昆虫RNAi技术及其应用

昆虫 RNAi 技术及其应用 3 何正波33 　陈 　斌 　冯国忠 (重庆师范大学生命科学学院 昆虫与分子生物学研究所　重庆　400047) RNA interference and its application in Entomology. HE Zheng2Bo33 , CHEN Bin , FENG Guo2Zhong ( Institute of Insect & Molecular Biology , College of Life Science , Chongqing Normal University , Chongqing 　400047 , China) Abstract 　RNAi is a new technology for inhibiting gene expression in diverse organisms in recent years. The RNAi effect could spread from cells to cells in some insects , which induce the targeted gene specifically silenced in other tissues by introducing dsRNA into embryos , cavity or partial tissues. As a result , several methods of RNAi in insects have been reported , such as embryo RNAi , larval RNAi , adult RNAi , parental RNAi , feeding RNAi and heritable RNAi based on transgenic technique. These techniques have become widely used tools to knock down gene expression and analyze gene function , especially in non2model insects which the systematic recovery of mutants is not feasible. This paper focused on the systemic gene silencing of RNAi , RNAi technology and its applications in Entomology. Key words 　RNAi , systemic gene silencing , insect , application 摘 　要 　RNAi 是近几年发展起来的抑制基因表达的新技术。部分昆虫存在 RNAi 信号的系统性传播现 象 ,可以将 dsRNA 直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织 ,引发远距离靶基因的特异性沉默 ,建立起了 Embryo RNAi , Larval RNAi , Adult RNAi , Parental RNAi , Feeding RNAi 和基于转基因技术的可遗传 RNAi 等 昆虫 RNAi 技术 ,使 RNAi 迅速成为了研究昆虫尤其是非模式昆虫基因功能的主要方法。文章拟就 RNAi 的系统性、昆虫 RNAi 技术及其应用进行综述。 关键词 　RNAi , 系统性基因沉默 , 昆虫 , 应用 3 国家自然科学基金项目 (编号 :30700435) , (编号 :30870340) 和重庆市自然科学基金项目 (编号 :2007BB1227) 。33 E2mail :zhengbohe @yahoo. com. cn 收稿日期 :2008208229 ,修回日期 :2008211203　　RNA 干扰 ( RNA interference ,RNAi) 现象是指内源性或外源性双链 RNA ( double - strandedRNA ,dsRNA)介导的细胞内 mRNA 发生特异性降解 ,导致靶基因的表达沉默 ,产生相应的功能表型缺失[1 , 2 ] 。