人破骨细胞的原代培养和生物学特性

人破骨细胞的原代培养和生物学特性 马伟光 周 树夏 刘宝林 张 第四军医大学口腔医学院 郁 吴军正 西安 , 维持骨体积是骨吸收与骨形成相对平衡的 结果 , 如失去这种稳定 , 则发生病理性变化 , 骨吸收破坏是主要现象之一 , 但关于骨吸收机 理还不清楚 。 近些年来随着骨细胞培养技术的 发展 , 使人们对骨吸收有了进一步认识 , 目前 公认破骨细胞是骨吸收作用的主要承担者 。 为 此 , 大多 数学 数学高考答题卡模板高考数学答题卡模板三年级数学混合运算测试卷数学作业设计案例新人教版八年级上数学教学计划 者从破骨细胞入手 , 对破骨细胞 的结构和功能等进行研究 。 目前已从多种动物 骨组织中分离出破骨细胞 ’一“ 〕。 本实验 是通过 建立人的破骨细胞分离 、 培养 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 , 为进一步 开展骨吸收机理的研究奠定基础 。 材 料 与 方 法 次 。 然后浸炮于含有 卜加 青霉 素 、 林 链 霉素、 达克宁终浓 度为 的 培养液中 , 一 ℃ 保存 、 备用 。 三 、 破骨细胞的培养 将骨片置入孔径 的培养板中 , 每孔加 破骨细胞悬液 。 置培养箱中 , 在 , 、 ℃、 饱和湿 度条件下 , 培养 分钟 。 取出骨片 , 在 培养 液中荡洗 , 以洗掉未贴附于骨片上的细胞 。 然后 , 更 换培养板 , 每孔再加人 培 养 液 含 缓冲液 、 灭活胎牛血清 、 协 青霉素、 卜 链霉素 , 继续培养 。 另取 个灭菌的玻璃培养皿 容量 , 放入玻 片 , 滴加破骨细胞悬液 , 孵 育 小时后 再加 培养液 , 放入孵育箱中培 养 小时 。 一 、 破 细胞的分离 个月的引产胎儿 , 消 毒后 取 股 骨 、 胫骨 、 脓 骨 , 置入无血清 ”培养液玻璃培养皿中。 将附着的 软组织 、 骨膜以及干髓端的软骨部分去净 。 留下的骨 干部分用 培养液清洗干净 , 再 置 入 培养 液中 含有 缓冲液 , 灭活胎 牛血清 , 卜 青霉素 , 卜 链霉 素 , 纵向 将骨干剖开 , 用手术刀搔刮骨髓腔 , 然后 , 用吸管吸 取培养液反复冲洗骨片 , 使附着于骨片上的细胞冲入 培养液中。 静置 秒钟 , 使碎骨片沉降 , 吸取细胞悬 液 , 离心 分钟 , 弃去 上清 液 , 再加入 培养液 , 制成细胞悬液备用 。 用 台盼蓝染色 , 活细胞率达 以上 。 二 、 骨片的制备 取健康人股骨的皮质骨 因创伤致死 , 去净软骨 组织和骨膜 。 沿骨纵轴用低速骨锯 , 在冷水降温下切 割成 、 厚约 骨片 , 金刚砂轮磨成 林厚的薄骨片 。 用打孔器制成 直径 的 圆 形 骨片 , 再用手术刀在其表面划土 的 方 格 。 置入 灭菌蒸馏水中 , 用超声波清洗器清洗 分钟 , 换液三 鉴定方法与结果 一 、 倒皿光相差显微镜观察 破骨细 胞形态 学观察 破骨细胞培养 小时后 , 附着于盖玻片上 , 可见 散在 的胞 体大 、 外形不规则 , 胞浆有多个伪足样突起 , ℃恒温下 , 固定视野 , 定时观察 , 可见细胞 外形不断变化 。 从其细胞体积及外形与其它类 型细胞有明显区别 。 噬骨观察 当破骨细胞与骨片共同培养 小时后 , 骨 片上出现骨吸收陷窝 , 开始时多为圆形 , 随着 培养时间的延长 , 骨吸收陷窝逐渐扩大 , 呈多 环形 、 沟状或不规则形 , 由于骨吸收陷窝受折 射线的影响 , 在镜下往往比正常骨区更明亮 。 二 、 染色 破骨细胞体积大 , 含有 一 个细胞核不 等 , 细胞核呈圆形或椭圆 形 , 每 个 核有 一 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 细 胞 生 物 学 杂 志 年 一一一一—一 一一 —一一 一 一 — 一 个核仁 。 