液相色谱质谱联用仪Aglient 1100 LCMSD VL（上海交通大学）

nullnull§1 Aglient LC/MSD的系统概述 §2 质谱基础与相关术语 §3 电离影响因素与溶液化学 §4 进样之前的准备工作 §5 数据采集液相色谱/质谱联用仪 Aglient 1100 LC/MSD VL§1 Aglient LC/MSD的系统概述§1 Aglient LC/MSD的系统概述一、该仪器的介绍 1、液相部分型号： Aglient 1100， 包括五个部分：真空脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱和紫外检测器。 液相部分是VWD紫外检测器；紫外波长是190－400nm，可见光波长是400－760nm。 2、质谱型号： LC/MSD VL 质谱部分是单四极杆检测器（型号：G1956A）。.§1 Aglient LC/MSD的系统概述§1 Aglient LC/MSD的系统概述二、该液质仪可以解决什么问题 1、对未知的样品进行分子量的测定。 2、对已知分子量的样品进行定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 3、可测分子量范围是：50-1500道尔顿。 .质谱分析示意图离子输送离子分析离子检测真 空质谱分析示意图样品汽化离子化离子源液相进样系统质量分析器§1 Aglient LC/MSD的系统概述 §1 Aglient LC/MSD的系统概述§1 Aglient LC/MSD的系统概述三、质谱的限制 1.样品必须离子化 →离子化的化合物才能被移动、控制和质量分析 2.必须具有一定的真空 →离子飞行的平均自由程需最大化 →理论上，真空度越大越好 3.测量离子的质量数 →即质荷比（m/z） §1 Aglient LC/MSD的系统概述 §1 Aglient LC/MSD的系统概述 四、 离子化的模式 1、电喷雾电离(ESI或API-ES)： 其电离过程通过电场产生带电液滴，样品离子通过离子蒸发后做质谱分析。电喷雾过程有三步：喷雾和带电、去溶剂、离子蒸发。 适用于分子量大、极性强的有机化合物，如蛋白质、糖、肽等。 离子在样品及流动相中已经形成。化合物无需有挥发性，高电场将样品离子气化。是分析热不稳定化合物的首选方法。 ESI离子化方式占90％以上。 §1 Aglient LC/MSD的系统概述 §1 Aglient LC/MSD的系统概述 2、大气压化学电离 (APCI)： 离子在气态下形成，生成单电荷离子，溶剂相当于反应气将样品离子化。有电晕针，高压放电使空气中中性分子电离，产生H3O+ ， N2 +,， O +等离子，这些离子与样品反应使样品分子离子化。 化合物需有一定的挥发性且是热稳定的化合物。 APCI适用于中等极性或极性弱的化合物，如：酯类、酮类等。 APCI 是ESI的补充 ，其质谱中很少有碎片离子，主要产生准分子离子，分析的化合物分子量一般小于1000Da. APCI 比ESI多了两个部件：蒸发室和电晕针。 §1 Aglient LC/MSD的系统概述 §1 Aglient LC/MSD的系统概述 五、本仪器离子化的模式： 复合源Multimode Ion Source（MM-ES+APCI） 对复杂样品的离子化效果比较好。 1、ESI-only（单独采集ESI模式下的数据）。 2、APCI-only （单独采集APCI模式下的数据）。 3、ESI+APCI （采集ESI和APCI共同作用模式 下的数据） null六、 离子化的选择示意图ESI分子量200,00015,0001,000非极性APCI极性 七、离子化方法的指导方针 七、离子化方法的指导方针是化合物有极性吗?化合物热稳定吗?化合物是酸、碱或是中性?APCI or APPI不是ESI中性碱性酸性ESI (正谱)ESI (负谱)APCI不 §2 质谱基础与相关术语 §2 质谱基础与相关术语一、质谱常用术语 1、分子离子：易碎裂而产生广义的碎片离子。 2、准分子离子：阳离子加合离子或阴离子加合离子。 如：〔 M+H〕+ , 〔M+Na〕+,〔M+K〕+ , 〔 M-H〕- 。一般看到的是准分子离子峰。 3、碎片离子：分子离子裂解生成碎片离子。 4、奇电子离子和偶电子离子。 5、多电荷离子：蛋白质与多肽会产生多电荷离子。 6、同位素离子 你得到的是哪一类的数据？ ESI或APCI模式下的单电荷离子苯基丁氮酮（Phenylbutazone）的API-ES 谱图 其实际质量是308。