其发现可追溯到 1990 年 ,Napoli等向矮牵牛中导入更多拷贝与粉红色色素合成有关的基因以产生颜色更深的紫色矮牵牛花 ,结果许多花朵的颜色不但没有加深 ,反而变成白色或花白色[3 ] 。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制 ,所以被称为共抑制(co2suppression)现象。这种共抑制现象被确认是发生在转录后水平 ,所以又被称为转录后基因沉默 (post2transcriptional gene silencing ,PTGS) 。随后发现在真菌中的消除 (quelling)现象以及动物的 RNA 干扰现象都属于转录后基因沉默现象。dsRNA 介导的 RNAi 现象陆续发现于真菌[4 ] 、果蝇[5 ] 、植物[6 , 7 ] 、锥虫[8 ] 、水螅[9 ] 、涡 虫[10 ] 、斑马鱼[11 , 12 ] 、大小鼠[13 , 14 ]等多种生物中。在植物和线虫中 ,RNAi 信号能在细胞与细胞之间传播 ,引发多数组织细胞或全身性的RNAi 效应称为系统性基因沉默 ( systemic genesilencing) 。大多数昆虫也存在 RNAi 信号的系统性传播现象 ,可以将 dsRNA 直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织 ,引发远距离靶基因的特异性沉默。基于此 ,开发出了直接注射或饲喂dsRNA 的适用于卵、幼虫、蛹及成虫各发育阶段的昆虫 RNAi 技术。有关 RNAi 现象的发现、RNAi 作用的机制和特点等方面已经有很多综述 ,本文拟就 RNAi 的系统性、昆虫 RNAi 技术及其应用进行综述。 ·525·2009 46 (4) 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 　 1 　RNAi 的系统性 RNAi 效应的系统性传播首先发现于植 物[15～17 ] 。植物 RNAi 系统性沉默的主要功能被 认为能在整个植物体转移病毒抗性 ,阻断病毒 进一步感染[18 ] 。在线虫 Caenorhabditis elegans 中 dsRNA 效应能扩散到未直接导入 dsRNA 的 组织中[1 ] 。给线虫喂食能够产生 dsRNA 的大 肠杆菌 ,不仅能在喂食的线虫本身产生强有力 的 RNAi 应答 ,而且在其后代亦可以产生应 答[19 ] 。某些昆虫也具有系统性基因沉默的现 象[20 ] ,例如直接将 dsRNA 注射到赤拟谷盗 Tribolium castaneum 的血腔 ,可以引起远距离甚 至子代基因的沉默[21 ,22 ] 。奇怪的是果蝇的 RNAi 却不具有系统性 ,不能全身性传递也不能 传递给子代[20 ,23 ,24 ] ,除卵母细胞外其余组织或 细胞也不能从胞外吸收 dsRNA[25 ] 。 RNAi 效应的系统性传播分为 2 个阶段 : dsRNA 的细胞吸收和 RNAi 效应的传播。 Winston 等通过诱变获得了 C. elegans 一种突 变体 ,RNAi 仅在咽部起作用 ,而不能向临近细 胞扩散。他们从这种突变体中鉴定了 3 个具有 系统性 RNAi 缺失 ( systemic RNA interference deficient ,SID) 的基因 ,分别命名为 sid21、sid22 和 sid23 ,并对 sid21 进行了深入研究[26 ] 。生物 信息学分析表明 , sid21 基因编码 1 个 776 个氨 基酸的疏水性蛋白 ,是一种跨膜蛋白 ,其结构包 括 1 个信号肽序列和 11 个可能的跨膜结构域。 用 gfp 作 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因发现 SID2GFP 融合蛋白主要 集中在膜上 ,可能作为细胞吸收 dsRNA 的膜通 道[19 , 23 , 26 ,27 ] 。