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首页 湿热灭菌工艺的微生物学验证

湿热灭菌工艺的微生物学验证.pdf

湿热灭菌工艺的微生物学验证

飘渺远山
2011-09-29 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《湿热灭菌工艺的微生物学验证pdf》,可适用于自然科学领域

湿热灭菌工艺的微生物学验证主讲人: 崔强年月Email:cuiqiangsspccomcn概念与方式♦基础概念–灭菌工艺–无菌♦药品达到无菌要求的两种方式–无菌生产工艺–最终灭菌两种方式的比较♦无菌生产工艺的局限–通常的无菌保证水平(至)–影响因素多♦最终灭菌工艺的优点–赋予产品更高的无菌保证水平–生产中可变素少出现偏差的概率低–几乎能杀灭产品中的所有微生物制药工业常用的灭除菌方式♦热力灭菌–湿热灭菌(oC)–蒸汽、过热水–干热灭菌(oC)–热空气♦气体灭菌–环氧乙烷♦离子幅射灭菌–γ幅射或电子束幅射♦过滤除菌法–过滤名义孔径<=µm热力灭菌的基本原理¾湿热灭菌导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。湿度对该破坏性过程起促进作用。¾干热灭菌使微生物氧化而不是蛋白质变性。热力灭菌设备示意图过热水灭菌釜干热灭菌釜蒸汽灭菌釜湿热灭菌工艺研发与确认工艺研发阶段灭菌工艺的验证灭菌学工艺确认阶段方法设计非产品特异性灭菌工艺(过度杀灭法)产品特异性灭菌工艺装载类型蒸汽不可透过型物品(液体型)蒸汽可透过型物品工艺类型饱和蒸汽型·预真空式·重力式空气超压型·蒸汽空气混和方式·过热水方式工艺开发确定参数·升温阶段·保温阶段·降温阶段性能确认物理学方法·温度分布·热穿透生物学方法连续控制日常放行·工艺评估·系统适用性再确认变更控制细菌细胞结构模式图细胞质膜细胞壁荚膜异染颗粒线毛鞭毛色素体脂质颗粒中体核糖体拟核横隔壁最终灭菌产品无菌的标准♦无菌检查结果合格  存在局限性实际污染率取样量,批检不合格率、实际污染率和取样量之间的相互关系最终灭菌产品无菌的标准♦通过物理生物学方法证明单位产品内微生物存在的概率不超过百万分之一(即批产品的污染概率不超过百万分之一)–可实现参数放行影响灭菌效果的因素♦物理化学条件Ê环境因子Ê芽孢是否处于被包裹状态♦湿度♦微生物的热致死特性适于湿热灭菌工艺验证的微生物菌种名称D值范围(min)嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillusstearothermophilus枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans梭状芽孢杆菌Clostridumsporogenes关于芽孢♦芽孢是休眠体Endospore与Exospore♦形成芽孢的细菌种类♦芽孢的特性成熟芽孢的电镜照片关于芽孢(续)♦芽孢的显微照片嗜热脂肪芽孢杆菌的内生孢子梭状芽孢杆菌实现无菌要求的标准手段♦热稳定性产品(过度杀灭)–美国产品灭菌工艺的F值不低于分钟–欧盟℃×分钟♦热敏感性产品–控制产品在灭菌前的带菌量–产品灭菌工艺的F值不低于分钟药典要求♦EP对过度杀灭法的工艺要求:对溶液的灭菌条件至少为oC×分钟也可采用其它组合条件但灭菌效果须与上述相等效。目标:无菌保证值(SAL污染概率的负对数)大于等于。药典要求♦USP对过度杀灭法的工艺要求:对溶液的灭菌条件需达到D至少为分钟。♦设计目的:使D=分钟数量为的微生物经过灭菌后达到SAL=。灭菌程序的开发与设计♦根据灭菌前带菌量进行设计–基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的热稳定性–灭菌后产品的污染概率须小于。♦过度杀灭法–基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物并且再加上一定的安全系数–理论上对生物指示剂孢子的杀灭能力达到。♦将两者相结合–兼顾产品的热稳定性和无菌要求。