第一章、基因组与基因组学
名词解释
1、基因:染色体上呈线性排列的遗传单位,它不仅是决定性状的功能单位,也是一个突变单位和交换单位。
2、基因组(genome):泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质;在真核生物,基因组是指一套染色体(单倍体)DNA。即物种全部遗传信息的总和。
3、基因组学:指以分子生物学技术、计算机技术和信息网络技术为研究手段,以生物体内全部基因为研究对象,在全基因背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及其内外环境影响机制的科学。
4、RFLP(限制性片段长度多态性):个体之间DNA的核苷酸序列存在差异,称之为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生改变,称之RFLP。
5、SNP:单核苷酸的多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。包括单个碱基的缺失、插入和替换。
6、STR:称为简短串联重复,指重复单位长度在2-6个核苷酸之间的微卫星DNA。
7、STS:序列标签位点,是已知的核苷酸序列的DNA片段,是基因组中任何单拷贝的长度在100-500bp之间的DNA序列,与核酸内切酶识别序列相关联。
8、cM:厘摩尔,遗传标记之间的相对距离即图距以厘摩(cM,厘摩尔根,centi-Morgan)为单位。当两个遗传标记之间的重组值为1%时,图距即为1cM。
问答题
1、 病毒基因组的特点:a、结构简单,基因组小,所含基因少。b、基因组可由DNA组成,也可由RNA组成,但不能共存于同一病毒。c、相关基因丛集。d.常见重叠基因现象。 e.非编码区少,重复顺序少。
2、 原核生物基因组特点:1、基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。2、功能相关的几个结构基因往往串联排列在一起组成操纵子结构,受上游共同的调控区控制。3、原核生物基因组中基因密度非常高,结构基因是连续的多为单一拷贝。4、结构基因无重叠现象。5、含有编码同工酶的基因。6、不同原核生物基因组中GC含量变化很大。7、非编码区内主要是调控序列。8、细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象。9、除细菌染色体外,还有能自主复制的双链环状DNA分子,称为质粒。
3、 真核生物基因组特点:1、真核生物基因组的化学本质为DNA,多与蛋白质结合形成染色质,基本结构单位为核小体。每一种真核生物都有一定的染色体数目,除配子为单倍体外,体细胞一般为双倍体,即含两份同源基因组,而原核生物的基因组则是单拷贝的。2、基因组远大于原核生物,结构复杂,基因数庞大,具有许多复制起始点,每个复制子大小不一。3、基因不存在操纵子结构,功能相关基因分散在不同的染色体上。4、基因组中有大量低度(重复频率<103)、中度(重复频率<105)和高度重复序列。5、基因是不连续的(断裂基因),由外显子和内含子镶嵌排列而成。6、非编码区(占90%以上)远大于编码区。7、功能相关的基因构成各种基因家族,它们可串联在一起,亦可相距很远,但即使串联在一起的成簇的基因也是分别转录的。8、基因组中也存在一些可移动的遗传因素,这些DNA顺序并无明显生物学功能,似乎为自己的目的而组织,故有自私DNA之称,其移动多被RNA介导,也有被DNA介导的。
4、 人类基因组特点:1、前述的真核基因组的结构特点基本上都适用于人类基因组。2、基因组DNA有30亿个碱基对(3×109bp),约有2.8万个基因,目前已定位的有2000个。3、编码序列只占基因组总DNA量的5%以下,非编码区占95%以上,大量为重复序列。
5、HGP主要任务:四张图:遗传图、物理图、转录图、序列图
遗传图:是以在某个遗传位点上具有多个等位基因的遗传标记作为“路标”,以遗传学上的距离即两个遗传位点之间进行交换、重组的百分率cM作为“图距”,反映基因遗传效应的基因组图。(局限:分辨率有限、精确度较低)构建方法:基因标记;DNA标记(RFLP、STR、SNP)