果蝇中没有 sid21 基因的同源物 , 将 sid21 基因转入果蝇 S2 细胞 ,发现转基因的 S2 细胞具有从培养液中摄取 dsRNA 的能力 ,而 且其摄取效率与 dsRNA 的长度呈正相关 ,说明 SID21 蛋白与 dsRNA 的细胞吸收有关[23 ] 。通过 sid21 基因在线虫培养细胞中超表达的嵌合分 析进一步证实 SID21 蛋白参与体细胞和种系细 胞的 dsRNA 吸收[23 , 26 ] 。Tijsterman 等在研究 C. elegans 系统性 RNAi 分子机制时 ,通过遗传突 变的方法筛选到 30 个与系统性 RNAi 有关的突 变并将其分为 5 个互补群 : rsd2 , rsd3 , rsd4 , rsd6 和 rsd8 , 即 RNAi 传播缺失 ( RNAi spreading defective) ,分析发现 rsd8 与 Winston 等发现的 sid 基因为同一个基因 , Rsd2 ,Rsd3 和 Rsd6 与 种系细胞中的系统性 RNAi 效应有关 ,而与体 细胞的系统性 RNAi 效应无关[28 ] 。 Tomoyasu 等在 T. castaneum 基因组中发现 了与线虫 sid21 基因类似的 3 个基因 ,然而通过 序列分析发现这 3 个基因与线虫的 tag2130 基 因具有很高的同源性 , tag2130 基因与线虫的 RNAi 系统性传播无关 ,说明昆虫系统性 RNAi 的机理可能与线虫不一样[20 ] 。 2 　RNAi 在昆虫中应用的方法 211 　dsRNA合成 siRNA 和长 dsRNA 都能高效、特异地诱导 昆虫 RNAi 效应 ,但 siRNA 的设计和筛选比较费 时费力 ,因此在昆虫中通常用体外转录的长 dsRNA 来诱导 RNAi。 siRNA 可以通过化学合成法、体外转录法、 RNase Ⅲ酶切 dsRNA 法、构建 siRNA 表达载体法 和 siRNA 表达框法等方法来制备。 长 dsRNA 可以通过酶促法来制备 ,酶促法 几乎可以制备任何长度的 dsRNA。它采用依赖 DNA 的 RNA 聚合酶从 DNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 合成正义链和 反义链 RNA。这些 RNA 聚合酶不能从头启动 RNA 链合成 ,相反 ,它们从模板 DNA 内的启动 子序列处启动 RNA 合成。从 5′向 3′方向链的 延长受到与模板 DNA 碱基配对的控制 ,一直达 到模板 DNA 分子的 3′端为止。然后进行退火 , 使互补 RNA 链的碱基配对成 dsRNA。有 2 种 酶促法合成 dsRNA 的实验方法 :一是采用含有 原核 RNA 聚合酶启动子的质粒 DNA 作为模 板 ;二是在 PCR 引物的 5′端加上噬菌体 T7、T3 或 SP6 启动子序列 ,PCR 扩增获得 DNA 片段作 为模板。用噬菌体 T7、T3 或 SP6 RNA 聚合酶合 成 RNA。第 2 种方法快速 ,适合于各种模板 ,已 成为酶促合成 dsRNA 的首选方法[18 ] 。 212 　dsRNA的递送方法 将 dsRNA 导入昆虫培养细胞系中 ,可采用 ·625·　 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 2009 46 (4) 细胞转染 ,也可以直接将 dsRNA 加入培养液中 使细胞吸收[29 ,30 ] 。 将 dsRNA 导入培养器官的原代细胞中的 方法是细胞加载技术 ,该技术基于胞饮小泡的 渗透性裂解[31 ] 。已经证实这种方法能快速有 效地沉默剥离幼虫唾液腺细胞中的基因表 达[32 ] 。 将 dsRNA 导入胚胎的方法有 2 种 :一是通 过显微注射将 dsRNA 注入胚胎中 ;二是用基因 枪将包裹 dsRNA 的金粉轰击入胚胎中[18 ] 。如 果在细胞化之前导入 dsRNA ,这 2 种技术都能 使整个生物体产生很好的 RNAi 现象。 将 dsRNA 导入幼虫、蛹或成虫的血腔可以 用注射器或显微注射仪直接注射。 213 　昆虫 RNAi 的策略 21311 　Embryo RNAi 　Embryo RNAi 是将 dsRNA 显微注射到胚胎中 ,诱导昆虫胚胎、幼虫 或成虫期表达的基因发生特异性沉默。