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使用全自动生化分析仪的体会.doc

使用全自动生化分析仪的体会

sunmoonglass
2011-10-07 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《使用全自动生化分析仪的体会doc》,可适用于工程科技领域

第一章使用全自动生化分析仪的体会  近二十年来随着检验医学的飞速发展各种全自动分析仪的引进和普及极大地扩展了检验项目的数量提高了检验结果的准确性并因其高效、快速而逐渐成为医院硬件建设的重点投入项目。目前国内各级医院所采用的全自动分析仪基本上来自于进口尤其是大中型自动分析仪。因此医院和检验科领导在选购、使用和管理上均非常慎重。一般而言自动化程度越高的仪器使用越简单但维护要求却很高而仪器的检测准确性和使用寿命除操作正确与否外正确的日常维护与保养是必不可少的。特别是全自动分析仪的管道系统常被忽略而又故障频发往往导致维修成本的增加也给日常工作造成麻烦。实际上有一些小故障完全可以通过正确使用和维护加以避免或自行排除。我院检验科于年购置了一台Liasys(意大利)生化分析仪经过这几年的使用发现一些问题影响仪器正常使用。本文结合实践就仪器常见的故障加以分析解决方案和日常维护小结如下以供检验同道商讨和借鉴。  、常见故障  吸光度重复性差这里指的吸光度是指空白吸光度用蒸馏水做空白试验。原因之一:比色杯不洁。由于仪器长期使用比色杯内会有污物沉积造成光的散射导致吸光度变化使结果不稳定。处理方法:曾用次氯酸液、消毒液浸泡、蛋白酶类去污剂、mmolLNaOH溶液浸泡min、高锰酸钾液进行了比较处理。结果以次氯酸液和蛋白酶类去污剂进行的处理比较好。但应注意的是用次氯酸液浸泡时间不能太长一般min后用自来水冲洗再用蒸馏水冲洗即可否则浸泡时间过长比色杯透光度将减少次氯酸浓度过大或浸泡时间过长比色杯四周粘接处将脱落而损坏。测试结果偏高或偏低除造成空白吸光度重复性偏差的原因外加样注射器漏气或其他塑料管道漏水。如注射器漏气是因仪器长期使用注射器内螺样内芯磨损而封闭不全以致泄漏。处理方法:取下注射器置于次氯酸液内浸泡min用纱布擦干再反复用自来水冲洗后用蒸馏水洗净然后检查其封闭性。方法:进样短针孔与蒸馏水接触用手拖拉注射头如注射器内被水溢满说明已不漏气如还不满有少量空隙就应更换新的螺样内芯。  环境因素  防尘平时灰尘进入仪器的电子系统、管道系统、散热系统、光路系统而影响吸光度值造成结果误差。因积尘太多或影响电路板正常工作或影响仪器散热、或造成管道尤其是探针系统堵塞。因此在仪器的使用环境中应严格防尘。我们的做法是门窗始终处于关闭状态仪器室工作人员进入仪器室应更换专用拖鞋并且备有专用于仪器除尘的微型吸尘器。另外常备一把电吹风也是非常有用的。  环境温度与仪器散热全自动分析仪本身就是一个相当大的产热系统其热源来自仪器的电子系统、温控系统、试剂存储系统。虽然仪器本身均设计有散热系统但环境温度过高也影响仪器电子系统散热不良导致工作不稳定。一般仪器的使用环境温度要求在℃左右。  保养  蒸馏水应勤更换最好天更换次并且冲洗用蒸馏水不得有杂质防止桶内生长细菌。尤其是夏天水易生长细菌影响结果。一定时间后应加稀盐酸浸泡去除桶底沉淀。试剂杯应常清洗试剂杯不能长期使用而不清洗更防止产生沉淀和生长细菌以免堵塞采样针和污染试剂。  仪器应专人管理、维修仪器应专人专管、专业人员维修、不要随意更换、取动各种部件。管道系统的清洗自动化程度越高的分析仪其管道系统也越复杂虽然它不是分析仪的核心组成部分但因其故障较多常影响仪器正常工作。管道系统常见故障有堵塞、漏气、漏液、接头脱落等。为保证检测结果的可靠自动化分析仪一般均设计有自动冲洗系统。Liasys即采用了新的激流式单向冲洗及多步骤冲洗较之原来的涌流式冲洗更干净、彻底。有效避免了交叉感染提高了检测准确性。但这一冲洗系统仅对前管道系统(探针至比色杯)进行了冲洗而我们在日常工作中经常发现后管道系统易堵塞其原因是各种反应液中不同试剂以及血清蛋白等混合后产生大量絮状沉淀日积月累而导致堵塞。因此需要定期对后管道系统进行疏通处理。常用方法为:拆下管道用注射器注入双缩脲试剂或“”消毒溶液浸泡~min然后用自来水冲洗干净即可。若发现管道内壁沉淀物太多可用通丝进行清除然后进行化学液浸泡和冲洗。对管道系统的漏液、漏气只能更换管道。但换下的旧管道不要丢弃找到和剪除破损部分余下部分可考虑再次使尤其是比例泵泵管因采用特殊材料制成价格很高。电子系统的正确使用和维护自动化分析仪的发展离不开微机的应用。档次较低的分析仪普遍采用单芯片控制系统而中高档的分析仪普遍采用多个微处理器(CPU)在其使用维护中除上面讲到的解决好散热、除尘、除湿外正确的操作也很重要。首先应配备专用不间断电源(UPS)以免电压过高过低或突然断电影响仪器正常工作或造成数据丢失甚至烧毁线路板。其次新仪器投入使用前应培训操作人员掌握仪器性能特点并正规操作。另外仪器的操作系统应制作和备份启动盘以备在仪器死机后能重新启动系统。第二章生化自动化分析方法概要一、分析方法分类(一)终点法被测物质在反应过程中完全被转变为产物即达到反应终点根据终点吸光度的大小求出被测物浓度称为终点法(endessay)。实际上被测物并没有完全被转变而只是与产物达到一个动态的化学平衡因此该法称为平衡法更为恰当。