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不同运动时间对2型糖尿病大鼠骨骼肌IRS_2蛋白含量及磷酸化的影响

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不同运动时间对2型糖尿病大鼠骨骼肌IRS_2蛋白含量及磷酸化的影响 中国运动医学杂志 2010年 5月第 29卷第 3期 Chin J Sports Med,May 2010,Vol.29,No.3 胰岛素 受 体 底物 -2 (insulin receptor substrate, IRS-2)是细胞质中的接头蛋白(Adaptor),主要连接胰岛 素受体(IR)和多种效应分子,从而介导细胞对胰岛素 (INS)等的反应[1]。随着基因剔除技术的发展,发现剔除 IRS-2 基因的纯合子动物 (IRS-2-/-) 具有 2 型糖尿病 (DM)的全部特征[2],因此 IRS-2 及活...

不同运动时间对2型糖尿病大鼠骨骼肌IRS_2蛋白含量及磷酸化的影响
中国运动医学杂志 2010年 5月第 29卷第 3期 Chin J Sports Med,May 2010,Vol.29,No.3 胰岛素 受 体 底物 -2 (insulin receptor substrate, IRS-2)是细胞质中的接头蛋白(Adaptor),主要连接胰岛 素受体(IR)和多种效应分子,从而介导细胞对胰岛素 (INS)等的反应[1]。随着基因剔除技术的发展,发现剔除 IRS-2 基因的纯合子动物 (IRS-2-/-) 具有 2 型糖尿病 (DM)的全部特征[2],因此 IRS-2 及活动规律成为近来 2 型 DM 研究的热点。运动是治疗 2 型糖尿病的主要非药 物手段,运动可提高胰岛素的敏感性和作用效果,由于 IRS-2 的特殊作用,运动对胰岛素的影响与 IRS-2 的介 导功能相关。有研究发现运动可提高 IRS-2 蛋白 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达和 磷酸化程度[3,4],但不同运动时间对 IRS-2 含量和磷酸 化的影响还不清楚。故本实验通过测定 2 型糖尿病大鼠 进行 8 周不同运动时间的跑台运动后骨骼肌 IRS-2 蛋 白含量及磷酸化变化,为 DM 运动疗法提供更科学的理 论指导。 1 材料与方法 1.1 动物 70 只健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重(200±16) g,雌雄不拘,由大连医科大学动物中心提供(许可证号: SCXK(辽)2004-0017)。在标准环境下常规分笼喂养,自 由饮水进食。适应性喂养 1 周后进行适应性训练。随机选 择 10 只大鼠为正常对照组,其余为实验组,制备 2 型糖 尿病大鼠模型。 1.2 实验方法 1.2.1 2 型糖尿病大鼠模型制备 参照洪丽莉等的方法制备模型[5]。实验组大鼠进行 4 周高脂饲料喂养,同时加 3%果糖饮水。 4 周后按 30mg/kg 体重的剂量一次性腹腔内注射 STZ(溶于 0.1 mmol/L 柠檬酸缓冲液,pH4.4)。注射后 1 周进行葡萄糖 耐量试验。方法为:大鼠禁食 4~6 小时,经腹腔注射葡 萄糖(2g/kg 体重),断尾采血测定 0、60 和 120min 时的血 糖。 DM 诊断标准为连续 2 次空腹血糖 (FGB)≥ 7.8mmol/L 或葡萄糖负荷后 2h 血糖≥11.1mmol/L[6]。此 方法造模成功率达 85%。2 周后,大鼠禁食 12h 后,断尾 取血,用罗氏试纸测大鼠空腹血糖(FBG),同时检测空腹 胰岛素(FINS)。 高热量饲料配方:100kg 大鼠基础饲料中加人全蛋 粉 6kg(大连生化制品有限公司生产)、蔗糖 23kg(广西糖 业集团销售有限公司生产)、炼猪油 26.5kg(河北石家庄 制造),混和成形,烤干成 150kg。其总热量为 20.083J/g, 即 4.80CaUg,其中蛋白质占 15%,碳水化合物占 51%,脂 肪占 25%。 1.2.2 糖尿病大鼠运动 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 将符合标准的 50 只糖尿病大鼠随机分为糖尿病对 照组和糖尿病运动组(20min 组、40min 组、60min 组和 80min 组),并继续高脂饲料喂养。各糖尿病运动组运动 强度参照 Soya 等的实验[7],以 20m/min 进行 8 周跑台运 动。运动时间分别为每天 20min、40min、60min 和 80min。 对照组常规饲养。本实验动物的处置符合国际实验动 物伦理学要求。 