dsRNA 胚胎显微注射是一种非常有效的方法 ,主要用 于卵容易收集、易于微注射、易存活的一些模式 昆虫 ,主要用于研究昆虫发育早期的基因[33 ,34 ] 。 但显微注射使卵的存活率降低 ,容易产生人为 损伤[20 ] 。某些昆虫 ,例如果蝇 , dsRNA 的显微 注射容易产生基因敲除的嵌合体模型或死表 型 ,给基因功能的分析带来困难[20 ,35 ] 。 21312 　Parental RNAi 　直接将 dsRNA 注射到 昆虫蛹或成虫的血腔 ,引起胚胎发育过程中的 基因发生特异性沉默的方法称为 parental RNAi [21 ] 。Bucher 等将 dsRNA 从 T. castaneum 腹部 3～4 节的节间膜直接注射到雌蛹的血腔 里 ,在产下的第一个卵块里 ,几乎 100 %的胚胎 表现出了特异的 RNAi 表型 ,在随后产的卵块 里 RNAi 表型的比例逐渐下降 [21 ] 。Parental RNAi 方法主要用于昆虫胚胎发育过程中的基 因功能研究 ,该方法为一些卵不易获得或卵在 显微注射后不易存活昆虫的基因功能研究提供 了一种行之有效的方法 ,而且操作简单 ,周期 短 ,成本低。因此 ,parental RNAi 迅速成为了研 究昆虫尤其是非模式昆虫基因功能的主要方 法 ,已经用于许多昆虫的基因功能研究 ,如 Oncopeltus f asciatus , Gryllus bimacculatus , Platynereis dumerilii , Apis mellifera , Hyalophora cecropia , T. castaneum , Nasonia vitripennis 和 Locusta migratoria manilensis 等[36～42 ] 。 21313 　Larval RNAi 　直接将 dsRNA 注射到昆 虫幼虫或若虫的血腔 ,引起胚后发育过程或成 虫期的基因发生特异性沉默的方法称为 larvae RNAi [22 ] 。Tomoyasu 等将 gfp 的 dsRNA 注射进 一龄或末龄赤拟谷盗 pull 幼虫的血腔里 ( pull 是赤拟谷盗的一个 gfp 转基因品系) , gfp 的表 达被沉默 ,而且 RNAi 的作用能够持续到成虫 期。他们还按相同方法注射了成虫体表刚毛形 成 基 因 Tc2achaete2scutehomolog ( Tc2ASH ) 的 dsRNA ,结果发现整个成虫体表都没有形成刚 毛 ,说明 larvae RNAi 作用既具有持续性又具有 系统性 ,可以用于研究幼虫期和成虫期的基因 功能[22 ] , 并运用于其它昆虫的基因功能研 究[43～45 ] 。 Embryo RNAi 和Larvae RNAi 都可以用于昆 虫幼虫期和成虫期基因功能的研究。Amdam 等在研究只在蜜蜂成虫期表达的卵黄蛋白原基 因时比较了这 2 种方法 ,他发现用 Embryo RNAi 方法时仅有 15 %的成虫表现出了表型 ,而用 Larvae RNAi 时有 95 %的成虫表现出了表型。 说明在研究昆虫成虫期表达的基因时 Larvae RNAi 较 Embryo RNAi 更有效[46 ] 。 21314 　Adult RNAi 　直接将 dsRNA 注射到昆 虫成虫的血腔 ,引起成虫基因发生特异性沉默 的方法称为 adult RNAi [47 ] 。Dzitoyeva 等将 LacZ 基因的 dsRNA 注射到 LacZ 转基因果蝇成虫的 血腔里 ,使在肠道和中枢神经系统中表达的 LacZ 基因被沉默 ,证实 adult RNAi 能够用于果 蝇成虫的基因功能研究[47 ] 。随后他们用此方 法成功抑制了果蝇γ2氨基丁酸 ( GABA) 受体的 表达 ,为深入研究γ2氨基丁酸受体和酒精上瘾 的关系建立起了一个模式系统[48 ] 。Adult RNAi 还被用于特异性地抑制在蚊子唾液腺和脂肪体 等组织中表达的基因 ,为研究和防治病原体的 传播开辟了一条新的途径[49 ,50 ] 。 