微生物培养

微 生 物 学 实 验 讲 义 内蒙古科技大学数理与生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院 自治区基础生物实验示范中心 基础生物教学部 2009 年 10 月 - 1 - 目 录 实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒 实验二 普通光学显微镜的使用 实验三 革兰氏染色法 实验四 显微镜直接计数法 实验五 微生物接种技术 实验六 细菌简单染色法 实验七 酸乳中乳酸菌的测定 实验八 水中细菌总数的测定 实验九 细菌总 DNA 的提取 实验十 微生物菌种保藏 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 实验十一 微生物遗传实验----抗药性突变株的分离 实验十二 大肠杆菌生长曲线的测定 实验十三 霉菌的形态观察 实验十四 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定 实验十五 新型污水处理絮凝剂——生物絮凝剂的制备 - 2 - 实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 1、了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤； 2、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。 3、学习高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养 物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生 物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普 通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以 可供微生物生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方 法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到 1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到 121℃，经 15～30min，可全部杀死锅内物品上的各 种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可 应用此法灭菌。 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅 隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭 排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高至高 于 100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水 分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低,二是湿热的穿透力比干热 大；三是湿热的蒸汽有潜热存在,每1克水在100℃时,由气态变为液态时可放出2．26kJ(千 焦)的热量。这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气 的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽 的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用 1．05kg /cm2,121．3℃ 15—30 分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的 温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用 - 3 - 0．56kg/cm2(8 磅/英寸 2),112．6℃灭菌 15 分钟,但为了保证效果,可将其他成分先行 121．3 ℃,20 分钟灭菌,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 1．05kg/cm2,121．3℃灭菌 20 分钟即可,而盛于大瓶内的培养基最好以 1．05kg/cm2灭菌 30 分钟。 蒸汽压力所用单位为kg/cm2(千克/厘米2) 实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。 三、试剂与器材 （一）器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽 灭菌锅、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注 射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 （二）试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验流程 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。 五、实验步骤 （一）培养基的制备 1、 称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中（琼脂不要加入）。牛 肉膏要用玻璃棒挑取，放在小烧杯或 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面皿中称量，或用称量纸，称量后直接放入水中。 蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 另外，称药晶时严防药晶混杂，一把牛角匙用于 一种药晶，或称取一种药晶后，洗净．擦干，再称取另一药晶．瓶盖也不要盖错．蛋白 胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2、 溶解 用量筒取一定量(约占总量的 1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热， 并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配 方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其 它原料，待完全溶化后，补足水分。 3、 调节 pH 根据培养基对 pH 的要求，用 5%NaOH 或 5%HC1 溶液调至所需 pH。测定 pH 可用 pH 试纸或酸度计等。 4、 融化琼脂 - 4 - 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直 至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基 溢出或烧焦。 5、 分装 分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度 以试管高度的 1/4 左右为宜。固体分装装量为管高的 1/5，半固体分装试管一般以试管 高度的 1/3 为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 6、 包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培 养基名称，制备组别和姓名、日期等。 7、 灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为 121℃20min， 以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养 基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的 1/2 为宜；半固体培 养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。 8、 倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到 45～50℃,立刻倒平板 （二）高压灭菌操作步骤 1．首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为 宜。 2．放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭 菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3．加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同 时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。 4．接通电源,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽 后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时, 控制热源,维持压力至所需时间。本实验用 1．05kg/cm2,121．3℃,20 分钟灭菌。 5．灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压 力降至 0 时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。如果压力未降到 0 时,打开排 气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或 试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。 6．将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24小时,经检查若无杂菌生长,即可待用。 六、实验结果 检查培养基灭菌是否彻底。 - 5 - 七、关键步骤及注意事项 1、要严格按配方配制。 2、调 pH 不要过头。 3、高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 4、过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清 洗保存。 八、思考 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的? 2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3、培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4、培养基的配制原则是什么? 5、高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽？ 6、灭菌完毕后,为什么要待压力降到 0 时才能打开排气阀,开盖取物？ 7、在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全的因素？ 附件：微生物各种细菌培养基的配置方法： （一）细菌培养基 配方一 牛肉膏琼脂培养基 牛肉膏 0.3 克 蛋白胨 1.0 克 氯化钠 0.5 克 琼脂 1.5 克 水 1000 毫升 在烧杯内加水 100 毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后， 放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶 解后补足失水，用 10%盐酸或 10%的氢氧化钠调整pH值到 7.2～7.6,分装在各个试管里， 加棉花塞，用高压蒸汽灭菌 20 分钟。 配方二 马铃薯培养基 取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250 克，用刀细细剁成肉末后，加入 500 毫升蒸馏水和 5 克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖 2 小时。过滤，滤出的肉末干燥处 理，滤液pH值调到 7.5 左右。每支试管内加入 10 毫升肉汤和少量碎末状的干牛心，灭 菌，备用。 配方三 根瘤菌培养基 葡萄糖 10 克 磷酸氢二钾 0.5 克 碳酸钙 3 克 硫酸镁 0.2 克 - 6 - 酵母粉 0.4 克 琼脂 20 克 水 1000 毫升 1%结晶紫溶液 1 毫升 先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭菌，备用。 （二）放线菌培养基 配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉 2 克 硝酸钾 0.1 克 磷酸氢二钾 0.05 克 氯化钠 0.05 克 硫酸镁 0.05 克 硫酸亚铁 0.001 克 琼脂 2 克 水 1000 毫升 先把淀粉放在烧杯里，用 5 毫升水调成糊状后，倒入 95 毫升水，搅匀后加入其他药品， 使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后， 补足失水。调整pH值到 7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 配方二 面粉琼脂培养基 面粉 60 克 琼脂 20 克 水 1000 毫升 把面粉用水调成糊状，加水到 500 毫升，放在文火上煮 30 分钟。另取 500 毫升水，放 入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到 7.4，分装，灭菌， 备用。 3、真菌培养基 配方一 萨市（Sabouraud's）培养基 蛋白胨 10 克 琼脂 20 克 麦芽糖 40 克 水 1000 毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入 40 克麦芽糖（或葡 萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。 本培养菌是培养许多种类真菌所 常用的。 配方二 马铃薯糖琼脂培养基 把马铃薯洗净去皮，取 200 克切成小块，加水 1000 毫升，煮沸半小时后，补足水分。 在滤液中加入 10 克琼脂，煮沸溶解后加糖 20 克（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养 酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。 