华宏 1 王耀光 1 郭仁勇 2 1 辽宁师范大学体育学院(大连 116029) 2 辽宁师范大学生命科学学院 不同运动时间对 2 型糖尿病大鼠骨骼肌 IRS-2 蛋白含量及磷酸化的影响 摘要 目的:探讨不同运动时间对 2 型糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体底物-2(IRS-2)蛋白含量及 磷酸化的影响。方法:采用高脂饲料喂养和腹腔内注射 STZ 制备糖尿病大鼠模型。将符合标准的 50 只糖尿 病大鼠随机分为糖尿病对照组和糖尿病运动组(20min 组、40min 组、60min 组和 80min 组),并继续高脂饲料 喂养。另取 10 只正常 SD 大鼠为正常对照组。各糖尿病运动组以 20m/min 的强度进行 8 周不同时间的跑台运 动。采用 Western blot 免疫印迹法检测各组大鼠骨骼肌 IRS-2 蛋白含量及磷酸化程度。结果:与糖尿病对照组相 比,20min 组、40min 组、60min 组和 80min 组大鼠股四头肌 IRS-2 蛋白含量分别升高 11.7%、12.4%、12.2%和 11.9%(P <0.01);与 20min 组及 80min 组相比,40min 组 IRS-2 蛋白含量分别升高 10.9%和 10.7%(P <0.05)。 与糖尿病对照组相比,20min 组、40mmin 组、60min 组和 80min 组大鼠股四头肌 IRS-2 磷酸化分别升高 11.2%、 12.7%、12.2%和 11%(P<0.05 和 P<0.01);与 20min 和 80min 组比,40min 组和 60min 组 IRS-2 磷酸化水平分 别升高 11.3%、11.5%(P<0.01)和 10.9%、11.1%(P<0.05)。但各组仍未恢复到正常对照组水平。结论:不同运 动时间对 2 型糖尿病大鼠骨骼肌 IRS-2 蛋白含量和磷酸化产生不同的影响,以 40min 效果最好。 关键词 不同运动时间;2 型糖尿病大鼠;骨骼肌;IRS-2 磷酸化 基金项目:辽宁省教育厅自然科学基金资助课题(20060474) 通信作者:王耀光,Email:yaoguangw@163.com 335· · 中国运动医学杂志 2010年 5月第 29卷第 3期 Chin J Sports Med,May 2010,Vol.29,No.3 1.2.3 取材和指标测定 各组大鼠运动后即刻腹腔内注射 3%戊巴比妥钠 (50mg/kg 体重)麻醉,取后肢股四头肌肉组织,置于液氮 中,待提取蛋白质。 称取骨骼肌 100mg,剪碎后置于组织匀浆液 600μl (2%SDS,50mmol/L Tris-HCl,pH6.8,10%甘油,1mmol/L Na3VO4,1mmol/L PMSF,5g/L Leupeptin)中,采用 Poly tron PT10-35 组织扩散仪制备组织匀浆(7000~10000g)。 所得匀浆置于 4℃、10000g 离心 10min,取上清液,采用改 良 Lowery 法测定蛋白浓度[8],以备上样。 1.2.4 IRS-2 蛋白表达测定 采用 Western blot 免疫印迹法。取含等量总蛋白 (50μg)的样品,经 7.5%SDS-PAGE 分离,电转膜后以 5% 脱脂奶粉封闭,再分别与兔抗人 IRS-1 和 IRS-2 多克隆抗 体反应,继而与辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗作用,以 增强化学发光法(ECL)显示蛋白条带,并用激光光密度 扫描仪测定蛋白条带光密度。 1.2.5 IRS-2 蛋白磷酸化的测定 采用免疫沉淀及增强化学发光法。取含等量总蛋白 (500μg)的样品,与抗 IRS-2 抗体 4℃孵育过夜。抗原-抗 体复合物经固相化蛋白 G 沉淀后,重新溶解于 Laemmli 上样缓冲液,加热到 95℃ 5min,经 7.5%聚丙烯酰氨凝 胶电泳 1.5h。抗-磷酸化酪氨酸免疫印迹,醋酸纤维薄 膜直接与辣根过氧化物酶结合的一抗 APY20H 孵育 1.5h。充分洗涤后与 ECL 反应 1min,即刻 X 线片曝光, 洗片后用 Leica Q550-IW 图像分析仪(德国)进行扫描, 计算光密度。 以正常对照组的 IRS-2 蛋白含量和磷酸化为 100 作 为标准,计算其他各组的相对量。 1.2.6 试剂与仪器 IRS-2 多克隆抗体够自 R&D Systems 公司,ECL 购 自英国 Amersham 公司。预染蛋白 Marker 购自 New England BioLabs。血糖(FBG)用快速血糖仪检测,仪器及 试纸由美国强生公司生产。