21315 　Feeding RNAi 　除了直接注射 dsRNA ·725·2009 46 (4) 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 　 外 ,还可以通过饲喂 dsRNA 的方法诱导昆虫的 RNAi。在线虫中 ,饲喂能表达 dsRNA 的细菌可 以有效抑制子代胚胎中的目标基因[1 ,19 ,51 ] 。给 苹浅褐卷蛾 Epiphyas postvittana 幼虫直接饲喂 dsRNA 溶液 ,在饲喂后的 2 d 时间之内肠道中 的羧酸酯酶表达水平下降了一半还多 ;羽化后 的前 2 d 内触角中的信息素结合蛋白表达水平 也明显下降[52 ] 。将蜜蜂雷帕霉素靶蛋白 (target of rapamycin , amTOR) 的 dsRNA 加到饲料里 ,饲 喂蜜蜂幼虫 ,可以使 amTOR 的表达水平下降 2 倍 ,导致蜜蜂幼虫不能发育成为蜂王而呈现工 蜂的形态特征 ,说明 amTOR 在蜜蜂的形态分化 中可能起着重要的作用 [53 ] 。Mao 等用表达 P450 基 因 dsRNA 的 棉 花 饲 喂 棉 铃 虫 Helicoverpa armigera 后 ,棉铃虫 P450 基因的表 达显著降低[54 ] 。Baum 等对玉米进行基因改 造 , 使 其 表 达 以 玉 米 根 萤 叶 甲 Diabrotica virgifera virgifera Leconte 的一种关键酶为靶子的 小 RNA ,结果表明 ,取食经过基因改良的玉米 能够抑制靶标基因的表达[55 ] 。 21316 　可遗传的 RNAi 　向培养的昆虫细胞转 染或直接向昆虫注射体外合成的 dsRNA ,虽然 可以特异性的抑制目的基因的表达 ,抑制效应 可以持续一段时间 ,甚至可以传给子代细胞或 昆虫 ,但最后抑制效应仍会消失 ,不能稳定遗 传 ,也不能实现组织特异性的抑制 ,而基于转基 因技术的 RNAi 则可以避免这些不足。用异源 的内含子做间隔子 ( spacer) 将拟干扰的目标基 因构建成反向重复序列 ,利用 GAL4ΠUAS 转基 因系统或 piggyBac、P 因子等转座载体在一定条 件下进行表达 ,产生发夹环状 dsRNA ,从而获得 可遗传的效果 ,但这种方法局限于黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 等转基因体系比较成熟 的昆虫[56～61 ] 。GAL4ΠUAS 转基因系统可以实现 基因表达的组织特异性抑制 ,用热击蛋白等条 件性启动子可以实现 RNAi 的时间特异性。 3 　RNAi 技术在昆虫研究中的应用 311 　研究基因功能 与其他方法相比 ,RNAi 技术在基因功能研 究上有其独特的优点。一是简单易行 ,容易开 展 ;二是与基因敲除相比 ,实验周期短 ,成本低 ; 三是与反义技术等相比 , RNAi 的沉默效率更 高 ,效果更好 ;四是可进行高通量基因功能分 析 ;五是 RNAi 具有高度的特异性 :它可以用于 研究单基因功能或基因家族或具有高度相似性 的一组基因中的单个基因的功能 ,还可以同时 敲除基因家族中几个相关基因 ,从而解决由于 多个基因的功能冗余而造成的难以检测到单个 基因突变表型的问题[62 , 63 ] 。RNAi 技术的上述 诸多优点使其成为研究基因功能的强有力的反 向遗传学工具。 最早应用 RNAi 进行基因功能分析的报道 是 Subramaniam 等运用 RNAi 方法发现了 C. elegans 内 3 个与 nanos 同源的基因共同维持生 殖细胞的活力[64 ] 。随即 , RNAi 技术成为基因 功能研究的主要方法 ,极大地推动了基因组学 的发展。 目前已有多个实验室运用 RNAi 技术对模 式生物进行大规模的基因组筛选。用 RNAi 技 术进行功能基因组的筛选 ,其基本原理是根据 基因测序结果 ,针对每个基因设计对应序列的 dsRNA ,构建基因组的 RNAi 文库 ,将文库中不 同序列的 dsRNA 分别导入不同个体或细胞内 , 通过表型上的改变筛选相关基因并由此大致确 定基因功能。