从时间吸光度曲线来看到达反应终点或平衡点时吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值求出其平均值计算结果并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单反应时间一般较长精密度较好。终点时间的确定:①根据时间吸光度曲线来确定如Trinder反应测定尿酸反应曲线上~min时其吸光度已趋向稳定因而可将min作为反应终点。②根据被测物反应终点结合干扰物的反应情况来确定如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中白蛋白与溴甲酚绿在s内很快完成反应之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生"慢反应"使反应曲线上吸光度在s后仍继续缓慢上升持续约达min因此终点时间应采用~s而不应选择min。.一点终点法:在反应到达终点即在时间吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值这种方法称为一点终点法(onepointendessay)其反应曲线见图。其检测结果的计算公式是:待测物浓度CU=(待测吸光度AU-试剂空白吸光度AB)×K。K为校准系数详见第五节二操作方法。.两点终点法:在被测物反应或指示反应尚未开始时选择第一个吸光度在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度此两点吸光度之差用于计算结果称为两点终点法(twopointendessay)其反应曲线见图。计算公式为CU=(待测吸光度A-待测吸光度A)×K。该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸(icterus)和脂浊(lipoturbid)等样品本身光吸收(见图)造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初若指示反应吸光度尚未明显变化则可在此时选择第一个吸光度在指示反应终点时选择第二个吸光度从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目因反应初期吸光度已有明显变化因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前此时指示反应一般尚未开始则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能不必手工进行校正。(二)固定时间法指在时间吸光度曲线上选择两个测光点此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度这两点的吸光度差值用于结果计算称为固定时间法(fixedtimeessay)反应曲线见图。其计算公式与两点终点法相同为CU=(AA)×K。有时也称此法为两点法。该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。例如:苦味酸法测定肌酐反应的最初s内血清中快反应干扰物(如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等)能与碱性苦味酸反应在第二个s时碱性苦味酸主要与肌酐反应且此段时间-吸光度曲线的线性较好(故也可用连续监测法测定肌酐)在~s及其以后碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。这样选用反应的第二个s为测定时间既避免了快反应物质的干扰也避免了慢反应物质的影响使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系有利于提高分析的特异性和准确度。(三)连续监测法连续监测法(continuousmonitoringessay)又称速率法(rateessay)是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时连续选取时间吸光度曲线中线性期的吸光度值并以此线性期的单位吸光度变化值(ΔAmin)计算结果见图A和B。所谓线性期就是各点吸光度差值相等如图C所示图中δ及δ值偏小而δ=δ=δ故A点至A点属线性段。此线性期对底物来说属零级反应期间的ΔAmin即为酶促反应的初速度其大小与被测酶活性成正比。连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔAmin根据此值再准确地计算酶活性因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度一般是某些基于酶法测定的代谢物。酶活性(UL)=ΔAmin×理论(或校准)K值代谢物浓度CU=ΔAmin×校准K值。关于理论K值和校准K值叙述如下:  .理论K值 :多用于酶活性测定中因酶活性尚无公认的校准品可用因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为:酶活性(UL)=ΔAmin×将此式中以K来表示此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数(ε)、反应液总容量(TV)、样品容量(SV)和比色杯光径(d)计算后得出即为理论K值可作为分析参数输入到分析仪中。采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。