积，改进检测器和 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 系统的响应速度等都是克服柱后展宽的途径。null 简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谱带扩宽，提高柱效？ 液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质及柱外效应。     在液相色谱中要减少谱带扩宽，提高柱效，要减少填料颗粒直径，减小填料孔穴深度，提高装填的均匀性，采用低黏度溶剂作流动相，流速尽可能低，同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。 液-固吸附色谱固定相液-固吸附色谱固定相固定相：固体吸附剂，如极性的硅胶（应用最广） 、氧化铝等，结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10 μm； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。1. 硅胶（SiO2·H2O）1. 硅胶（SiO2·H2O）结构：内部——硅氧交联结构→多孔结构 表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱null2. 氧化铝 碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质3. 聚酰胺 氢键作用 氢键能力↑强，组分越后出柱 （三）吸附剂和流动相的选择： 依据被测组分、吸附剂和流动相的性质（三）吸附剂和流动相的选择： 依据被测组分、吸附剂和流动相的性质1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸，醇 2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相null4. 三者关系图示： 组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性null应用： 分离极性不同的试样 分离含极性基团相同但数目不同的试样 分离异构体nullHPLC的应用 application of HPLC 1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。null2. 稠环芳烃的分析 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 ①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 ②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 ③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 ④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 高效液相色谱法的特点及应用 高效液相色谱法的特点及应用 HPLC应用远广于气相色谱法。广泛用于石油化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品检验及法学检验等领域。 一. 在食品分析中的应用 1．食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸、有机胺、矿物质等； 2．食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等； 3.食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。 二. 在环境分析中的应用 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等。 三. 在生命科学中的应用 生物化学家和医学家在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具。 1. 低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。 2. 高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。 四. 在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测： 1. 合成药物：抗生素、抗忧郁药物、黄胺类药等。 2. 天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等 五．在无机分析中的应用: 阳、阴离子的分析等。 第四节 离子交换色谱 第四节 离子交换色谱 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 固定相：离子交换树脂的分类： 按性能可分为七类阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、鳌合树脂、大孔树脂、氧化还原树脂、萃淋树脂和纤维交换剂。 离子交换树脂为具有网状结构的高聚物，在水、碱或酸中难溶，对化学试剂具有一定的稳定性，对热也较稳定。 现在研究最多：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂(根据同离子性质分）； null固定相：苯乙烯-二乙烯苯聚合物 硅胶键合相（柱效高、耐压、PH受限制） 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 影响因子：PH（溶质电离、调分离度） 离子强度 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。null 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 离子价态越高，对离子交换树脂的亲和力越强。因此保留时间随离子电荷数的增加而增加。 对电荷数相同的离子，随离子半径增加，保留时间增长。 淋洗液的酸碱度会影响多价离子的解离平衡，即改变离子的价态形式，因此也会影响离子的洗脱顺序。null判断磷酸根离子与硫酸根出峰顺序？为什么？ 磷酸根离子有时出峰在硫酸根离子之前，有时出峰在其后？ 磷酸根出峰情况的差异主要与磷酸根的电离性质有关。磷酸根是三元酸，其三个电离常数差异很大，因此在不同的pH条件下，可以呈现出不同的价态。在不同的淋洗液条件下，磷酸根的保留差异很大。     采用碳酸钠/碳酸氢钠作为淋洗液，磷酸根主要是呈一价或二价形态，其保留时间一般在硝酸根和硫酸根之间；但如果采用氢氧化钠作为淋洗液，磷酸根的保留时间往往比硫酸根还要长。类似这种情况的离子比较少，只有在多价态离子时才可能出现，可通过调节磷酸根的pH值来调节磷酸根的保留值，提高与其他离子的分离选择性。null 传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； （2）由于淋洗液为离子型水溶液，如不加抑制地任其通过电导池，势必造成很高的背景电导，这会使样品离子所产生的微小信号难以被识别。因此必需抑制本底电导，我们采用电化学自动再生抑制器。 