湿热湿热灭菌灭菌工艺工艺选择选择热敏感性物品?产品特定性灭菌工艺是否过度杀灭法灭菌工艺物品类型?蒸汽穿透型需要排除空气?是预真空式灭菌工艺否已安装预真空装置?是否重力沉降式灭菌工艺液体型需要过压空气?否是任何湿热灭菌工艺可直接与水接触?是过热水灭菌工艺否蒸汽空气混和型灭菌工艺决决策策树树灭菌程序的效力测定♦生物学手段(FBiological)–用特定的生物指示剂作为标准微生物制剂–数据直接反映灭菌效果–有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入安瓿瓶)–局限性:较难进行统计学分析♦物理数学手段(FPhysical)–用灭菌值F作为评价标准–精确测定热分布和热穿透状况–便于准确计算不同灭菌条件下的灭菌效果–测量数据便于统计学分析灭菌工艺验证♦确认(IQ、OQ)–灭菌设备的运行符合设计要求♦验证(PQ)–产品灭菌程序的有效性和重现性♦评估–灭菌时产品可能发生的变化给灭菌效果带来的影响灭菌工艺验证IQOQ♦检查设备构造、控制监测系统、运行系统、安全系统及所有零部件均与采购要求相同♦控制监测仪表的校验包括程序控制器、温度、压力和时间控制设备以及计时器、记录测量仪等♦试车–空载热分布试验–温度探头支探头精确度±oC–须有探头与腔室原探头并列放置–检测报警和安全系统的可靠性–真空系统的可靠性(产生的效率、维持时间等)–灭菌温度下各点间最大温差(腔室内的)<=oC同一点的最大温差±oC–重复试验至少次以证明重现性灭菌工艺验证–PQ (一)♦每种装载方式下的热穿透试验–证明特定灭菌程序杀灭微生物的均一性和有效性–重复性试验证明灭菌程序的重现性和稳定性–证明灭菌程序对被灭菌物品的相容性♦容器内部产品的热穿透试验–证明在每种装载方式下各点的均一性、程序的重现性–证明最冷点处所获得的灭菌效果符合既定要求。灭菌工艺验证–PQ (二)♦生物指示剂试验–结果与热穿透试验保持一致–所有测试点均应确保SAL不低于–试验次数足以符合统计学要求(至少重复次试验指示剂数量–支次)。再验证和变更管理♦再验证–进行再验证的条件•设备、产品、工艺有重大改变或设备有重大维修•定期的常规再验证(一次月)–验证方法•通常与初次PQ方案相同。♦变更管理–有相关SOP来评价变更对工艺的潜在影响–根据变更评估结果确定再验证的范围无菌的影响因素Nt=NNRNt–灭菌后微生物残存量N灭菌前微生物含量NR灭菌时的杀灭量。PNSU=NDRPNSU非无菌品概率N灭菌前产品的污染水平DR灭菌时的杀灭水平。热力灭菌的基本规律在一定温度下微生物数量的对数值与灭菌时间的线性关系微生物数量的对数值灭菌时间实例±oC下梭状芽孢杆菌孢子在PBS中的存活数量时间(min)存活数量(CFU)对数值××××××X轴Y轴实例将数据输入EXCEL平台添加趋势线得出表达式、斜率、相关系数等y=xR=时间,分钟孢子数量的对数值耐热参数D值的定义D值指一定温度下将微生物杀灭%(即下降一个对数单位)所需要的时间(Timefordecimalreduction)kLogNtLogN时间(min)D值LogCFUtCFU,,,,,DT值的影响因素z挑战微生物的种类z挑战微生物的贮存条件z挑战微生物的恢复生长和培养条件z灭菌釜的灭菌工艺温度zDT值测定开始前的起始温度z悬浮液和恢复生长用培养基种类z灭菌结束后的放置温度与时间z蒸汽的饱和度z原始包装材料DT值的测定方法zDirectEnumerationMethod直接计数法又称SurvivalCurveMethod残存曲线法zFractionNegativeMethod阴性分数法SpearmanKarberMethod史丕曼卡伯法Stumbo,Murphy,andCochranMethodSpearmanKarberMethodT=Tk-d-(d×Σf)例:通过阴性分数法估算D值每组中无微生物生长样品数(f)每组样品数(n)D=T(logN)℃下的暴热时间(分钟)fnfStumboMurphyCochranMethodDT=uLogN-Log(Lognq)n–样品总数q–暴热处理后的阴性样品总数D值测定计算练习y=xR=时间,分钟孢子数量的对数值±oC下梭状芽孢杆菌孢子在PBS中的存活曲线根据曲线进行测量:任选两个对数值的整数值找到相对应的灭菌时间用时间差除以对数差得D值惯用法:测出一个对数单位的时间差如图示:=(分钟)利用EXCEL平台直接计算残存曲线斜率再取负倒数D=()=(分钟)耐热参数Z值的定义Z值是指当某种微生物的D值下降(或上升)一个对数(log)单位时其温度应升高(或降低)的度数。