温度的影响有时也非常大由于反应盘是半暴露的因此随着较冷试剂的加入反应盘中的温度会逐渐降低尽管开始测定时反应盘温度已升到°C但在某一项目测定过程的开始阶段温度可能达不到°C甚至仅°C左右且反应过程中仍有可能上下波动这对于酶学反应来说影响是很大的。如采用°C时的理论K值将会使测定结果降低温度的波动还会使得结果的重复性降低。当然若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温则基本不影响反应盘温度。由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同因而有必要获得实际的摩尔吸光系数然后用来计算的K值称为实测K值。()NADH(NADPH)摩尔吸光系数的测定:NADH(NADPH)没有标准纯制品而且配成溶液后稳定性又较差不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器须通过有NAD(NADP)参与的反应途径。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品又有国家批准文号的葡葡糖标准液。因此根据公式A=εbC已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH(NADPH)的摩尔吸光系数ε为AbC。假设葡萄糖标准液浓度为OmmoL(molL)标准液加入量为μL酶试剂加入量为μL比色杯光径为cm在nm测得吸光度为则实测NADH摩尔吸光系数== 即在此台分析仪上nm波长处测得NADH(NADPH)的摩尔吸光系数为而理论上NADH(NADPH)的ε为。()"色素原"酶促产物在nm波长摩尔吸光系数的测定:有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物其本身无色经酶作用后释放出有色的反应产物在nm波长具有吸收峰。最常用色素原底物及其产物为:ALP测定以磷酸对硝基苯酚(NitrophenylphosphateNPP)为底物经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(NitrophenolNP)GGT测定以γL谷氨酰对硝基苯胺(γLGlutamylpnitroanilide)或γL谷氨酰羟基对硝基苯胺(γLGlutamylcarboxylpnitroan)为底物经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(pNitroanilineNA)或对硝基氨基苯甲酸(aminonitrobenzoicacidANBA)。对硝基苯酚的摩尔吸光系数为(nm)对硝基苯胺的摩尔吸光系数为(nm)对硝基氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为(nm)。下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。试剂:①NP标准储存液(OmmoL)。②NP标准应用液(mmoL以molLAMP缓冲液稀释而成)。③底物缓冲液(lmmolLNPP配于molLAMPHCL缓冲液中℃,pHl土)。测定方法:NP标准液加入量为μL底物缓冲液加入量为μL波长nm光径cm温度℃测定得吸光度为A另用蒸馏水代替NP标准液按上述方法测定其吸光度为ANP标准液吸光度ΔA=AA若测得ΔA为则实测NP摩尔吸光系数==  .校准K值 酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好但必须有两个先决条件:①必须使用配套的试剂②必须使用配套的高质量的校准品该校准品应具有溯源性。使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果。关于酶活性标准品欧洲标准局(BCR)和美国国家标准技术研究院(NIST)均发表了人血清基质的酶活性标准物但目前尚无公认的标准(校准)品问世。(四)透射比浊法抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物在反应液中具有一定的浊度可由一般分光光度法进行透射比浊(transmissionturbidimetry)测定可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准再经非线性回归求出抗原或抗体的含量。使用散射比浊法(scatterturbidimetry)能更加准确快速地检测抗原抗体形成浊度的大小或其速度目前专用的特定蛋白分析仪可做此法检测。有关免疫比浊法原理详见第二章。二、常用生化检测项目分析方法举例  .终点法检测 常用的有总胆红素(氧化法或重氮法)、结合胆红素(氧化法或重氮法)、血清总蛋白(双缩脲法)、血清白蛋白(溴甲酚氯法)、总胆汁酸(酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)、总胆固醇(胆固醇氧化酶法)、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(直接测定法)、钙(偶氮砷Ⅲ法)、磷(紫外法)、镁(二甲苯胺蓝法)等。以上项目中除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。  .固定时间法 苦味酸法测定肌酐采用此法。  .连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等也可用连续监测法。.透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目多数属免疫比浊法载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。第三章常用生化检测项目分析方法举例及参数设置一、常用生化检测项目分析方法举例  .终点法检测 常用的有总胆红素(氧化法或重氮法)、结合胆红素(氧化法或重氮法)、血清总蛋白(双缩脲法)、血清白蛋白(溴甲酚氯法)、总胆汁酸(酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)、总胆固醇(胆固醇氧化酶法)、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(直接测定法)、钙(偶氮砷Ⅲ法)、磷(紫外法)、镁(二甲苯胺蓝法)等。以上项目中除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。  .固定时间法 苦味酸法测定肌酐采用此法。  .连续监测法 对于酶活性测定一般应选用连续监测法如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等也可用连续监测法。.透射比浊法 透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目多数属免疫比浊法载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等其程序均已经固化在存储器里用户不能修改。各种测定项目的分析参数(analysis paramete)大部分也已设计好存于磁盘中供用户使用目前大多数生化分析仪为开放式用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。一、分析参数介绍(一)必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件没有这些参数无法进行检测。.试验名称试验名称(testcode)是指测定项目的标示符常以项目的英文缩写来表示。.方法类型(也称反应模式)方法类型(assay)有终点法、两点法、连续监测法等根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。.反应温度一般有℃、℃可供选择通常固定为℃。.主波长主波长(primarywavelength)是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。.次波长次波长(secondarywavelength)是在使用双波长时要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。.反应方向反应方向(responsedirection)有正向反应和负向反应两种吸光度增加为正向反应吸光度下降为负向反应。.样品量样品量(samplingvolum)一般是μl~μl以μl步进个别分析仪最少能达到μl。可设置常量、减量和增量。.第一试剂量第一试剂量(firstregengtvolum)一般是~μl以μl步进。.第二试剂量第二试剂量(secondregengtvolum)一般也是~μl以μl步进。.总反应容量总反应容量(totalreactingvolum)在不同的分析仪有一个不同的规定范围一般是~μl个别仪器能减少至μl。总反应容量太少无法进行吸光度测定。.孵育时间孵育时间(incubatetime)在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。.延迟时间延迟时间(delaytime)在连续监测法中样品与反应试剂(第二试剂)混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。.连续监测时间连续监测时间(continuousmonitoringtime)在延迟时间之后即开始一般为~s不少于个吸光度检测点(个吸光度变化值)。.校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的可采用一个校准液(calibrator)线性好但不通过坐标零点应使用两个校准液对于校准曲线呈非线性者必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。.校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值(calibratecoefficient)或由计算得出的K值为理论K值。.线性范围即方法的线性范围(linearityrange)超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂样品比值有关。.小数点位数检测结果的小数点位数(decimalpointdigit)。(二)备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关一般来说不设置这类分析参数分析仪也能检测出结果但若样品中待测物浓度太高等检测结果可能不准确。.