三 、 甲笨胶蓝染色 样品 用 戊二醛固定 分钟 , 蒸馏水冲 洗 , 再 置入 甲苯 胺 蓝 液 中 秒钟 , 冲 洗 , 甘油封片 , 光镜下观察 , 可见核染为深蓝 色的多核细胞 , 核呈圆形 , 大小均匀呈环状排 列 , 胞浆中有大小不等的空泡 。 四 、 吸性确酸醉反应 采用 的方法 。 结果显示 胞核不着 色 , 胞浆存在浓密的棕黑 色颗粒 , 分布均匀 , 愈接近核周 的胞浆着色愈浓密呈波环形 , 为酸 性磷酸酶阳性反应 。 作为 对照 的纤 维样 细胞 等 , 月包浆仅有极少量的浅棕色颗粒或几乎不着 色 , 为阳性反应 图版图 。 五 、 扫描 电子显微镜观察 破骨细胞 与骨片共同培养一周时 , 将骨片 取 出 。 组 个骨片用 一 处 理 分钟 消化骨片上附着生长的细胞 。 组不经消化细胞处理 。 然后 , 将上述两么牙骨片 用 戊二醛 ℃下 固 定 小 时 , 冲洗 , 饿酸后固定 小时 , 逐级乙醇 脱水各 分钟 , 乙晴置换后 , 真空干燥 , 喷镀 白金 。 日立 一 型扫描 电镜下观察 , 加速 电 压 。 电镜下所见 , 组 , 破骨细胞附着于骨片 表面 , 粗大的胞突尖端下方骨面有不规则的骨 吸收区 , 呈虫蚀状 , 骨胶原暴露 图版 , 图 。 组 , 光滑的骨面上 散在 有多 个圆 形 、 多环 形 、 犁地状等形态不 同 、 大小不等的骨吸收陷 窝 图版图 。 这些骨吸收陷窝与正常骨结构 的哈佛氏系统以及骨细胞陷窝有明显区别 。 骨 吸收陷窝底为粗糙的骨胶原 , 而正常窝 、 管状 骨结构均为钙化一致的光滑表面 。 讨 论 自从 等 〔 〕建立 破骨 细胞 的分 离 、 培养技术以来 , 目前 已从多种实验动物体 内分离出破骨细胞 , 其分离方法亦有不断的改 进 。 本实验是综合 〔‘ 和 的方 法 。 经过多次摸索 , 首次从胎儿的长骨中分离 出破骨细胞 , 进行培养 。 为人的破骨细胞功能 的体外研究 , 奠定了基础 。 目前多数学者认为 破骨细胞来源于骨骼 外的生 血系统 , 其前驱细胞属造血干细胞的初 始 单核细胞 , 而这些单核细胞 融合 成破 骨 细 胞 。 因而 , 破骨细胞胞休大 , 多个核 , 一个破 骨细胞所含的细胞核数可多达数 个【 , 。 破骨细胞胞浆中含有丰富的酸性磷酸酶 , 是其主要特征之一 。 因此 , 酸性磷酸酶染色被 做为鉴定破骨细胞的主要手段 。 破骨细胞还含 有丰富的杭酒石 酸 磷酸 酶 , , ‘仑是酸性 磷酸酶 的一种同功酶 , 而且更具有特异性 。 此外 , 破 骨细胞中还 含有溶酶 体酶 , 芳 香基 硫 酸脂酶 、 组织蛋 白酶 、 葡萄糖醛 酸酶 日一 和 卜甘 油磷 酸脂酶侈一 , 标 定 位 实验 证明 , 这些酶存在于粗面 内质网和高尔基氏体 中 。 一旦破骨细胞形成封闭的骨吸收间隙 , 则 分泌多种溶酶和离子造成局部的酸环境 , 使矿 物质酸蚀溶解 , 暴露出骨夕质 , 胶原纤维又经 酶作用 , 使之分解 , 发生骨吸收“ , “ 〕。 破骨细胞的噬骨功能是其独有的特性 , 通 过观察到的骨吸收陷窝 , 可 以证明 , 破骨细胞 具有吸收骨盐 、 骨胶原 、 骨基质等所有骨的组 成成分的能力 。 而其他细胞则没有这种能力 , 这是鉴别破骨细胞最客观的方法 。 在实验中我 们还发现 , 破骨细胞的骨吸收与移行是独立的 过程 , 成排行 多个圆形或卵圆形的骨吸收陷窝 之间以及破骨细胞与骨吸收陷 窝之 间 互 不连 续 。 这种现象提示 , 破骨细胞的骨吸收活动主 要发生在细胞移行过程中的间歇期 , 而移行时 骨吸收作用较弱 。 这种现象与相差显微镜下 小时定时观察 , 破骨细胞的伪足活动时而静止 、 时而运动的行为相符合 , 说明破骨细胞的噬骨 活动是间歇性的 , 而且并不是所有贴附着于骨 面上的破骨细胞在培养中都发生骨吸收作用 。 