你得到的是哪一类的数据？ ESI或APCI模式下的单电荷离子基峰: 谱图中最强的离子309[M+H]+* ESI模式下的单电荷离子，人造酐，实际质量是1131.7-23，是基峰，准分子离子峰。 Ginsenoside ESI模式下的单电荷离子，人造酐，实际质量是1131.7-23，是基峰，准分子离子峰。 *ESI模式下的单电荷离子，碎片离子ESI模式下的单电荷离子，碎片离子从加钠峰（m/z 1131.7）所得的碎片离子* §2 质谱基础与相关术语 §2 质谱基础与相关术语二、质谱图相关概念 1、三维数据组：时间、质荷比、信号强度 2、UV色谱图是时间与信号强度 3、Scan所得到的TIC总离子流色谱图是时间与信号 强度。 4、 SIM 选择离子监测，得到的是时间与信号 强度。 5、质谱棒棒图是质荷比与信号强度 6、EIC(提取离子流色谱图)是在数据采集后数据分析时生 成的，寻找目标峰，准确定量。 质谱图的类型质谱图的类型Profile 轮廓图Centroid 棒状图AbundAbundm/zm/zthreshold* §2 质谱基础与相关术语 §2 质谱基础与相关术语三、质谱图的解释 1、检测到的离子种类依赖于溶剂添加剂和分析所用 的条件。 2、正离子检测： 流动相 〔 M+H〕+ , 酸性条件 〔M+Na〕+,〔M+K〕+ 有盐时 〔M+NH4〕+ 有铵盐缓冲溶液 〔M+X〕+ X=溶剂或缓冲溶液中的阳离子 〔 2M+H〕+ , 在高浓度时形成的二聚体 §2 质谱基础与相关术语 §2 质谱基础与相关术语 3、负离子检测： 流动相 〔 M-H〕- , 碱性条件 〔M+X〕- , X=溶剂或缓冲溶液中的阴离子 〔 M-H+S〕+ , 溶剂添加剂 §3 电离影响因素与溶液化学§3 电离影响因素与溶液化学一、电喷雾电离－－必须考虑的 1、样品 在溶液中为离子态：儿茶酚胺、季胺 有可诱导电离的化合物 2、溶液化学参数 － 流速、样品的pKa、溶液的pH、溶液的导电性。 3、应避免的样品 － 非极性样品 §3 电离影响因素与溶液化学 §3 电离影响因素与溶液化学二、电喷雾电离－－离子形成的必要步骤 步骤一：溶液中的电离 步骤二：喷雾 步骤三：去溶剂 步骤四：离子从溶液中解吸 §3 电离影响因素与溶液化学 §3 电离影响因素与溶液化学 三、影响电喷雾离子化的因素 1、溶液的化学性质 流动相：溶液pH、溶液的导电性、流速 被分析物 ：浓度、pKa（酸度系数，离解常数） 、 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面活性 2、高电压电极 注意：不要用洗衣粉等表面活性剂清洗样品瓶，会残留污染样品。可以用高锰酸钾清洗再用纯水清洗。 §3 电离影响因素与溶液化学§3 电离影响因素与溶液化学四、电喷雾电离下pH影响 正常pH在2-8，增加pH会降低灵敏度，会减少多电荷离子中的电荷数目。 随着pH增加，离子数会越来越少。 蛋白、多肽这种生物大分子在酸性条件下易离子化。 §3 电离影响因素与溶液化学§3 电离影响因素与溶液化学五、大气压化学电离APCI－－必须考虑的 与ESI相比，APCI对于流动相、流速或添加剂的依赖性小。主要是溶 剂的选择，一般APCI用甲醇+水做溶剂。 1、样品 不含酸性和碱性位点的化合物：醇、醛酮和酯。 分子量和极性中等的化合物：脂肪酸，邻苯二甲酸酯类。 电喷雾响应不好的样品。 2、应避免的样品 － 在气化过程中热不稳定的化合物 §3 电离影响因素与溶液化学§3 电离影响因素与溶液化学六、离子源的选择 ESI APCI 离子在溶液中已经生成 离子在气态条件中生成 化合物无需具有挥发性 化合物需具有一定的挥发性 是分析热不稳定化合物的首选 化合物必须是热稳定的 除了生成单电荷的离子之外 只生成生成单电荷的离子 还可以生成多电荷的离子 §3 电离影响因素与溶液化学§3 电离影响因素与溶液化学七、溶剂的选择 1、常用的溶剂有：超纯水、进口的色谱纯的甲醇和乙睛。尽可能不用乙睛。 2、流动相中可能加有添加剂，目的是调节流动相的pH值。建议用挥发性的添加剂：甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵。 3、如果这些常规的溶剂能满足你分析的需要，可不考虑其他溶剂。 §3 电离影响因素与溶液化学§3 电离影响因素与溶液化学八、LCMS添加剂 1、在流动相中添加缓冲液或无机盐，主要是调节pH值，有时是为了改变峰形。常用：乙酸、甲酸、甲酸铵和乙酸铵。 