样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。.底物耗尽值底物耗尽值(substrateexhaustlimit)在负反应的酶活性测定中可设置此参数以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。.前区检查免疫比浊法中应用以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别(ΔA)设置一个限值如果后一点的吸光度比前一点低表示已有抗原过剩应稀释样品后重测。.试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质应更换合格试剂。.试剂空白速率连续监测法中使用是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。.方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果的一致性有斜率和截距两个参数。.参考值范围对超过此范围的测定结果仪器会打印出提示。(三)某些参数的特殊意义.最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是μl目前也有小至μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数从而使分析仪检测范围(与线性范围不同)的上限得以扩大。.最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定以往手工法操作时样品量μl试剂量ml这样试剂量样品量比例(RS)为线性上限则为gL。此法移植到分析仪上后RS却很难达到致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。.弹性速率在酶活性测定中当酶活性太高在连续监测期中已不呈线性反应时有些仪器具有弹性速率(flexrate)功能能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从UL扩展至UL从而减少稀释及重测次数、降低成本。.试剂空白速率当样品中存在胆红素时胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长nm有较高光吸收而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变因而以第二试剂加入后的速率变化减去试剂空白速率变化便可消除胆红素的负干扰见图。二、单波长和双波长方式(一)概念采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(monowavelength)方式。当反应液中含有一种组分或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时可以选用。在吸光度检测中使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时采用双波长方式更好。(二)双波长的作用双波长(diwavelength)测定优点是①消除噪音干扰②减少杂散光影响③减少样品本身光吸收的干扰。从光源到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号即噪音而双波长检测是同时进行的两种波长检测产生的噪音基本上相同因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时会产生非特异性的光吸收而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰提高检测的准确性。(三)次波长的确定方法当被测物的主波长确定之后再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征选择次波长使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说次波长应大于主波长nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。(四)双波长的具体应用对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目尤其是单试剂分析中可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白(双缩脲法)主波长nm次波长nm血清白蛋白(溴甲酚氯法)主、次波长分别为和nm钙(偶氮砷Ⅲ法)主、次波长分别为、nm磷(紫外比色法)主、次波长为、nm镁(二甲苯胺蓝法)主、次波长为和nm。三、单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析其优点是:①可提高试剂的稳定性多数双试剂混合成单一工作试剂时其稳定时间缩短②能设置两点终点法来消除来自样品本身的光吸收干扰③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶(乳酸脱氢酶)起反应使结果偏高。若先加入缺乏α酮戊二酸的第一试剂使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α酮戊二酸的第二试剂启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD+能真正反映ALT的活性从而消除以上副反应的影响。