物理图:以已知核苷酸序列的DNA片段(序列标签位点, STS)为“路标”,以碱基对(bp,kb,Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。(STS是基因组中任何单拷贝的长度在100~500bp之间的DNA序列,与核酸内切酶识别序列相关联。物理图主要内容是建立相互重叠连接的“相连DNA片段群”)构建方法:限制性酶切图谱;荧光原位杂交;序列标签位点。
转录图:人类的基因转录图(cDNA图),或者基因的cDNA片段图,即
表
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达序列标签图(EST,expressed sequence tag)是人类基因组图的雏型。转录图(基因表达谱)研究所提供的信息,使人们能系统地全面地从mRNA水平了解特定细胞、组织或器官的基因表达模式并解释其生理属性,深入认识细胞生长、发育、分化、衰老和疾病发生的机制。
序列图:是分子水平上最高层次、最详尽的物理图。测定总长约2米、由30亿个核苷酸组成的全序列是人类基因组
计划
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的最终目标。既包括可转录序列,也包括非转录序列,是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。
6、基因组学包括3个不同的亚领域:
结构基因组学:整个基因组的遗传制图、物理制图及DNA测序。
功能基因组学:认识、分析整个基因组所包含的基因、非基因及其功能。
比较基因组学:比较不同物种的整个基因组,增强对各个基因组功能及发育相关性知识。
7、人类基因组测序策略
第二章、RNA组学
名词解释
1、 RNA组学:对细胞中全部RNA分子的结构与功能进行系统的研究,从整体水平阐明RNA的生物学意义即为RNA组学的主要任务。
2、 转录组:即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括mRNA和非编码RNA。
3、 转录组学:就是在基因组学后新兴的一门学科,即研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数。即研究生物细胞中转录组的发生和变化规律的科学就称为转录组学。
问答题
1、 RNA领域的新发现:RNA控制着蛋白质的生物合成;RNA具运动功能;RNA具调控功能;RNA
调控遗传信息;RNA修饰;RNA携带遗传信息;RNA与疾病的关系;基因组研究中的“垃圾”可能是
RNA基因。
2、 miRNA和siRNA特点及差异比较
miRNA的特点:
? 其长度一般为20~25个碱基;
? 在不同生物体中普遍存在;
? 其序列在不同生物中具有一定的保守性;
? 具有明显的表达阶段特异性和组织特异性;
? miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,大多位于基因间隔区。
siRNA的特点:
? 小干扰RNA:是细胞内一类双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在特定情况下由Dicer
(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。具有特定长度(21~23个碱基)
和特定序列的小片段RNA。
? 双链siRNA参与RISC组成,与特异的靶mRNA完全互补结合,导致靶mRNA降解,阻断翻
译过程。
? 由siRNA介导的基因表达抑制作用被称为RNA干涉(RNA interference,RNAi)。
3、 转录组与基因组的区别
? 与基因组不同的是,转录组的定义中包含了时间和空间的限定。
? 同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因表达情况是不完全相同的。
? 人类基因组包含有30亿个碱基对,其中大约只有2.5万个基因转录成mRNA分子,转录后的
mRNA能被翻译生成蛋白质的也只占整个转录组的40%左右。
? 通常,同一种组织表达几乎相同的一套基因以区别于其他组织,如:脑组织或心肌组织等分别
只表达全部基因中不同的30%而显示出组织的特异性。
第三章、酶学
名词解释
1、 酶作用动力学:研究酶催化反应速度及研究各种因素对反应速度的影响以及从底物到产物之间可能进行的历程。
2、 钝化作用:主要指在某些物理或化学因素作用下酶蛋白分子的次级键受破坏,酶蛋白的空间构象改变,酶蛋白因变性而失去了酶活性。
3、 抑制作用:由酶的必需基团或活性部位的化学性质发生改变,引起的酶活性的降低或丧失的作用。
