实时定量PCR技术数据处理

1 定量PCR实验数据处理 陈云地 8008100192，8008203939-407 chenyd@appliedbiosystems.com 2 提 要 ™ 定量PCR的实验要素 ™ 定量PCR的数据处理 定量PCR的实验要素 4 定量PCR实验要素 ¾ 目标基因 未知样品 ¾ 生成 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线 标准品梯度 ¾ 监控系统故障 阳性对照 ¾ 监控污染 阴性对照 ¾ 校准生物学误差 管家基因 (IPC) ¾ 校准物理误差 参比荧光 (ROX) ¾ 降低其余误差 重复实验 5 96孔板设置举例 阳性对照 阴性对照 标准品 检材 6 样 品 ‹ 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 可以是gDNA、cDNA、质粒、PCR产物； RNA需要反转录成cDNA ‹ RNA可以直接定量，前提是RT的效率一致 ‹ DNA纯度： OD260/OD280=1.8，可以在1.6 ~ 2.0之间 ‹ DNA用量： 0.1 ng - 1 ug，最好10-100 ng/rxn ‹ RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ‹ RNA用量：60 ng – 2 ug / RT-rxn； ‹ cDNA用量： 1-100 ng RNA反转录所得cDNA加 1 uL/rxn ‹ 注 意：100 uL的反转录体系最多可以反转录2 ug 总RNA； 如果>2 ug，分成几管 7 标准品 )1log( log)log( )1log( log X SBT X O T E RRR E XC + −−++−= ‹ 目 的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 ‹ 不要求： ƒ 数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA ƒ 可以使用相同的DNA ƒ 也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段…… ‹ 要 求： ƒ 5点以上 ƒ 浓度已知 ƒ PCR效率一致，且接近100% • 仪器一致 • 反应条件一致：循环参数、同一次实验 • 试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液 8 梯度稀释方法 ‹ 选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调 整浓度、梯度稀释 ‹ CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 ‹ 10倍连续梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 切不可由标准品I分别加不同体积的稀释缓冲液 直接得到标准品ii、iii、iv、v 9 标准品单位 ‹ 标准品的性质决定最终结果的性质： DNA标准品，已知拷贝数→绝对定量，得未知样品拷贝数 DNA标准品，已知ng/uL→绝对定量，得未知样品ng/uL DNA标准品，未知拷贝数或浓度，已知稀释倍数→相对定量， 得未知样品之间相差倍数 RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释 cDNA→相对定量，得未知样品ng RNA/uL ‹ 注意测定对单位的要求 如果要求测定样品的基因拷贝数，→梯度稀释已知摩尔浓度的 DNA片段 如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)]，如转基因，标准品 是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混 合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分 别抽提转基因与非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得 出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比） 10 PCR效率对定量结果的影响 n = 30 1+e = 1.95 N = N0 1.9530 = N0 x 5.0 x 108 相差2.2倍 n = 30 1+e = 1.90 N = N0 1.9030 = N0 x 2.3 x 108 11 测定PCR效率 e = 10 -1/k 12 ？ • 标准品DNA与目标DNA必须是一样的吗？ • 当检测多个基因时，需要分别做标准曲线吗？ 13 做几条标准曲线？ I 1000 I 2000 I 4000 I 8000 I 16000 I 32000 Amounts. (pg) 20- 19- 18- 17- 16- 15- CT •• •• • • • •• • • • •• •• • • • •• • • • ⊗ A ⊗ B⊗ C Target gene ⊗ A ⊗ B⊗ C Endogenous controlEndogenous control Relative Standard Curve Comparison of the c-myc expression level in brain, kidney, liver and lung Standard: Raji Cell line total RNA Endogenous Control: GAPDH 14 管家基因— IPC ‹ 通常以uL或者ug为单位取样 ‹ 细胞培养液：同样体积，细胞数目并不同样 ‹ DNA溶液：抽提效率和操作误差，同样体积的DNA并不来 源于同样数目的细胞 ‹ copy/uL要校正成copy/cell才有意义 ‹ [Copy / uL] / [cell / uL] = copy / cell ‹ [管家基因] ∝细胞数 [Copy Smpl] / [Copy IPC] = Copy / cell ≡ ∆CT = CT Smpl - CT IPC 15 IPC的定义 •• 什么是什么是IPCIPC IPC通常选用管家基因 它与目标基因在相同的PCR条件下具有相似的扩增效率 •• IPCIPC的作用的作用 监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等 对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行 修正。 16 IPC的选择标准 ƒ 在所有待测样品中，内对照(Endogenous Control) 的表达量都恒定不变 ƒ 注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖 的、或者处理方式依赖的 ƒ 多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高 ƒ 推荐使用Human Endogenous Control Plate (P/N 4309920)测试不同管家基因的效果 ƒ 常用的内对照有18S rRNA、β-actin、GAPDH等 17 ？ • 在使用TaqMan MGB探针的情况下，你认为 管家基因与目标基因是在同一管内做多重定 量好，还是分成两管分别定量好？哪一种检 测的数据更精确？ 18 扩增效率要一致 曲线斜率 < 0.1 19 校准荧光ROX Rn = RFAM / RROX Reporter Reference ROX以固定的浓度配在Master Mix中 ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Mix用量有关 校准枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光 性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批 间温度的波动）的误差等 减少孔间差异和批间差异，提高数据的重现性和精度 20 ROX校准的效果 21 重 复 样 品 ƒ 重复次数请遵循统计学的要求 ƒ 小样本统计，n>6 ƒ 未知样品和标准品都要重复 ƒ 所有复管在同样条件下完成PCR 22 ？ • 你为什么会想到做多重定量？ • 多重定量能达到目的吗？ 定量PCR的数据处理 24 绝对定量与相对定量 绝对定量 相对定量 600个拷贝 两个样品相差10倍 25 绝对定量与相对定量 5000 10000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Sample 1 Sample 2 Copy # 1 2 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 Sample 1 Sample 2 Fold Chg • 绝对定量 – 优点：给出目标基因的绝对 数量，数据容易处理 – 缺点：必须有标准品，做标 准曲线，难以制备和质控 • 相对定量 – 优点：可以不做标准品；标 准品容易制备；使用广泛 – 缺点：数据理解困难 绝对定量：绝对标准曲线法 目标：测定目标基因的准确拷贝数 20,000 copies 10,000 copies 5,000 copies 2500 copies 1250 copies Unk1 Ct=24.8 Unk1浓度=4000 拷贝 27 绝对定量误差的校正 • 生物学方面的误差：IPC校正 细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录 效率等 • 物理方面的误差：ROX校正 枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚 度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器 稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等 • 其余的误差：统计校正 重复实验，取平均值 28 绝对定量的数据处理 • 管家基因校准(Normalization Gene) IL-2 18S 目标基因 管家基因 如 29 相对定量有两种方法 定义：比较同一基因在不同样品中的表达量 结果：数据是%，没有单位 方法：相对标准曲线法和∆∆CT法 应用：应用最广泛，功能最强大 相对定量：相对标准曲线法 标准品：可以只知道梯度稀释的稀释倍数 Unk1 浓度 = 0.2 a Unk2 浓度 = 0.1 a 相差2倍 a ½ a ¼ a 1/8 a Unk1 Ct=24.8 1/16 a Unk2 Ct=25.8 31 相对定量误差的校正 • 生物学方面的误差：IPC校正 细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录 效率等 • 物理方面的误差：ROX校正 枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚 度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器 稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等 • 其余的误差：统计校正 重复实验，取平均值 32 相对定量的数据处理 • 管家基因校准(Normalization Gene) – 得出每个细胞中的[目的基因] – 目标基因 vs. 