四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。.试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质:如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD而下降等。试剂空白的测定方法有两种:①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度适用于先加试剂后取样品的分析仪。.试剂空白变化速率监测一些酶试剂在反应温度下不稳定其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。这种变化会影响测定结果的准确性一般使结果偏高。如果设置此项监测分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD(P)H减少为指示反应的酶活性测定中空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降在色素原为底物的酶活性测定中空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用已如前述。.样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性用双波长或多波长检测其性质和程度一般是测定样品在nm/nm、nmnm和nmnm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰这将有利于提高分析结果的可靠性。.结果可靠性监测()终点监测:终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光点比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。()线性期监测:连续监测法选择时间-吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归计算出各点的方差根据方差值的大小来判断是否呈线性②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较来判断是否为线性期。.底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值则说明该样品酶活性非常高底物将被耗尽监测期的吸光度将偏离线性使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图.方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围样品结果若超过此范围分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。第四章标准品和校准品传统的临床检验要使检验结果可靠或有依据往往有一个标准品(Standard)。以临床化学检验的比色测定为例常作三个检测:空白、标准、测定。用空白液调整吸光度为零读出测定比色液和标准比色液的吸光度分别为As和Au已知标准液浓度为Cs。在一定范围内某分析物浓度和吸光度呈良好比例关系。为了克服纯标准液和病人样品间的基体差异年前开始引用具有与病人样品基体相似的校准品替代标准品用于日常工作。由于以往在使用标准品时不强调它的专用性国内在应用校准品时忽略了它的专用性。任何方法或仪器、试剂使用一个校准品严重影响检验质量。一、标准液的定值一般而言检验工作使用的标准品属应用标准。配制或供应这类标准品的实验室或厂商具有符合质量标准的纯品。称取一定量的纯品然后将其溶解在容量瓶内用溶剂稀释至容积刻度混匀标准液配制完成。由称量法获得的称量值和容量法配制的容积计算出该标准品浓度。检定部门抽样测定结果在规定范围内属合格。即使测定检定结果在范围的上、下限也不能将实测值作为标准值。因为测定值的可靠性取决于检定方法一般的分析方法的可靠性不如分析化学公认的称量法和容量法。所以标准品的定值由称量和容积计算确定。检定不合格即报废决不可将实测值替代修正。二、校准品的定值.校准值随方法而异如前述由于纯标准液和新鲜病人标本间的基体差异以标准液标化常用方法后常用方法检测病人标本的结果和参考方法结果的可比性很差。为了克服基体效应推荐使用校准品。校准品的大多来源为人的样品混合物如混合血清。本身内含被检分析物制备时可添加某些分析物增加含量。校准品中被检分析物的含量无法由称量法和容量法确定只能倚赖于分析方法。校准品的校准值必须取决于分析方法或检测系列。.新鲜病人标本是最佳校准品由于所有校准品都是处理过的样品和新鲜病人标本有着基体差异。若使用公认的参考方法去标化测定校准品测定程序是严密的测定值是可靠的。但使用该测定值去校准常规的检测系列时校准品中被检分析物参与反应时的表现明显不同于新鲜病人标本不能将参考方法系列的准确度通过校准品传递给病人标本。须明确的所有用于检验中的检测方法、仪器、试剂等都是用来检测病人新鲜标本的不是用来检测校准品这样的处理过样品。如果先用公认的参考方法检测病人标本再以具有参考值的病人标本去校准某检测系列(包括方法、试剂、仪器)此时该检测系列再检测其他新鲜病人标本时这些病人标本结果的溯源性可上溯至公认的参考方法。