4、 酶的活力单位:在特定的条件下,1分钟转化1微摩尔底物的酶量,或转化1微摩尔的底物有关基团的酶量为1个酶的活力单位(国际单位IU)。
5、 酶的比活力:酶的活力与蛋白质的量相联系的1种活力单位。如每mg酶蛋白所具有的酶活力 (单位/mg蛋白),每ml酶制剂含有的酶活力(单位/m1),或每g酶制剂具有的活力单位(单位/g)等。对同一种酶来讲,比活力愈高则酶越纯。
6、 酶的转换数:Kcat值以每秒钟每个酶分子转化底物的微摩尔数来表示。
问答题
1、 酶促反应速度的影响:a、底物浓度 底物浓度与酶促反应速度的关系,分为3个阶段讨论。在反应初始阶段底物浓度从零逐渐增加时,反应速度与底物浓度为线性关系,为一级反应阶段。随着底物浓度的增加,反应速度仍然增加,但这种速度的增加与底物浓度的变化之间不呈现为线性正比关系,这个阶段称为混合级反应。底物继续增加,反应速度接近于1个恒定值,即底物浓度的变化不再影响反应速度,酶已经完全被底物所饱和,这第三阶段称为零级反应。b、pH 多数酶在某一pH下的反应速度达到最高值,低于或高于此pH值时反应速度有所降低,这个pH值即酶的最适pH值,pH值和酶反应速度的关系曲线一般呈钟罩形。(酶本身稳定性;对酶分子的某些侧链基团解离程度的影响) c、温度 温度升高,反应物的能量增加,反应速度加快;随着温度的继续升高,酶蛋白吸收了过多的能量,使维持分子空间构象的次级键断裂,导致热变性,反应速度迅速降低。 d、酶浓度 在酶促反应中,若底物浓度足以使酶饱和,并有效地转化为产物,反应速度与酶浓度成正比。e、激活剂 无机离子、分子、蛋白质。f、抑制剂 不可逆、可逆
2、 米氏
公式
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:
V=Vm[S]/(Km+[S])
[S]为底物浓度,Vm为最大反应速度,Km为米氏常数,其等于反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度,Km值是酶的特征性常数之一,只与酶的性质有关,和酶的浓度无关。
Km值与米氏公式的应用:(1)计算反应速度及底物浓度之间的关系;(2)判断可逆反应中酶的主要催化方向;(3)了解酶在代谢中的作用,判断酶是否受底物浓度调节。
3、 双底物反应机制:顺序机制 底物A和B顺序结合在一个酶的活性部位,形成EAB三元复合物,反应才能进行,然后释放产物。有序顺序机制(是指底物和酶的结合必须是先A后B,也就是只有酶先于A结合后才有利于和底物B结合。产物脱离酶的顺序也必须是先P后Q)随机顺序机制(是指A和B两底物与酶的结合是随机的,产物P、Q脱离酶的顺序也是随机的)乒乓机制 指底物和产物交替进出的机制,两底物不能同时与酶结合形成EAB复合物。
4、 酶不可逆抑制剂:a、非专一性的不可逆抑制剂:与酶分子活性部位有关的一类或几类基团反应,此类抑制剂常为修饰氨基酸侧链基团的化学试剂,它包括酰化、烷化试剂。如:有机磷、砷及重金属等。 b、专一性的不可逆抑制剂:仅与酶分子活性部位中有关基团反应。Ks型不可逆抑制剂:是根据底物的结构设计的,具有和底物相似的结构,可和相应的酶结合,同时还带有一个活泼的化学基团,可和酶分子中相应的必需基团反应,对后者进行化学修饰,从而抑制酶的活性。Kcat型不可逆抑制剂:是根据酶催化过程设计的,具有和底物相似的被酶结合和被酶催化反应的性质,还有一个潜伏反应基团。
5、 酶可逆抑制剂:竞争性抑制剂 抑制剂与底物的结构相似,共同竞争酶的底物结合部位,互相排斥,底物结合在酶的活性部位以后,抑制剂就不能再和酶结合了,反之亦然。(酶动力学特征:Vm不变,Km增大)非竞争性抑制作用 抑制剂和底物分别结合在酶的不同部位,酶可以同时与底物及抑制剂结合,两者没有竞争作用。(酶动力学特征:Vm降低,Km不变)反竞争抑制作用 反竞争性抑制剂不能和游离的酶结合,只能和酶和底物的复合物结合。(酶动力学特征:Vm降低,Km降低)混合型抑制作用 和非竞争性抑制相似,底物、抑制剂与酶的结合并不相关,但Ks≠Ks’,Ki≠Ki’(Ki
Ki’, Vm值降低,Km值降低)
6、 判断分离提纯方法的优劣,常采用两个指标:1)活力的回收 总活力的回收计算,表示提纯过程中酶的损失情况。酶活力(u/ml酶液)× 酶液总体积(ml)。回收率是指提纯前与提纯后酶的总活力之比,表示提纯过程中酶损失程度大小。回收率越高,损失越小。2)活力提高的倍数 是表示提纯方法有效的程度, 比较每一步纯化的效率。纯化倍数是指提纯前后比活力之比,是表示提纯过程中纯度提高的倍数,提纯倍数越大,表示该方法纯化效果越好。