温度(oC)LogDZ值logD-logDT-TZ=Z值测定与计算测定某一微生物至少在三个温度点的D值–每个温度点的D值至少单独测量三次,取其平均值(同温度下各D值间差异应小于)–以D值对数值为纵坐标,温度点为横坐标,绘出Z值线(线性相关系数r>)–该线的斜率的负倒数即为某微生物在特定介质内的Z值灭菌率的概念灭菌率(L值)系指在某温度下灭菌分钟所相应的标准灭菌时间(分钟)即F和FT的比值(L=FFT)。当Z=℃时不同温度下的L值是不同的。有关公式致死率表Z值℃Z值测定与计算示例均值温度(℃)D值(分钟)实测值梭状芽孢杆菌孢子在脂肪乳剂注射液()中的D值y=xR=温度oCLogD不同温度下梭状芽孢杆菌在脂肪乳中的D值Z值测定与计算示例(续)Z=()=oCD值与Z值的相互关系=(T-)Z=LDDT设T=oC切记:只有在特定的试验条件下D值和Z值才是有意义的参数logD-logDT-TZ=商购生物指示剂的确认进行形态学和纯度确认(至少鉴别至菌属)芽孢计数复核D值复核(视实验室能力而定)蒸汽灭菌工艺用BI℃下暴热预处理分钟环氧乙烷和干热灭菌工艺用BI℃下暴热预处理分钟预处理后迅速转移至冰水浴内合格标准:Log(实测值)在Log(标示值)之间F的定义及其意义F是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在oC下相等效时所需要的灭菌时间(分钟)。F的定义及其意义(续)♦F是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在oC下相等效时所需要的灭菌时间(分钟)。♦oC或oF表示~KPa饱和蒸汽的温度,为标准灭菌温度♦F值用于评价热(湿干热)灭菌工艺的对微生物的杀灭效果♦F值可用来比较不同温度下的灭菌效果♦F值既可用生物学方法测定也可用数学方法积分测得(积分时务必采用oC,因为每相差oC,F将会产生的偏差)F=D×(logNlogNt)F=(T-)Zdt∫tnt药典对F的要求♦BP–蒸汽灭菌程序赋予产品的F值不得低于分钟–制定依据:多数嗜温性细菌芽孢在oC下的D值在秒至分钟之间♦USP<>–蒸汽灭菌过度杀灭程序赋予产品的F值不得低于分钟–目标:使在oC下D值为分钟的细菌芽孢下降个对数单位(双倍于无菌保证值)–可采用其它灭菌程序但要保证符合无菌标准♦EP、CP–蒸汽灭菌程序通常应为在oC下灭菌分钟–可采用其它灭菌程序但要保证符合无菌标准F与FT的相互关系F=D×(logNlogNt)FT=DT×(logNlogNt)F=(T-)Zdt∫tntFFTDDT=(T-)Z=L=(灭菌率)F值与其它温度间的等效时间示例温度F=分的等效时间F=分的等效时间工艺条件赋予嗜热脂肪芽孢杆菌(D=分、Z值为oC)F=分及分时算出的等效温度与时间组合生物指示剂验证过度杀灭工艺–选择与灭菌条件(工艺、对象及程序)相适应的生物指示剂(BstearothermophilusATCC被视为标准菌株D=分单位数量–个孢子)–生物指示剂与温度探头并列在同一部位(支)–按规定条件培养生物指示剂如嗜热脂肪芽孢杆菌的培养温度为oC培养天每天检查。