随着越来越多的昆虫基因组测序 工作的完成 ,RNAi 文库技术必将开辟昆虫功能 基因组研究的新篇章。 312 　用于信号传导通路的研究 综合利用传统的缺失突变技术和 RNAi 技 术可以确定复杂信号传导途径中不同基因的上 下游关系[65 ] 。Clemens 等应用 RNAi 研究了果 蝇细胞系中胰岛素信号传导途径 ,取得了与已 知胰岛素信号传导通路完全一致的结果 ,在此 基础上他们还分析了 DSH3PX1 与 DACK之间 的关系 ,证实了 DACK是位于 DSH3PX1 磷酸化 的上游激酶[66 ] 。与其它技术相比 , RNAi 具有 较强的优势 ,将可能成为昆虫细胞信号转导通 路研究的重要方法。 313 　害虫控制 ·825·　 昆虫知识 　Chinese Bulletin of Entomology 2009 46 (4) 以注射或饲喂 dsRNA 的方式都能特异抑 制昆虫基因的表达 ,使昆虫的生长发育受阻或 致死 ,因此 RNAi 在害虫的防治中具有潜在的 应用 价 值。Mao 等 以 棉 花 和 棉 铃 虫 H. armigera 为研究对象 ,分离了棉铃虫参与棉毒 素解毒的 P450 基因 ,用表达相应 dsRNA 的转 基因植物喂食后 ,棉铃虫 P450 基因的表达显 著降低 ,对棉酚的耐受性大大减弱。再用含有 棉酚的饲料或棉花叶片喂食 ,这些棉铃虫生长 缓慢 ,甚至死亡[54 ] 。Baum 等对玉米进行了基 因改造 ,使其表达以玉米根萤叶甲 D . virgifera virgifera 的一种关键酶为靶子的小 RNA ,结果表 明 ,经过基因改良的玉米根部遭受的破坏要比 未改良的少 50 %[55 ] 。这种以 RNAi 技术的创新 性应用为基础的害虫防治方法不仅为昆虫的功 能基因组研究提供了便捷的方法 ,也为农业害 虫的防治提供了特异性更强且环境安全的新思 路。 媒介昆虫是多种疾病的传播媒介 ,对其防 治是控制虫媒病的重要手段。RNAi 技术也应 用到媒介蚊虫的研究中[67～69 ] 。随着 RNAi 技术 研究的进展 ,抑制病毒在媒介昆虫中的复制以 及开发基于病毒基因的种特异性杀虫剂将成为 可能。 314 　新型农药的开发 由于人类对环境保护和自身健康意识的增 强、害虫抗性、农药残留、生物多样性保护等因 素 ,使大量传统杀虫剂已经不适应现代农业发 展的需要 ,开发效果好、成本低、使用安全、不污 染环境的新型杀虫剂是农药发展的方向。新型 靶标的鉴定是新药开发的关键环节之一。 RNAi 由于具有高效和特异的特点 ,使它成为新 型靶标筛选和鉴定领域中最活跃的方向之一 , 利用昆虫细胞、胚胎、幼虫和成虫 RNAi 技术在 昆虫细胞或个体模型中直接沉默目标基因 ,可 以从分子水平寻找新型的药物靶标。尤其 RNAi 技术可以实现快速、大规模、高通量的在 整个基因组水平上进行筛选 ,可以发现许多以 前未曾注意到或不通过高通量筛选很难得到的 一些潜在靶标。另外 ,对于已经获得的一些重 要的化合物 ,RNAi 有助于更早地鉴定较好的候 选药物 ,加快药物的研制速度。同时 ,RNAi 技 术还有助于鉴定药物作用的生化模式以及其他 与此作用相关的基因。 4 　结语和展望 RNAi 是一种进行基因调控的新技术。由 于 RNAi 在基因功能和相关方面的研究中具有 许多传统方法无法比拟的优势 ,而被美国科学 杂志评为 2001 年十大科技突破之一。随着 RNAi 技术体系在越来越多昆虫中的建立 ,RNAi 已经成为昆虫领域研究的热点和前沿 ,在昆虫 的基因功能研究、害虫防治策略等方面已经取 得了令人振奋的的研究进展。虽然 RNAi 技术 并不能替代其它方法 ,但随着对 RNAi 研究的 不断深入并与其它技术综合使用 ,相信在不久 的将来 ,RNAi 在昆虫的功能基因组学、基因表 达调控及信号传导通路、害虫控制、益虫保护、 新型农药的开发、发育生物学等方面发挥越来 越重要的作用 ,必将对整个昆虫学的研究起到 巨大的推动作用。 参 　考 　文 　献 1 　Fire A. , Xu S. , Montgomery M. 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