把这培养基的 pH 值调到 7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽 孢杆菌。 配方三 黄豆芽汁培养基 黄豆芽 100 克 琼脂 15 克 葡萄糖 20 克 水 1000 毫升 洗净黄豆芽，加水煮沸 30 分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖， 搅拌使它溶解，补足水分到 1000 毫升，分装，灭菌，备用。 把这培养基的 pH 值调到 7.2～7.4，可用来培养细菌和放线菌。 配方四 豌豆琼脂培养基 豌豆 80 粒 琼脂 5 克 水 200 毫升 取 80 粒干豌豆加水，煮沸 1 小时，用纱布过滤后，在滤液中加入琼脂，煮沸到溶解， 分装，灭菌，备用。 - 7 - 实验二 普通光学显微镜的使用 一、实验目的 1、学习并掌握光学显微镜的原理和使用方法。 2、复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的 光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可 以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率 是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 。要增加数值口径，可以提高介质折 射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52） 相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。 显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越 高。现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式 显微镜。 （一）显微镜的主要构造 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 1.机械部分 （1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 （2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 （3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 （4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。 （5）物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有 3－4 个圆孔，是 安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观 察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 （6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通 光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹， 用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 （7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 ①粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大辐度的升降， 所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先 用粗调节器迅速找到物象。 ②细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍 镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。 2．照明部分 装在镜台下方，包括反光镜，集光器。 - 8 - （1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源 光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候 使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 （2）集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光 线集中到所要观察的标本上。 ①聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线 射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。 ②光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它 可调节其开孔的大小，以调节光量。 3.光学部分 （1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有 2－3 个，上面刻有 5×、10×或 15×符号以表示 其放大倍数，一般装的是 10×的目镜。 （2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有 3－4 个物镜，其中最短的刻有“10×”符 号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜， 此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示 分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(mm) 10× 0.25 5.40 40× 0.65 0.39 100× 1.30 0.11 表中的工作距离是指显微镜处于工作状态(物象调节清楚)时物镜的下表面与盖玻片(盖 玻片的厚度一般为 0.17mm)上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离小。 显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为 10×，目镜为 10×，其放大倍数就为 10×10=100。 三、器材 （一）样品 大肠杆菌、酵母菌等 （二）仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片。 四、操作步骤 （一）观察前的准备 （1）显微镜的安置： 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约 3~4cm 。镜 检时姿势要端正。 取、放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单 手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳， 也便于边观察边绘图或记录。 （2）光源调节： 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使 - 9 - 用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数 选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 （3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜。双筒显微镜的目镜间距可以适 当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的 不同观察者。 （4）聚光器数值孔径值的调节： 调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略 低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种 显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光 圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每 转换一次物镜都应进行这种调节。 在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮 度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照 明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据 不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。 （二）显微观察 在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不 同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜 的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定观察的位置。 （1）低倍镜观察： 将金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移 动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降 10Χ物镜，使其接近标本，用粗调节器慢 慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图象清晰。通过玻片夹推 进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察 到的结果。 在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本， 然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏 镜头及玻片。 （2）高倍镜观察： 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动 物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调 节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工 作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦用 。这种 同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调 节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载 玻片。 （3）油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升 高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调 节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置 并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过 1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴 - 10 - 香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上 升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太 快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 （三）显微镜用毕后的处理 （1）上升镜筒，取下载玻片。 （2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯） 擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。 （3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 （4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把 聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、显微镜使用的注意事项 1、持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到 其它地方。 2、轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。 3、保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦， 机械部分用布擦拭。 4、水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。 5、放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。 6、要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。 7、不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。 8、使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：转动旋转器使镜头离开通光孔， 下降镜台，取下标本片，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推 片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。最后填写使用登记表。(注：反光镜通 常应垂直放，但有时因集光器没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为 平放) 六、实验报告 1、记录实验结果。 2、思考题 （2）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时 应特别注意避免粗调节器的误操作？ （3）什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ （4）影响显微镜分辨率的因素有哪些？ - 11 - （5）根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行 有效的观察。 - 12 - 实验三 革兰氏染色法 一、实验目的 1、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性. 2、学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色 法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇 (或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色 的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色 (红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结 构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被 染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而 增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰 氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇 (或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶 紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时， 类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出 来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、材料 （一）菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）约 24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）约 16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。 （二）染色剂 结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。 （三）仪器或其他用具 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。 四、流程 涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）水洗→干燥→镜检。 五、步骤 （一）涂片 5.1.1 常规涂片法 - 13 - 取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴 蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌 液涂不开。 5.1.2 “三区”涂片法 在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水 滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的 接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大 肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 （二）晾干 让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （三）固定 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2-3 次固定（以不烫手为宜） （四）初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色 1～2min ，倾去染 色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 （五）媒染 用卢戈氏碘液冲去残水，并用碘液媒染约l min ，水洗。 （六）脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管滴加 95%的乙醇脱 色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性 菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约 20～30s。 （七）复染 在涂片上滴加番红液复染约 2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中， 不可使染液干涸。 （八）镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳 性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。 （九）实验结束后处理 清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜 头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。注意：不要用手或其它纸擦拭镜头。 染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。 六、实验结果 1、根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。 2、列表简述两株细菌的染色结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。 七、思考 1、哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ - 14 - 2、进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问 题? 3、革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴 性菌应分别是什么颜色? 4、不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？ 5、你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节? 6、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察? 7、如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢? - 15 - 实验四 显微镜直接计数法 一、目的要求 1、明确显微镜计数的原理。 2、学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点 是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻 片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm³），所 以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于 此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台 又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方 格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。。 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成 16 个中方格，而每个中方 格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即 16×25=400 小方格。 每一个大方格边长为 1mm,则每一大方格的面积为 1mm²,盖上盖玻片后，载玻片与 盖玻片之间的高度为 0.1mm,所以计数室的容积为 0.1mm³。 在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上 16 或 25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1ml 菌液中的总数。 下面以一个大方格有 25 个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数 为 A，菌液稀释倍数为 B，那么，一个大方格中的总菌数（即 0.1mm³中的总菌）为 A⁄5×25×B。 因 1ml=1cm³=1000mm³, 故菌液中的总菌数=A/5×25×10×1000×B=50000A×B(个) 同理，如果是 16 个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为 A`，则 1ml 菌液中 总菌数=A`/5×16×10×1000×B`=32000A`×B`(个) - 16 - 三、器材 酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。 四、操作步骤 （一）稀释 将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。 （二）镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗、吹干后才能进行 计数。 （三）加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液 由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室， 一般计数室均能充满菌液。注意取样时，要先摇匀菌液，不可有气泡产生。 （四）显微镜计数 静止 5 分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位 置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后 再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 5—10 个菌体为宜。每个计数室选 5 个中格 （可选 4 个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右 边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一 个样品，从两个计数室中计得的平均值来计算样品的含菌量。 （五）清洗血球计数板 使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱清洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行 晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其它沉淀物。若不干净则 必须重复洗涤到干净为止。 五、实验报告 - 17 - （一）结果 将结果记录于下表中。A 表示五个中方格中的总菌数;B 表示菌液稀释倍数。 各中格中菌数 1 2 3 4 5 A B 菌数 /ml 二室 平均 值 第一室 第二室 （二）思考题 根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量 减少误差，力求准确？ - 18 - 实验五 微生物接种技术 一、实验目的 1、学习掌握微生物的几种接种技术 2、建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 二、器械和用品 1、酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三 角型接种棒等接种工具。 2、菌种和培养基 菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 三、操作步骤 （一）斜面接种法 斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。 通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接 种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇 指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持 试管呈 45～0 度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝 集水浸湿培养基表面（图 4-5）。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时 易于取出。 右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红， 以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺 口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨 出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中 如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养 基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速 插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口， 并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标 签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 （二）液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其 操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下： 由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时 应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次 即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。 - 19 - 由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基 即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可（图 4-5）。 接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如 有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立 即放入盛有消毒液的容器内。 （三）固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的 另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为： 用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按 无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体 料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。 用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。 将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。 一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。 （四）穿刺接种法 此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意 事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。 接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿 原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生 长结果。 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接 种。 1、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或 方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸 管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到 涂布棒。（图３－３） 图３－３ 接种和分离工具 - 20 - 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： 1）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可 达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常 用此法。 2）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上， 成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外， 也有一点或多点进行接种的。 3）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的 接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量 的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿 刺线周围能够生长。 4）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至 45°C左右的 固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温 度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 5）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平 板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微 生物的菌落。 6）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用 移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称 为液体接种。 7）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动 物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 8）活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必 须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体 活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。 2、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种 含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实 验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平 是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢， 杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗， 并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。 空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间 应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接 种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先 接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接 - 21 - 种到新的培养基上。（图３－４）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复 原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把 平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时， 试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。 图３－４ 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞 四、 结果 分别记录并描绘平板划线、斜面和半固体接种的微生物生长情况和培养特征。 五、 思考 1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出为什么高氏I号培养基和马丁氏培 养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗 性的细菌，你认为应如何做？ 2、试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则? 3、以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。 - 22 - 实验六 细菌简单染色法 一、实验目的 1、学习微生物涂片、染色的基本技术。 2、掌握细菌的简单染色法。 3、初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普 通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使 经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操 作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通 常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色 部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显 微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复 红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的 形态。 三、材料 （一）菌种 枯草芽孢杆菌 12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)约 24h 营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）24h营养琼脂斜面培养物。 （二）染色剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。 3 仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦 镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 四、流程 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。 五、步骤 （一）涂片 取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸馏水)于玻片中央， 用接种环以无菌操作，分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌 - 23 - 苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取 2～3 环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不 宜过厚。 （二）干燥 室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰 太近，因温度太高会破坏菌体形态。 （三）固定 如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。 涂片、干燥和热固定 （四）染色 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液 1～2 滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕 氏碱性美蓝染色 1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约 1min 。 （五）水洗 倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时， 不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。 （六）干燥 甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。 （七）镜检 涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。 六、结果 绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。 - 24 - 实验七 酸乳中乳酸菌的测定 一、实验目的 1、了解酸乳中乳酸菌分离原理 2、学习并掌握酸乳中乳酸菌菌数的检测方法。 二、实验原理 活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产 品品种和质量的依据。 由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、 肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其 要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键 是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得 满意的结果。 采用溴甲酚绿（BCG）牛乳营养琼脂干板或溴甲酚紫莆萄糖肉汤（BCP）分离乳酸 菌。溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中呈蓝色，分离培养基配制后， pH为 6.8，加入溴甲绿指示剂后，呈蓝绿色。乳酸菌在该培养基中，由于分解乳糖产生 乳酸，使菌落呈黄色，茁落周围的培养基也变为黄色，所以较容易鉴别。（BPC培养基 在碱性环境中呈紫色，乳酸菌落周围变成黄色）。 三、材料 （一）培养基 固体培养基:BCG,BCP。 1、固体培养基 BCG 培养基的制备 溶液 A：脱脂乳粉 25g，水 125ml，加 1.6%溴甲苯绿乙醇溶液 0.25ml,95℃灭菌 20 分 钟(两份) 溶液 B：酵母浸粉 2.5g，水 125ml，琼脂 5g，PH 值 7.0,5.5 各一份 121℃湿热灭菌 20 分钟。 趁热将 A,B 两溶液以无菌操作均匀混合，每个 pH 值倒 3 个平板，待冷凝后置 37 ℃培养 24 小时，若无杂菌生长，即可使用。 BCP 培养基的制备 酵母膏 0.625g,蛋白胨 1.25g,葡萄糖 1.25g,溴甲酚绿 0.01g,琼脂 10g,蒸馏水 250ml,Ph 值 7.0 和 5.5 各一份,121℃灭菌 20 分钟。两个 pH 值各倒 3 个平板，待冷凝后置 37℃培 养 24 小时，若无杂菌生长，即可使用 2、液体培养基 发酵培养基：脱脂乳粉与 5%的蔗糖水按 1:10 比例配制,灭菌 20 分钟。倒试管(规格 15*150mm)共 15 管 脱脂乳培养基：配制 12.5%的脱脂乳粉水溶液,经 90-95℃灭菌处理,用于菌种的活化 - 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