–对生物指示剂用培养基进行促生长检查–进行阳性对照试验–所有经受挑战试验的样品均呈阴性生物指示剂验证–非过度杀灭工艺♦选择与灭菌条件(工艺、对象及程序)相适应的生物指示剂♦生物指示剂的耐热性–不得低于孢子在相应产品中的耐热性–不得低于产品中污染菌的耐热性–用于每次挑战试验的所有BI批号必须相同♦生物指示剂的接种量计算F=D×(logNlogNt)生物指示剂的接种量计算计算方法:F=D×(logNlogNt)  ①Nt=×log(nq)    ②n:每次挑战试验用生物指示剂数量q:挑战试验后呈阴性的BI数量如果全都是阴性,则假定q=n用于计算NtF分钟t考虑要素:灭菌标准SAL>=产品Bioburden<=孢子产品产品灭菌工艺的F下限BI的耐热性资料BI在挑战试验前、后的计数方式孢子存活数量的对数值标准孢子液的使用♦孢子在标准溶液中的耐热性>=孢子在产品溶液中的耐热性♦孢子的耐热性在标准溶液中比较稳定–孢子在标准溶液中的耐热性资料–标准溶液更方便于制备和检测♦适用于替代灭菌程序相近的不同产品的灭菌工艺验证♦生物指示剂的D值测定方法D值测定仪器BiologicalIndicatorEvaluatorResistometer(简称BIERVessel)油浴装置–用于残存曲线法D值测定仪器的典型温度曲线C温度时间(分钟)残存曲线法测定D值♦仪器及材料–油浴(适宜的温度范围精度容量)–毛细管与支架♦试验用芽孢悬浮液准备–工作悬浮液占试验悬浮液比例不超过–每ml试验悬浮液中中的芽孢为♦确定试验参数♦数据分析–线性回归和相关系数要求Y=mXbm=(Y∑X∑XY)(X∑X∑X)γ=mδXδY产品灭菌前含菌量控制限度CFU瓶污染菌耐热性限度温度×时间F控制范围(分)验证用孢子在其中的耐热性DA≤℃×分B≤DC≤DBI℃×分C≤DC≤DBI℃×–分非过度灭菌程序生物指示剂验证实践非过度灭菌程序生物指示剂验证实践案例:某公司生产三种大输液产品案例:某公司生产三种大输液产品AA、、BB和和CC与微生物相关的基本参数如下表请您根据这些与微生物相关的基本参数如下表请您根据这些参数设计出对上述产品灭菌程序进行生物指示剂参数设计出对上述产品灭菌程序进行生物指示剂验证的方案。验证的方案。DC≤DBI非过度灭菌程序生物指示剂验证实践♦可选择产品B代表上述三产品进行验证–生物指示剂在其中的耐热性最高而灭菌程序的F值的下限低于其它二产品–但验证时要以CFU瓶作为污染菌含量–通过试验证明灭菌程序能使生物指示剂至少下降个对数单位,所需F为D×⊿log=分–最低F满足要求非过度灭菌程序生物指示剂验证实践♦确定验证用芽孢在每瓶产品B中的接种数量F=D×(logNlogNt)Nt=×log(nq)n:每次挑战试验用生物指示剂数量q:挑战试验后呈阴性的BI数量如果全都是阴性,则假定q=n用于计算Nt结果:每瓶产品B中的生物指示剂接种量要达到×CFU用替代性产品用替代性产品((标准溶液标准溶液))进行验证进行验证••选择替代性溶液解决接种量过高的难题选择替代性溶液解决接种量过高的难题••设生物指示剂在设生物指示剂在PBSPBS溶液中的耐热性溶液中的耐热性DD==分分,,那那么么,,所需接种量可计算如下所需接种量可计算如下::FF=D=Dbibi××(lgA(lgAlgB)lgB)根据阴性分数法根据阴性分数法B=B=××log(nq)log(nq)nn为验证试验瓶总数为验证试验瓶总数qq为试验结果呈阴性的瓶数。假如所有的为试验结果呈阴性的瓶数。假如所有的只试验瓶无菌检查结果均呈阴性在计算时可假定只有只试验瓶无菌检查结果均呈阴性在计算时可假定只有瓶呈阴瓶呈阴性那么性那么B=B=××lglg()=()=于是于是lgB=lgB=lgA=FlgA=FDDbibilgBlgB===,=,A=A=个菌个菌瓶瓶因此每个挑战瓶内的孢子接种量可控制在因此每个挑战瓶内的孢子接种量可控制在××个个。。非过度杀灭程序的日常监控♦批产品灭菌前含菌量控制与监测–建立控制指标通过相应的控制措施来实现–对批产品进行监控•样品对批产品应具有代表性(灌装前中后取样)•总需氧菌含量(薄膜过滤法)•污染菌的耐热性(沸水浴处理过滤TGB培养)–一旦污染菌的耐热性超过BI耐热性则需用污染菌对工艺进行验证验证合格后相关产品方可放行。参数放行的基本概念♦什么是参数放行–参数放行系指根据对经过验证的灭菌工艺进行有效的控制、监测和相关文档资料来代替对最终灭菌产品进行无菌检查的无菌评价放行程序。