胰岛素(FINS)用放射免疫法 检测,试剂盒由南京生物工程研究所提供,批内 CV<3%, 批间 CV<5%。甘油三酯(TG)试剂盒:北京福瑞生物工程 公司生产,批号:040702。总胆固醇(Tc)试剂盒:北京福 瑞生物工程公司生产,批号:040702。动物跑台由北京硕 林苑科技有限公司生产,型号为 SLY-RTML 六跑道大鼠 跑台。 1.3 统计学分析 采用 SPSS11.0 软件包对实验数据进行统计处理,以 均数±标准差表示,组间显著性差异比较采用单因素方 差分析(ONE-WAY ANOVA),多重比较采用 LSD 法。显 著性水平 α 为 0.05。 2 结果 表 1 显示,与正常对照组相比,糖尿病大鼠体重明 显增加(P <0 .01),血清甘油三酯和总胆固醇水平也明 显升高(P <0 .01),同时血糖和胰岛素水平明显升高 (P <0 .01)。 表 2 显示,与对照组相比,糖尿病对照组股四头肌 IRS-2 蛋白含量下降 41%(P <0.01)。与糖尿病对照组相 比,运动 20min 组、40mmin 组、60min 组和 80min 组分别 升高 11.7%、12.4%、12.2%和 11.9%(P<0.01)。与 20min 组及 80min 组相比,40min 组 IRS-2 蛋白含量分别升高 10.9%和 10.7%(P <0.05)。但各组仍未恢复到正常对照 组水平。 与对照组相比,糖尿病对照组股四头肌 IRS-2 磷酸 化水平下降 49%(P<0.01)。与糖尿病对照组相比,运动 20min 组、40mmin 组、60min 组和 80min 组分别升高 11.2% 、 12.7%、12.2%和 11%(P<0.05 和 P<0.01)。与 20min 组和 80min 组比,40min 组和 60min 组分别升高 11.3%、11.5% (P<0.01)和 10.9%、11.1%(P<0.05)。但各组仍没有恢复 到正常对照组水平。 3 讨论 根据 Soya 对运动强度的确定依据,20m/min 相当于 LT(乳酸阈)强度,LT 为有氧代谢向无氧代谢的转折点, 相当于 4mmol/L 血乳酸浓度,当运动强度高于 LT 时,机 体的代谢开始转向无氧代谢。LT 已经成为有氧健身锻炼 和康复训练的一个强度标准。美国运动医学会(ACSM) 和美国糖尿病协会(ADA)运动锻炼方案:运动与糖尿病 专业指南[9]也将 LT 强度列为糖尿病康复锻炼推荐的上 限强度。 IRS-2 主要连接胰岛素受体(IR)和多种效应分 子[10]。INS与 IR结合后,IR的 β亚基近膜区酪氨酸(Tyr)自 身磷酸化并且与 IRS-2 结合,IR 上激活的酪氨酸蛋白激 酶(PTK,IR-TK)催化 IRS-2 上多个 Tyr 磷酸化,为下游 含 SH2 区的蛋白提供位点,形成信号蛋白复合物,以介 导进一步的信号传导[11,12]。Park 等的研究发现,运动可 表 1 造模成功后两组大鼠体重、血糖、血脂和胰岛素水平 正常组(n=10) 糖尿病组(n=50) 体重(g) 292±15 382±17* 血糖(mmol·L-1) 4.57±0.49 11.74±3.95* 胰岛素(mU·L-1) 15.25±2.62 33.82±1.68* 血清甘油三酯(mmol·L-1) 0.85±0.21 1.51±0.36* 总胆固醇(mmol·L-1) 1.81±0.16 2.68±0.69* 注:*P <0.01,与正常对照组相比。 表 2 各组大鼠股四头肌 IRS-2 蛋白含量及磷酸化比较 组别 n IRS-2蛋白含量 IRS-2磷酸化 对照组 10 10.0±0.21 10.0±0.24 糖尿病对照组 10 5.9±0.39# 5.10±0.45# 糖尿病运动组 20min组 10 6.9±0.45◎ 5.72±0.47◎ 40min组 10 7.53±0.48◎*○ 6.49±0.58◎**○○ 60min组 10 7.30±0.59◎ 6.23±0.54◎*○ 80min组 10 7.02±0.57◎ 5.62±0.59◎ 注:#P <0.01:与对照组相比;◎P <0.01:与糖尿病对照组相比; *P <0.05,**P <0.01:与 20min 组相比;○P <0.05,○○P <0.01:与 80min组相比。 336· · 中国运动医学杂志 2010年 5月第 29卷第 3期 Chin J Sports Med,May 2010,Vol.29,No.3 提高 IRS-2 蛋白含量和磷酸化程度[13-15],但这些实验均 采用单一固定时间,不同运动时间对 IRS-2 蛋白含量和 磷酸化影响的研究还未见报道。