7、 酶均一性判断: 1)、根据酶分子的带电性质:如离子交换层析,区带电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳,等电聚焦和双向电泳等。若在几种pH条件下分析,且得到均一性的结果,则它们在带电性质上是均一的。2)、根据酶分子大小、形状:如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤法和超速离心沉降法。3)、根据酶的化学性质:如测定氨基酸组成,氨基末端或羧基末端,常需要将末端分析与分子量的测定结合起来。4)、利用溶解度检测 此外,可根据免疫性质(单克隆抗体)等分析鉴定。
8、 酶的活力测定方法:酶活力可以用在一定条件下所催化的化学反应速度来表示。测定酶活力,实际上是测定酶促反应的速度。反应速度一般以在一定条件下单位时间底物的消耗量或产物的生成量来表示。
1) 选择最适酶反应系统 选择和固定测定酶活力的反应体系的各种因素
2) 确定反应时间 选用产物生成与反应时间呈线性关系范围内的时间点为测定选用的时间
3) 选用适当的底物浓度 一般选用7~10倍的Km值的底物浓度为测定时的底物浓度为宜
4) 测定酶活性 上述因素确定后,酶活力的测定条件已具备,可进行酶活性的测定。
5) 对照系统 建立相应的对照实验 排除系统中非酶因素的干扰,保证测定值的可靠性
6) 建立产物分析方法 酶的活力可以用单位时间的底物减少量或产物的增加量来表示
9、 活力测定中的对照:测定酶活力时通常都附有适当的对照以消除所欲测定的产物不是由于酶促反应所生成的部分。常用的对照有以下几种:
1)样品对照:测定酶活性的样品不纯,或内源性底物的旁反应产生相同的产物。可通过不加底物单加样品的样品对照予以消除。
2)底物对照:某些酶的底物能自发(非酶促)地分解成所欲测定的产物,可通过不加样品单加底物对照予以解决。
3)时间对照:既有酶制剂的不纯(含有产物)又有底物自发分解的情况并存,必须做一个酶和底物均加入但反应时间为零的对照,即先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反应,再加入底物。
注意事项:
A、在双底物反应时,对照管可加入酶制剂和两种底物中的一种,因缺乏另一种底物,不可能由酶促反应生成产物。
B、测定管中的产物量必须减去对照管中的产物量才是真正由酶促反应所生成的产物量。
C、空白管和对照管易混淆,空白管是指测定样品中某个成分时所用的不加样品的“试剂管”。而对照管是指以消除所欲测定的产物不是由于酶促反应所生成的部分的“试剂管”。
第四章、基因表达调控
名词解释
1、基因表达:储存在DNA的遗传信息,经转录合成各种RNA,翻译生成执行生命活动的蛋白质。这一从DNA到蛋白质的遗传信息传递过程称为基因表达。
2、基因表达调控:生物体调节基因的表达状态,使特定基因表达启动或停止,增强或抑制,以适应环境,维持个体生长、发育和生存的需要,即为基因表达调控。
3、操纵子(operon):结构基因与位于结构基因上游的调控DNA序列组成的转录单位。
4、顺式作用元件:能与相应的调控蛋白结合,影响自身基因表达调控的DNA序列。
5、激活蛋白(activator):增强RNA聚合酶的活性,增强转录作用。
阻遏蛋白(repressor):阻遏RNA聚合酶的活性,抑制转录作用。
6、组成型表达(constitutive expression) 以恒定的速率进行的表达,称为组成型表达或基本表达。较少受环境因素的影响, 在一个物种或一个生物个体的几乎所有细胞都表达。管家基因(housekeeping gene) :以组成型表达的基因,称为管家基因。
适应性表达:受环境因素的影响,在不同细胞以不同的速率进行的表达。 诱导表达(induction):在特定环境因素下,激活蛋白基因被激活,基因表达产物水平增高的表达。阻遏表达(repression):在特定环境因素下,阻遏蛋白基因被激活,基因表达产物水平减少的表达。组成性突变:DNA调控序列突变,使适应性表达转变为组成性表达,这种突变称之。
协调表达 (coordinate expression):功能上相关的一组基因,协调一致,相互配合的共同表达方式。
7、顺式调节:调控蛋白结合自身基因的DNA调控序列,调节自身基因的表达,为分子内调节方式,称为顺式(cis)调节。