第五节 离子色谱第五节 离子色谱 利用色谱技术测定离子型物质的方法 色谱 : 用于分析的一种分离技术 离子型物质 : 在水溶液中电离，具有 + 或 – 电荷的元素 阴离子：Ｃl－，ＮO2－，SO４２－，ＣrO４２－ 阳离子：Ｎa＋，ＮH４＋，Ｃa２＋，Ｆe３＋null电导检测器 测定溶液流过电导池电极时的电导率 可检测大部分离子型化合物null电力　　 　 冷却水 / HPW 锅炉蒸汽中的杂质 食品 / 饮料　　 酒 / 饮料/ 糖果 饮料中有机酸 造纸. /纸浆 　纸浆液・处理水　 　　 张纸和液体中的离子农业　 　　 肥料 /土壤 / 植物 /等 　　　 土壤中离子 医学　　 　　　血液 / 尿　　　　　　　　　　 　　 尿中草酸 化妆品 化妆品 / 清洁剂/ 洗发液　 　化妆品液体中的阴离子 制药 化学 / 液体　　　　 　　 化学品中的重金属应用领域领域环境. / 污染 雨水/河水/ 大气/ 污水 雨水中离子 城市用水　 　　 自来水 / 水源　　　　 　　　 自来水中消毒副产物样品应用化学品 　　 设备提取物 / 聚合物　 　 环氧类粘合剂中的阴离子 电子 / 半导体　 高纯水・ 晶片冲洗水　　　 　高纯水中的离子型杂质 金属 / 钢材　 　 　 表面处理液・镀 槽 ・冷却水 电镀 槽中的抗坏血酸 　 离子色谱仪离子色谱仪离子色谱法原理离子色谱法原理 离子交换原理，与传统离子交换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；离子色谱装置类型 离子色谱装置类型 抑制型： 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05毫摩尔/克干树脂。非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。null抑制器 安装在电导池之前 提高待测离子的电导率： 提高灵敏度 Na+,　Cl-　　　　　　H+,　Cl- 降低背景电导 (淋洗液) : 减少噪音 Na+,　HCO3-　　　　　　H2CO3Na+,　OH-　　　　　H2Onull离子色谱仪器淋洗液 泵色谱柱检测器 泵液分离 检测 记录进样阀抑制器检测池进样null不同的操作者都可得到好的样品分析重现性 经过稀释、过滤后可以测定多种样品　　　　　　　　　　　　　 　 多价态可氧化元素（NO2- & NO3-, SO32-&SO42- etc.）, 不同价态离子（Fe3+ & Fe2+,　Cr3+ & Cr6+ etc.） 可单独测定某种离子.（通常为同时测定)离子色谱具有以下优点离子色谱具有以下优点（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱离子色谱的应用 离子色谱的应用 阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm), 流动相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50 ppm。离子对色谱 离子对色谱 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。1. 反相离子对色谱法（IPC或PIC） 1. 反相离子对色谱法（IPC或PIC） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离 1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→分析酸 2）影响k的因素 a．与m的极性有关（同反相色谱） b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ 3）适用：较强的有机酸、碱2．反相离子抑制色谱2．反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质——加入酸HAc tR↑，k↑ 碱性物质——加入碱NH3·H2O tR↑，k↑ 调节pH范围：3.0~8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物第七节 体积排阻色谱 第七节 体积排阻色谱 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。null凝胶色谱法的应用特点 ★保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物 ★保留时间短，色谱峰窄，容易检测 ★固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长 ★不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离亲和色谱(AC) 亲和色谱(AC) 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较色谱分离方法的选择 色谱分离方法的选择 要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。null一、相对分子质量 null★★★溶于非水溶性溶剂(如己烷、异辛烷、苯、甲苯等烃类)的试样，可选用液-固吸附色谱法;溶于二氯甲烷或三氮甲烷的试祥，选用常规的液-液色谱(正相色谱)法和吸附色谱法； ★★★★溶于甲醇等溶剂的试样，则可以用反相液-液色谱法进行分离与分析。二、溶解度 ★能迅速溶于水的样品，可采用反相液-液色谱法； ★★若试样全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液，表示试样属于离子型化合物，可采用离子交换色谱法来分离；三、化学结构三、化学结构 液—固吸附色谱适用于异构体分离； 液—液分配色谱可用于同系物分离； 含有离子基团和能电离基团的组分，可采用离子交换色谱分离； 生物大分子或高分子聚合物可用凝胶色谱分离。 null制备型液相色谱 preparative liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 ～ 30cm），一次制备量０.1～１mg；1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。null2. 液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。 null3. 制备型液相色谱 制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。高效液相色谱思考题高效液相色谱思考题1 液相色谱在分离原理和操作条件上与气相色谱有什么不同？ 2 液相色谱根据分离原理通常分为几类？ 3 什么是正相液相色谱、反相液相色谱？ 4 体积排阻色谱的原理是什么？出峰次序如何？null3.2.2 改善色谱分离选择性的方法 （1）调节流动相的极性 （2）向流动相中加入改性剂 ①离子抑制法 ②离子强度调节法 3.2.3 流动相的选择 吸附色谱、分配、离子、凝胶色谱等 3.2.3.1液固吸附色谱：样品与洗脱剂的极性一致。 3.2.3.2液液分配色谱：流动相和固定相极性不同。 正相键合相色谱法：键合固定相的极性大于流动相的极性。用于分离异构体和极性化合物。 反相键合相色谱法：键合固定相的极性小于流动相的极性，分离非极性物质，其应用范围更广泛。 null高效液相色谱的色谱柱 当一支填充很好的色谱柱，填料的粒径又比较小，其固定相的膜厚df 也很小时，D=0；B/u一项也很小，     如果色谱柱填充不好，如填料颗粒之间不均匀、不密实，就会使Ce，Cm增加，从而使涡流扩散项A的增加，导致柱效下降，所以色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。现代高效液相色谱填料多使用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。 使用小粒径填料，其dp值小（如5μm，3μm）可以使柱效大幅度提高。 null在研究制定一个HPLC方法时， 选择适宜的流动相是很重要的内容