本实验结果显示,8 周运 动后,与糖尿病对照组相比,运动组大鼠骨骼肌 IRS-2 蛋 白含量显著增加,不同运动时间效果不同,并且 IRS-2 磷 酸化的作用效果也存在差异,以运动 40min 效果最好。由 于此类研究才刚开始,还需进一步探索。 4 参考文献 [1]Domimic JW,Julio SG,Heather T,et al. Disruption of IRS-2 causes type 2 diabetes in mice. Nature,1998,391:900-904. [2]Stefan N,Kovacs P,Stumvoll M,et al. Metabolic effects of the Gly1057Asp polymorphism in IRS-2 and interactions with obesity. Diabetes,2003,52:1544-1550. [3]Arai T,Hashimoto H,Kawai K,et al. Fulminant type 1 di- abetes mellitus observed in insulin receptor substrate 2 deficient mice. Clin Exp Med,2008,8(2):93-99. [4] Kubota N,Kubota T,Itoh S,et al. Dynamic functional re- lay between insulin receptor substrate 1 and 2 in hepatic insulin signaling during fasting and feeding. Cell Metab, 2008,8(1):49-64. [5]洪丽莉,许冠荪,申国明,等. SD大鼠 2型糖尿病模型的建 立. 中国比较医学杂志,2005,15(6):379-381. [6]郭啸华,刘志红,李恒,等 . 实验性 2 型糖尿病大鼠模型的 建立. 肾脏病与透析肾移植杂志,2000,9(4)351-355. [7] Soya H,Mukai A,Deocaris CC,et al. Threshold-like pat- tern of neuronal activation in the hypothalamus during treadmill running:establishment of a minimum running stress(MRS) rat model. Neurosci Res,2007,58(4):341-348. [8] Lowery OH,Rosebrough HJ,Farr AL,et al. Protein mea- surement with the folinphenol reagent. J Biol Chem, 1951,193:265-275. [9]Anomymous. ADA/ACSM:Diabetes mellitus and exercise Joint position paper. Med Sci Sports Exerc,1997,29:1-6. [10] Lothar V,Wojciech W,Ludger KH,et al. Human insulin receptor substrate-2 gene organization and promoter char- acterization. Diabetes,1999,48:1877-1880. [11]Bouzakri K,Zachrisson A,Al-Khalili L,et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in hu- man skeletal muscle. Cell Metab,2006,4(1):89-96. [12]Lima MH,SouzaL C,Caperuto LC,et al. Up-regulation of the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B path- way in the ovary of rats by chronic treatment with hCG and insulin. J Endocrinol,2006,190(2):451-459. [13]Park S,Hong SM,Lee JE,et al. Chlorpromazine attenu- ates pancreatic beta-cell function and mass through IRS2 degradation,while exercise partially reverses the attenua- tion. J