管家基因 • 对照样品校准(Calibrator Sample) – 得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample. – 处理的 vs. 未处理的，6 hr vs. 0 hr, 病理 vs. 正常…. Sample Calibrator IL-2 18S 目标基因 管家基因 处理后 处理前如如 33 相对标准曲线法计算示例 IL-2 pg 总RNA 18S Pg 总RNA Normalized IL-2 表达 Calibrated IL-2 表达 2.0x10-2 1 2.55 0.25 (~降低4倍) 5.1x10-2 0.50x10-2 1032 2320 404 0 Hr 52,152 2 Hr 45,123 24 Hr 80,176 34 相对定量：∆∆ CT法 依据：平均相对含量% = 2 –平均ΔΔCT 好处：不做标准曲线 ∆∆CT = ∆CT Unknown - ∆CT Calibrator Normalized Unknown % = Normalized Calibrator 35 %与∆∆CT的关系 Nn = N0 (1+E) n NCT = N0 (1+E) CT 当E ≈ 100% = 1时，1+E = 2 NCT = N0 2 CT N0 = NCT 2 -CT 所以， Nrel = N01/N02 = NCT1/NCT2 2 –(CT1– CT2) = 2 - ΔCT 平均相对含量 = 2 – 平均ΔΔCT %与∆∆CT的关系 Rn = RB + N0 (1+ E)n Rs 当E=100%=1 时： RCT = RB + N0 × 2CT RS N0 × 2CT = (RCT - RB ) / RS = b N0 = b / 2CT = b × 2 - CT N01 / N02 = 2 – (CT1 - CT2) = 2 – ∆CT 平均相对含量 = 2 – 平均ΔΔCT 37 ∆∆ CT法计算示例 IL-2 平均CT 18S 平均CT Normalized IL-2表达(∆CT) Calibrated IL-2表达(∆∆CT) 变化倍数 2-(∆∆Ct) 11.9 0 -1.2 1.9 10.7 1 2.3 13.8 0.27 (~降低4倍) 24.5 23.2 25.4 0 Hr 12.6 2 Hr 12.5 24 Hr 11.6 注 意：如果反应效率不高，则差别被高估。 – 当 ∆∆CT = -1.2 > E=1，2.3 倍差别 > E=0.9，2.2倍差别 > E=0.5，1.6倍差别 38 ？ • ∆∆CT法相对定量要求PCR效率一致且接近 100%，标准曲线法相对定量没有这样的要求， 对吗？ • 相对定量要做管家基因吗？ • 相对定量要做重复实验吗？ • 加样量变化了，相对定量的结果会随着变化吗？ 39 ∆CT与相对定量 25 30 总RNA少 threshold B A ∆CT=5 10 15 总RNA多 threshold B A ∆CT=5 相 对 信 号 强 度 循环次数 只要PCR效率相同，∆CT就保持恒定 40 相对定量研究举例 Target gene – c-myc FAM标记 Endogenous Control - GAPDH VIC标记 Standard - Raji total RNA 41 相对定量研究举例 42 自动分析：RQ软件 43 ？ • 绝对定量要做管家基因吗？ • 绝对定量要做ROX校正吗？ • 绝对定量要做重复实验吗？ 欢迎联系AB公司 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 查询： 英文原版操作手册、说明书下载 基因定量和SNP引物探针试剂盒查询 www.appliedbiosystems.com 全国维护中心电话：8008100192 欢迎联系AB公司 资料查询： 英文原版操作手册、说明书下载 基因定量和SNP引物探针试剂盒查询 www.appliedbiosystems.com 全国维护中心电话：8008100192 定量PCR的实验要素 96孔板设置举例 样 品 标准品 梯度稀释方法 标准品单位 ？ 管家基因 — IPC ？ 校准荧光ROX ROX校准的效果 重 复 样 品 ？ 定量PCR的数据处理 绝对定量与相对定量 绝对定量与相对定量 绝对定量：绝对标准曲线法 绝对定量误差的校正 绝对定量的数据处理 相对定量：相对标准曲线法 相对定量误差的校正 相对定量的数据处理 相对标准曲线法计算示例 ∆∆ CT法计算示例 ？ 自动分析：RQ软件 ？ 欢迎联系AB公司资料查询：英文原版操作手册、说明书下载基因定量和SNP引物探针试剂盒查询www.appliedbiosystems.com 全国维护中心电话：8008100192