2、 LCMS中调节流动酸性常用的酸是甲酸： 3、LCMS中调节流动碱性常用的碱是氨水。 4、尽可能不用这三种盐：硼酸盐、硫酸盐、磷酸盐 5、通过分流阀，进质谱的流速保证在0.2-0.3ml/min之间。 6、在ESI中影响添加剂选择的主要因素是离子配对和挥发性。 7、在APCI中影响添加剂选择的主要因素是挥发性。 §3 电离影响因素与溶液化学§3 电离影响因素与溶液化学九、离子检测模式的选择 1、正离子检测模式 适合于碱性样品，酸性流动相。用得比较多的是酸性流动相的正离子 检测模式，碱性流动相用得少对仪器和柱子的损害较大。 2、负离子检测模式 适合于酸性样品，中性偏碱性流动相。 3、可正、可负离子检测模式 可以用正离子检测模式也可以用负离子检测模式，比较灵敏度，再确定是用正离子检测模式还是负离子检测模式。 非挥发性缓冲剂的影响非挥发性缓冲剂的影响10 mM 磷酸钠/35% 甲醇 ESI, 1 hr @ 0.2 mL/min. 对轴喷雾直角 ESI §4 进样之前的准备工作 §4 进样之前的准备工作一、查阅文献： 1、查阅文献，了解样品的极性与分子量的范围，如何离子化（ESI、APCI），怎样采集（正离子、负离子模式）？ 2、选择流动相。甲醇和水（比例？）；还是乙睛和水（比例？）。 3、每一个离子源都有适当的参数设置。雾化气压力、干燥气流速、干燥气温度、蒸发室温度、毛细管电压、电晕针电流和放电电压。 4、选好液相部分紫外检测器的检测波长：紫外波长是190－400nm，可见光波长是400－760nm。 5、样品浓度建议在100纳克/毫升至20微克/毫升之间。 §4 进样之前的准备工作 §4 进样之前的准备工作二、进样之前的准备工作： 1、脱除溶剂中的气体 一个溶剂瓶一个溶剂瓶脱气，先打开脱气阀，用流量 3ml/min，约5分钟，可见管路中气体排出，再脱另一个溶剂瓶，脱完气之后先调低流量至0.5ml/min再关push阀。 2、冲洗液相与质谱管路 一个溶剂瓶一个溶剂瓶冲管路，用流量 1ml/min，约10分钟，设好质谱管路的流向去废液瓶。 3、平衡柱子系统 装上柱子，接通进质谱的管子，流量调至0.5ml/min，平衡系统20分钟。溶剂在三通阀处一根进液相废液瓶，一根进质谱废液瓶。 §5 数据采集 §5 数据采集 一、数据采集 两种采集数据方式：Scan和SIM 该MS在set up MSD Singal时有两种扫描方式：Scan全扫描和SIM选择离子监测。 1、Scan全扫描 采集数据在指定的范围内从高质量到低质量的扫描。 用于测定分子量，识别未知化合物和检验峰纯度。 Scan得到的是总离子流色谱图（TIC) 总离子流色谱图（TIC)：是将每一个采样点所对应的质谱图 上所有离子丰度的加和与扫描时间一一对应作图产生的。 总离子流色谱图上每一个采样点都对应一张质谱图。 §5 数据采集 §5 数据采集 一、数据采集 2、SIM选择离子监测 SIM主要用于已知化合物的定量分析。 对于SIM 定量，可以对每个色谱峰选择一个定量离子。这个离子应该丰度高且唯一。 应用精确质量，不要用名义质量（例如195.2而不用195）。该MS精确至小数点后一位。 当不能确定195.2是最强信号，可以选定三个离子195.1，195.2，195.3，比较这三个离子的强度，强度最大的即是真实的分子量。 §5 数据采集§5 数据采集二、采集参数方法的设置 1、要建立一个新方法，在chemstantion offline状态的Method and Run 视图中编辑方法。 2、方法是：从MSD图标进入，选择Set up MSD Signal。 3、然后从MSD图标进入选择Spray Chamber进行复合源参数的设置。 4、Method Spray Chamber:选MM-ES+APCI 5、Set up MSD 的信号时可以选离子源ESI，或APCI，如果吃不准用什么离子源也可以同时选ESI＋APCI。复合源（Multimode Source）的优点是对复杂样品的离子化效果比较好，但是不如单独的ESI，或APCI源效果好。 Access to Acquisition ParametersAccess to Acquisition ParametersClick on the Module Diagram§5 数据采集§5 数据采集二、采集参数方法的设置 6、再从VWD图标进入,设置紫外检测器参数（主要是检测波长）。 7、从柱温箱图标进入，选择柱子两端的温度，也可以不控 制柱温。 8、从进样器图标进入，选择流动相的流速、比例。进质谱的流速必须小于0.5ml/min。 