也即用新鲜病人标本是校准检测系列的最佳校准品。用这种方式校准能使同一个检测系列在不同实验室检测新鲜病人标本时检验结果在实验室间具可比性。一些大公司正是按照这样的认识为校准品定值。三、原则上以具有参考值的新鲜病人标本去校准某检测系列(包括方法、试剂、仪器)后检测系列再去检测候选的校准品(处理过)得到的检测值为初始校准值。以初始校准值反过来再校准组合的检测系列后该检测系列又去检测病人的新鲜标本。观察病人标本的检测值是否和参考方法的测定值具良好的可比性。实践说明只有不断地调整校准值直至用该校准值校准指定的检测系列(加上具有校准值的校准品即组合成检测系统)后检测系统再检测病人标本得到的测定值和病人标本的参考方法测定值具有满意的可比性(测定值和参考值间的偏倚≤)。此时校准品的校准值可以确认。.校准值不是测定值是纠正的调整值(CorrectedValue)厂商的校准品定值方案极为严密。为了便于说明问题以某公司的定值方案为例定值的校准品是人血清。)准备一批血清样品内含被检分析物含量不同可反映所需的病人结果可报告范围。将它们离心、过滤分装后深低温保存。由参考实验室用公认的参考方法和标准品或参考品对这些血清检测定值。这些血清是公司的一级“参考品”参考方法对血清的定值犹如参考值是确定校准品校准值的依据。)制备一大批侯选校准品。由参考实验室也为之定值。邀请多家具有指定的相同型号仪器的实验室(包括公司的实验室)参与工作。指定使用公司某型号的试剂盒(批号任意)及检测程序。校准目标是:公司提供的仪器、试剂和方法系列(加上校准品即为检测系统)对病人样品的检测结果和参考方法对病人样品检测结果具可比性。首先用侯选校准品的定值对检测系列校准后检测一级参考品的血清。由于侯选校准品和病人样品间的基体差异以它的参考实验室定值对检测系统校准后检测系统对病人样品的检测结果必然和这些血清已有的参考值有偏倚。要使组成的检测系统实现校准目标唯一方法是调整侯选校准品的校准值。经反复检测和调整、统计最终实现校准目标时的校准值为该校准品的定值。这个校准品是公司的一级校准品是公司内部具有可溯源性的第一代的校准品不外售。)以后公司在生产供应给客户的校准品时生产质量规格相同于一级校准品定值方案也相同于上述步骤但此时分发给各实验室的一级校准品已具有了真正校准该检测系统的校准值。各实验室的检测系统被一级校准品校准后检测一级参考品血清和新校准品。首先确认各系统对一级参考品血清检测结果和原有的血清参考值具良好的可比性说明一级校准品有效。再以新校准品的定值去校准各系统后各系统再检测一级参考品血清和一级校准品观察检测结果。若能实现校准目标校准确认则新校准品的定值为它的校准值。在实践中血清结果往往仍然出现偏倚必须对新校准品的定值略作调整反复检测直至实现校准目标调整的最佳值为该批校准品的校准值。此时这批校准品可供市售。)为使公司供应的各批校准品间具可比性以后对每批新校准品定值时须使用已上市的校准品、即将过期的校准品、以及即将上市的校准品当作控制品随同一级校准品和一级参考品血清一起被检测。它们的检测结果须和原校准值的偏倚小于某规定的范围(如不大于)方可认可这批校准品的校准值(这即为校准认可的要求)。)用这样的程序制备的校准品专用于指定的某公司型号的仪器、试剂、方法和检测程序组成的检测系统。因此校准品只能为这样的系统服务起校准作用不能对其他系统作校准。.具多个校准值的校准品专门供应试剂盒的厂商为了使他们的试剂盒用于各种类型、型号的仪器和方法也同时为客户提供校准品。说明书告诉客户使用他们的校准品按公司指定校准您原系统的校准值去校准系统可以使新组合的检测系统(原仪器、方法、检测程序新试剂和新校准品)的病人标本检测结果和原配套检测系统的病人标本检测结果具可比性。由于各公司的原检测系统从试剂、校准品、仪器都有各自特点形成了各检测系统间的差异。而这类试剂厂商专门针对客户不同检测系统在替用他们的试剂时强调了替换后必须用他们的校准品而且必须按校准品说明书上原系统名称下指定的校准值校准新系统可使新系统对病人样品的检测结果和原系统结果具可比性。同一个校准品适用于不同系统必须有不同的校准值这样的做法充分说明校准值的专用特性。决不能一个校准品、一个校准值、一种试剂盒用于各种不同的仪器也不能一个校准品、一个校准值用于不同的、已具有原试剂配套的仪器系列无论哪一种方式均使病人样品的检测结果不可靠也不具有溯源性。第五章质控品标准品校准品校准品、标准品、质控品三者同为参考物质。参考物质是一种材料或者物质某一种或多种特性值只够均匀并被良好确定用于校准测量系统评价测量程序或为材料赋值。但三者并非用一个概念他们有各自不同的应用场合。临床上常常有很多错误的应用例如将不同厂商的校准品应用于检测系统使用给定值的质控品评价检测系统使用质控品来校准检测系统等等。本文内容详细介绍了校准品、标准品、质控品的来源及定值方式得出正确使用三种参考物质的方法。一、传统的方法的缺点  传统的检验项目要使得检验结果可靠或者有依据往往会使用一个已知浓度的标准品同样品一同测定。传统的标准液用纯水配制同血清相比成份非常简单除了待测物质外只有水了。此时在将样品同标准品相比较时引入了基质效应。  基质效应:检体中的非测定物质对测定量的影响。  换句通俗的话说也就是检体中测定物外的其他物质对检测的干扰使检测结果偏离真值。  此时通过同无基质效应的标准品比较得出的有基质效应的样品检测值将偏离于真值。  是否能使用标准液取决于检测方法学干扰极小的决定性方法或者某些已知干扰的参考方法可直接使用标准品。