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 竿 卷第 期 细 胞 生 物 学 杂 志 一一 一 , , , , 曰 口 价 护 , 一一 一 , 月 叫 加 门 , , 口 口 , 勺 一 一一一 妇 由此看来 , 破骨细胞的功能活动是复杂的 , 还 受着全身和局部因素的影响 , 而且与其他细胞 如成骨细胞等存在着相互作用〔 , 这些均需做 进一步的研究 。 通过分离 、 培养人破骨细胞的实验 , 我们 体会人破骨细胞培养成活较动物更难 , 对培养 条件要求高 , 我们认为 培养液 , 更利于破骨细胞生长 。 将其与骨片共伺培养 , 出现骨吸收比兔破骨细胞晚 一 天 。 原因之 一可能是从取材到培养经时比较 一 长 , 破骨细胞 的活性受到影响 , 如将分离的人破骨细胞先培 养 天 , 再做噬骨实 验效果 更好 。 在 本 实验 中 , 培养了 天的人破 骨细胞仍有 骨吸收功 能 。 说明此方法分离培养的人破骨细胞 , 可供 骨吸收机理的体外研究 。 今 考 文 献 〔 〕 , , , ”已 云 , 一 〔 〕 曲 , , , 以 亡 , 一 。 〔 〕 , , , 柞 , 一 。 〔 〕 , , , 瓦 艺, 一 。 〔 , , , 炸 , 一 〕 , , , , 一 。 〔 〕 , , , , 一 。 〔 〕 , , , 日 , 一 。 〔 〕 , , , ‘ , 一 涎腺腺样囊性瘤多种癌基因 的表达 赵 文川 章魁华 马大权 王 洪 君 北京医科大学 口腔医学院 马大龙二 。。记 等从人膀胧癌细胞株成功地克隆 分离出 一 一 癌基因的开创 性工 作使分子 生物学和遗传工程学技术开始应用于人类肿瘤 研究 「‘’。 细胞癌基因激活和异常表达的研究加 深了对细胞癌变的根本原因的认识 。 有关人癌 基因异常表达的报道 日渐增多 , 人们企望从中 发现人癌基因异常表达的规律 , 以指导肿瘤的 预防 、 诊断和治疗 。 涎腺腺样囊性癌 。 一 , 是一种严重 危害人类健康的恶性肿瘤 , 虽生长缓慢 , 但有 较强的浸润性和转移力 。 为了揭示其特殊生物 学行为的来源 , 我们选择了 已有文献报道的与 肿瘤浸润 、 生长和转移表型有关 的癌 基因 、 一 、 一 、 一 、 一 进行 吕人 细胞 、 口腔鳞癌细胞和 胃腺 癌细胞 的 原位杂交 。 材 料 与 方 法 癌细胞取 自本院外 科实 验室 年从 人小 涎腺 和舌鳞癌组织选育的 一 、 一 细胞株 分别为 代和 代 及北京肿 瘤 研究所王乃勤研 究员惠赠的胃腺癌细胞株 。 癌基 因 一 、 一 、 一 、 一 、 一 探 针 购 于华 美公司 , 碱性磷酸酶原位杂交显示盒和过氧化物酶显 示盒分别购于 公司和 公司 , 由桂林制药厂惠赠 , 其他均为核酸研究和一般试验室 试剂 。 细班片制备 将对数生长期癌细胞消化并轻吹 打成的细胞悬液接种于放有盖片的六孔 板或宽 口培养 , 现在夫津市肿瘤医院土作 , 邮编 。。。 。。 。 北京医科大学免疫学教研室 。 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 马伟光等图版 尸 , 欲 , 甲下 ‘ 、 舟 ‘ · 卜 图 版 说 明 培养的人破骨细胞酸性 磷酸酶反应阳性 , 纤维样细胞呈阴性 反应 。 光镜 倍 破骨细胞附着骨片上 , 伪足 突起尖端下方骨面有骨吸收区 箭头 示 。 扫描电镜 倍 破骨细胞性骨吸收陷窝 , 陷 窝底为暴露的骨胶原纤维 。 扫描电镜 。。倍 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net