9、最后设定方法名称。保存该方法。 10、在chemstantion online状态的调用该方法。 11、在chemstantion online状态下，点击样品瓶编辑样品信息。然后就可以开始进样采集数据。注意进样量在20微升以下，系统默认是5微升。 Access Parameters from the Instrument MenuAccess Parameters from the Instrument Menu§5 数据采集§5 数据采集三、从MSD图标设置Set up MSD Signal注意点： 1、□Use MSD。选择该对话框时MSD被用作检测器，这个对话框中的其他参数将会被执行。未选择时MSD保持在standby状态，不会被作为检测器。 2、Stop Time □。质谱停止采集的时间。一般设为As pump:与泵所设的停止时间一致。或选时间则达到指定时间将自动停止采集数据。 3、Fragmentor值与化合物性质有关。碎裂器电压范围在50到200V之间。碎裂器电压值是MS必须优化的数值。一般来说分子量大碰撞电压也要大。但是太大会产生较多的碎片离子。 质谱信号设置面板 (SL Shown)质谱信号设置面板 (SL Shown)Same settings as current LC/MSDAcquire up to 4 signals with optional signal descriptionSpecify the % of time spent collecting each signalMode and polarity set for each signalTurn each signal on/off as desiredSpecify an optimal fragmentor value for each SIM ion适用于多重信号采集§5 数据采集§5 数据采集四、MS雾化室参数设置说明 1、干燥气流速Dry Gas Flow (l/min):APCI通常为4，ESI通常为8-10， 最大是13。 2、雾化气压力Nebulizer Pressure (psig):最大为60，APCI选60，ESI与流速有关，流速0.2-0.4ml/min选20-30，流速0.4-0.8ml/min选30-45，流速大于0.8ml/min选45-60。 3、干燥气温度Dry Gas Temperature (℃):300-350，通常在300 ℃以上。与流动相和流速有关，水相比较多或高流速时要求较高的温度。 4、蒸发室温度Vaporizer Temperature (℃):通常为350 ℃。与溶剂和流速有关，高流速时要求较高的蒸发温度。只对APCI激活。 最高为500 ℃。 5、毛细管电压Capillary Voltage (V):最高为6000V 对复合源来说无论正模式 还是负模式 都选2000 6、电晕针电流Corona Current(uA):只对APCI激活，对正模式通常为4.0 uA、对负模式通常为25uA。 7、放电电压Charging Voltage (V):只有复合源才有此参数，通常为2000。 喷雾室对话框喷雾室对话框对复合源只能选MM-ES+APCI电喷雾喷雾室设置电喷雾喷雾室设置大气压电离-电喷雾电离源 API-Electrospray Ion Source大气压电离-电喷雾电离源 API-Electrospray Ion SourceHigh Voltage Mesh AssemblyAPCI 喷雾室的设置APCI 喷雾室的设置HPLC 流速 >500L/min 雾化气压力 60 psig 干燥气温度 start with 350 C 干燥气流速 4 L/min 气化温度 随 FIA调节 帽电压 随 FIA调节 (2000-6000) 开始 2500 V 电晕电流 随 FIA调节 开始 25 µA (neg) 或 4 µA (pos)APCI Ion SourceAPCI Ion Source电晕针§5 数据采集§5 数据采集五、采集数据注意点 1、判断实验过程是否正常，检查系统压力（显示在进样器图标上），在100bar以下正常，否则停止操作，检查原因。 2、在online状态下，图标黄色代表仪器正在自检；图标绿色代表仪器可以使用了；图标兰色代表仪器正在使用。图标红色代表仪器出现问题必须停止使用，检查原因。 3、在offline状态下，可以实时查看数据。可以看到总离子流图（SCAN）或SIM,液相色谱图，利用快捷键可以看到质谱图查到m/z。