Psychopharmacol,2008,22(5):522-531. [14] Park S,Hong SM,Sung SR. Exendin-4 and exercise pro- motes beta-cell function and mass through IRS2 induc- tion in islets of diabetic rats. Life Sci,2008,82(9-10): 503-511. [15] Park S,Hong SM,Lee JE,et al. Exercise improves glu- cose homeostasis that has been impaired by a high-fat diet by potentiating pancreatic beta-cell function and mass through IRS2 in diabetic rats. J Appl Physiol, 2007,103(5):1764-1771. (2009.10.09收稿) (上接第 294 页) !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! [4]Thomas DP,Marshall KI. Effects repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures. Int J Sports Med,1988,9(4):257-260. [5]王岚峰,修春红,李丹,等. 急性心肌梗死后心肌微循环障碍 与炎症反应的关系. 中华超声影像学杂志,2008,17(8):106. [6]占成业,潘李莉,等. 高血压左室肥厚时细胞间黏附分子 -1在 心肌中的表达及其作用 . 中华急诊医学杂志,2005,14(1): 47-50. [7]赵敬国. 大鼠力竭性游泳过程中心率变异性的动态观察. 山 东体育科技,2000,22(4):27-35. [8]Kukielka GL,Hawkins HK,Michael L,et al. Regulation of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in ischemican dreperfused canine myocardium. J Clin Invest,1993,92(3): 1504-16. [9]Fan H,Sun B,Gu Q,et al. Oxygen radical strigge reactiva- tion of NF-kappaB and AP-1 and up-regulation of ICAM-1 in reperfused canine heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002,282(5):1778-1786. [10]Davani EY,Dorscheid DR,Lee CH,et al. Novel regulatory mechanism of cardiomyocyte contractility involving ICAM-1 and the cytoskeleton. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004,287(3):1013-1022. [11]吴弘,沈茜,郎希龙,等. 细胞粘附分子在中性粒细胞介导 的缺氧 / 复氧心肌细胞损伤中的作用 . 中国应用生理学 杂志,2001,17(3):27-229. [12]毛宗珍,李恩荆,葛新发. 运动对大鼠心肌 ICAM-1表达与 超微结构的影响. 武汉体育学院院报,2004,18(6):64-67. [13]Lee JR,Han JJ,Seo JW. Correlation between ICAM-1 and functional recovery of piglet myocardium with leukovyte- depleted reperfusion. Ann Thorac Surg,2000,70:1531-35. [14] Palazzo AJ,Jones SP,Girod WG. Myocardial ischemi- a-reperfusion injury in CD-18 and ICAM-1-deficient mice. Am J Physiol,1998,275(6pt2):2300-2307. (2010.02.11收稿) 337· ·
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