二、标准品的定值  一般而言检验工作中使用的标准品属应用标准。将符合质量标准的纯品使用称量法和容量法配制成溶液。用决定性方法反复测定结果在规定的范围内属合格。测定制的可靠性取决于鉴定方法分析方法的可靠性不如公认的称量法和容量法。标准品值由称量和容量法计算确定。决不可将实测值替代修正。三、引入校准品  为了克服纯标准品和病人样品间的基质差异年前开始应用具有与病人样品基质效应相似的校准品替代标准品用于日常工作。四、校准品的定值校准品来源:  校准品大多来源为人样品的混合物如混合血清。本身内含被检分析物植被时刻添加某些分析物增加含量。定值方法:  校准品中被检分析物的含量无法由称量法和容量法确定只能依赖于分析方法。校准品的校准值只能取决于分析方法和检测系统。但所有用于检验中的检测方法、仪器、试剂等都是用来监测病人的新鲜样品的不是用来监测校准品这样处理过的样品的。所有校准品都是处理过的样品和新鲜样品有着新的基质差异。若使用公认的参考方法去标化测定校准品测定程序是严格的测定只是可靠的但不是校准值。使用该测定值去校准常规的检测系统时校准品中的分析物被检测时的表现明显不同于新鲜病人样品不能将参考方法系列的准确度通过校准品传递给病人。  如先使用公认的参考方法检测病人样品再以具有参考值的病人样品去校准某检测系统。此时该检测系统在检测其他新鲜病人样品时这些病人样品结果的溯源性可上溯至公认的参考方法。也即用新鲜病人样品是校准系统的最佳校准品。但是具有参考值的新鲜病人样品无法用于常规工作所有方法、仪器、试剂或检测系统的校准只能依靠现有的校准品如何去确定校准品的校准值是关键。评级校准值可靠性的唯一要求是:被校准品校准后的检测系统对病人样品检测的检验结果和某些指定参考方法对病人样品的检验结果具可比性。  校准值不是测定值是纠正的调整值。一、校准品的专用性  在以往的应用中用户往往不注意校准品的应用的专用性任何方法或仪器、试剂使用一个校准品严重影响检验质量。从上面的校准品定值方法中我们可以知道只有在使用了和定值时相同的检测系统得出的结果才能同参考方法结果具可比性。二、质控品定值质控品的来源:  质控品的来源同校准品大致相同厂商可能会更具自己的要求添加了很多物质此时有些物质的添加量常常达到病理状态的高浓度在应用于某一项目时对这个项目来说基质效应将更大。 定值方法:  有些厂商会给自己的标准品定一个定值范围这个定值范围是由厂商联合几家使用同样检测系统的临床用户仅多次测定得出的均值。此时如果将该质控品应用于另一个检测系统由于方法学的不同可能得出同厂商给出值有较大差异的值。此时不能认为该检测系统的准确度不佳。此时需要强调的是检测系统都是用来测定新鲜血清的不是用来测定质控品或其他物质的。检测系统只有在检测新鲜血清是得出的结果才具有溯源性。不同检测系统之间只有在检测新鲜血清时才具可比性第六章日立全自动生化分析仪常见故障及处理日立A全自动生化分析仪是我院从日立公司购进的分析仪它具有准确度高、速度快、重复性好等特点是理想的生化分析仪在中国拥有很大的用户群。多年的使用过程中我们总结了一些故障及处理方法现介绍如下。故障一、SAMPLE(样品不足)当未放标本(或标本不足)标本中混有纤维蛋白或混有气泡时仪器会出现SAMPLE报警。处理:检查未放置的标本号重新放入(或补充标本量)混有纤维蛋白的样本必须再次离心以除去纤维蛋白混有气泡的标本吸去气泡。若仍不能排除纤维蛋白可能堵塞吸样针停机并用专用软钢丝疏通吸样针。故障二、REAGENT(试剂不足) 在测定过程中试剂针由于试剂不足或有气泡时没有检测到液面出现报警并停止该项目测定。处理:每日测定前加足量试剂和注意除去气泡进入REAGENTS菜单按Level作试剂量的检测以确定各试剂能满足每日检测需要。当出现此报警时须等仪器StandBy状态时进入REAGENTS菜单重新开启已封的试剂通道才能再次检测该项目。故障三、CELL(杯空白异常)反应杯水量不足 在仪器工作过程中清洗机构和清洗机构注入反应杯的水量不足引起杯洗不干净。处理:停机后取下清洗机构和清洗机构并放在gdl次氯酸钠液中在维护画面上选MechanismCleck再用清水冲洗。在取下清洗机构和清洗机构时要非常注意不要碰到旁边的小白块以免小白块移位后划伤和磨损反应杯。反应杯不干净 原因是D和D清洗液或HIALKLID碱液不足引起清洗不彻底。处理:加足量D和D清洗液和HIALKLID碱液。在维护画面上按CellDetergentPrime作清洗处理并作杯空白测定若反应杯脏污严重须将反应杯取出浸泡于gdlHIALKLID碱液中过夜用棉签沾上HIALKLID碱液轻轻擦拭再用清水充分清洗装上反应杯后再测杯空白若杯空白值仍过大时需要更换新的反应杯。反应槽水量不足或不干净反应槽换水后超过h。处理:在维护画面上按IncubatorWaterExchange执行反应槽换水。检查供水过滤网是否堵塞使相应反应槽水量不足。处理:停机后清洗过滤网。反应槽水不干净:由于长期使用细菌滋生使反应槽水不干净。处理:停机取出反应杯用HIALKLID碱液和脱脂纱布小心擦拭反应槽换水如此反复数次再开机使反应槽注满水(注意排空空气后再放入反应杯)。在维护画面上按Wash做清洗并做杯空白检测。光源灯老化 在nm处吸光度检查超过或光源灯使用超过h以上会造成光量偏离吸光度的测定范围在使用速率法分析时噪音会增多以致不能进行正确测定须更换光源灯泡。总之在平时使用过程中按仪器要求切实做好各种维护和保养工作会极大减少故障的发生。

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