♦实行参数放行的意义–灭菌工艺验证的自然结果–克服成品无菌检查的统计学局限性和不精确结果–减少质量控制成本–缩短生产周期降低库存压力参数放行的实践要求♦参数放行须得到政府部门的批准♦严格控制和监测灭菌前产品中的微生物污染状况♦严格控制灭菌工艺♦须用指示剂监控每个灭菌批♦须有区分已灭菌和未灭菌产品的系统♦容器的密封完好性验证欧美国家的参数放行♦美国针对四种灭菌方式湿热灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌♦欧洲针对三种灭菌方式湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌不同灭菌工艺的比较Bioburdenbasedprocess含菌量控制工艺StabilityStabilityStabilityBiologicalindicatorbioburdencombinedprocess生物指示剂含菌量联合控制工艺SterilitySterilitySterilityOverkillprocess过度杀灭工艺属于产品特定性灭菌工艺相同温度下时间递增灭菌前含菌量和耐热性监控信息需求递增参数放行法的工艺流程控制♦列出灭菌工艺的操作步骤♦明确每一关键参数的一级和二级控制限度♦明确必须报警的运行参数及机械性能参数♦安装足够的辅助性传感测量仪器给予主系统充分的保障♦保证所有的工艺参数监测器均处在经校验的合格状态下工作♦产品灭菌工艺验证之前应首先对灭菌釜进行彻底的(空载)性能确认♦分别在满载或部分装载状态下验证灭菌设备的性能。参数放行中的灭菌工艺关键参数♦腔室温度(一级控制、二级控制温度仪表)♦腔室压力(一级控制、二级控制压力仪表)♦灭菌时间(一级控制为暴热时间二级控制为各阶段的开始时间和相应时间间隔)♦灭菌工艺赋予产品的F值♦评判标准:如果上述不合格关键参数超过一个即使生物指示剂指示合格该批应视为无菌批。更不得以无菌检查结果来仲裁。批产品参数放行前应确认和检查的无菌保证相关项目♦产品完好性♦灭菌前产品和灭菌釜冷却介质的微生物污染水平♦灭菌指示剂的变化情况♦过滤器完好性试验测试数据♦灭菌釜已完成计划性预修和常规检查所有非计划性维修均经无菌保证工程师和微生物专家审批♦所有仪器、仪表均经校准♦灭菌釜通过产品装载确认试验♦产品灌封数量、送往灭菌釜的数量、灭菌釜内数量、移出灭菌釜的数量、送往包装工序的数量和考虑放行的数量均处于平衡状态♦灭菌过程记录经相关人员审核放行谢谢湿热灭菌工艺的微生物学验证概念与方式两种方式的比较制药工业常用的灭除菌方式热力灭菌的基本原理热力灭菌设备示意图湿热灭菌工艺研发与确认细菌细胞结构模式图最终灭菌产品无菌的标准最终灭菌产品无菌的标准影响灭菌效果的因素适于湿热灭菌工艺验证的微生物关于芽孢关于芽孢(续)实现无菌要求的标准手段药典要求药典要求灭菌程序的开发与设计湿热灭菌工艺选择灭菌程序的效力测定灭菌工艺验证灭菌工艺验证IQOQ灭菌工艺验证–PQ (一)灭菌工艺验证–PQ (二)再验证和变更管理无菌的影响因素热力灭菌的基本规律实例实例耐热参数D值的定义DT值的影响因素DT值的测定方法SpearmanKarberMethodStumboMurphyCochranMethodD值测定计算练习耐热参数Z值的定义Z值测定与计算灭菌率的概念致死率表Z值测定与计算示例Z值测定与计算示例(续)D值与Z值的相互关系商购生物指示剂的确认F的定义及其意义F的定义及其意义(续)药典对F的要求F与FT的相互关系F值与其它温度间的等效时间示例生物指示剂验证过度杀灭工艺生物指示剂验证–非过度杀灭工艺生物指示剂的接种量计算标准孢子液的使用D值测定仪器D值测定仪器的典型温度曲线残存曲线法测定D值非过度灭菌程序生物指示剂验证实践非过度灭菌程序生物指示剂验证实践非过度灭菌程序生物指示剂验证实践用替代性产品(标准溶液)进行验证非过度杀灭程序的日常监控参数放行的基本概念参数放行的实践要求欧美国家的参数放行不同灭菌工艺的比较参数放行法的工艺流程控制参数放行中的灭菌工艺关键参数批产品参数放行前应确认和检查的无菌保证相关项目谢谢

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