反式调节:调控蛋白特异识别、结合另一基因的DNA调控序列,调节另一基因的开启和关闭,为分子间的调节方式,称为反式(trans)调节。
8、时间特异性(temporal specificity):按功能需要,特定基因的表达严格按特定时间顺序发生。
空间特异性(spatial specificity):在个体生长过程中,特定基因表达按不同组织空间顺序出现。
9、SOS反应或应答:DNA损伤信号,引发多个操纵子同步协调表达,进行DNA修复。
10、反义RNA:能与特异mRNA互补的一类小分子RNA,抑制mRNA的作用,影响相应基因的表达。
11、启动子:能被RNA聚合酶特异性识别并与其结合,从而起始转录的核苷酸序列。
12、增强子:能够结合特异基因调节蛋白,远离转录起始点,增强启动子转录效率的DNA序列。
13、沉默子:对启动子起负调控作用的DNA序列。
14、绝缘子:位于增强子或沉默子与启动子之间的DNA序列,其阻断了调控蛋白的作用,阻碍了激活蛋白或阻遏蛋白与RNA聚合酶之间的联系。
15、染色质重塑:与转录相关的染色质局部结构改变称之。主要有核糖体重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰。
问答题
1、 乳糖操纵子作用机制
1) 阻遏蛋白负性调节:在没有乳糖条件下,阻遏蛋白能与操纵元件结合,抑制RNA聚合酶与启动子结合,从而抑制结构基因转录。当有乳糖存在时,乳糖在β-半乳糖苷酶催化作用下,转变为半乳糖,后者作为诱导剂与阻遏蛋白结合,导致阻遏蛋白与操纵元件解离,解除对结构基因转录抑制。
2) CAP正性调节:葡萄糖代谢产物能抑制腺苷酸环化酶和激活磷酸二酯酶,结果使细胞内cAMP水平降低。当葡萄糖耗尽时,cAMP升高,即可通过CAP调控其他操纵子表达。在lac操纵子中,lac启动子是弱启动子,RNA聚合酶与之结合能力弱,只有CAP结合到启动子上游CAP结合位点后,促进RNA聚合酶与启动子结合,才能有效的转录。
3) 协调调节:1、葡萄糖与乳糖都存在时:乳糖的存在解除了阻遏蛋白的抑制作用,但由于葡萄糖存在,细胞cAMP水平低,不能形成cAMP-CAP复合物,CAP不能结合到CAP结合位点上,不能启动转录;2、葡萄糖存在,乳糖不存在:阻遏蛋白与DNA结合,由于葡萄糖存在,CAP不能发挥正调控作用,不能转录;3、葡萄糖、乳糖都不存在时:没有葡萄糖,CAP可发挥正调控作用,但由于无诱导剂,阻遏蛋白发挥负调控作用,不转录;4、葡萄糖不存在,乳糖存在:CAP发挥正调控作用,阻遏蛋白因诱导剂的存在而失去负调控作用,开始转录。
2、 色氨酸操纵子作用机制
1) 色氨酸操纵子组成:E.coli的色氨酸操纵子有五个结构基因,E、D、C、B、A基因,编码色氨酸合成的相关酶。上游调控区由启动子(P)和操纵元件(O)组成。R基因为调节基因,编码阻遏蛋白。
2) 阻遏-操纵机制:粗调开关。R本身无活性,当环境提供足够浓度色氨酸时,R与色氨酸结合活化,阻遏结构基因转录。
3) 衰减子调控:细调开关。衰减子转录物中具有4段特殊序列,片段1和2, 2和3, 3和4能配对形成发夹结构,能力强弱依次为片段1/2>2/3>3/4。片段3和4所形成的发夹结构之后紧接着寡尿嘧啶,其不依赖于ρ因子的转录终止信号。色氨酸浓度很低时,Ptrp开放,核糖体开始翻译;色氨酸浓度较低时,生成的trp-tRNA量少,核糖体沿mRNA翻译移动速度慢,赶不上RNA聚合酶沿DNA转录的速度,2区和3区形成发夹结构,终止子不能形成,转录继续进行;色氨酸浓度较高时,trp-tRNA浓度高,核糖体不在色氨酸密码子处停止,2区和3区配对被破坏,3区和4区配对,终止结构形成,转录减弱。
3、噬菌体溶菌和溶原调节
溶菌状态建立:噬菌体感染宿主,RNApol结合PL和PR.进入即刻早期转录:向右合成Cro阻遏蛋白,其能关闭PRM,CⅠ阻遏蛋白不能合成;向左合成抗终止蛋白N,抑制TR和TL,保持转录进入晚早期和晚期,噬菌体装配,细菌溶解,进入溶菌状态。
溶原状态建立:噬菌体感染宿主,RNApol结合PL和PR.即刻早期表达N蛋白,Cro阻遏蛋白;晚早期表达C Ⅱ和CⅢ蛋白,CⅡ正调控PRM,促进cⅠ基因表达CⅠ阻遏蛋白,抑制PR,不抑制PL,噬菌体DNA整合进入宿主染色体,细菌进入溶原状态。
溶原与溶菌状态协调调节:A、λ感染细菌,右向合成Cro和CⅡ。
Cro抑制CI阻遏蛋白合成,进入溶菌生长状态;
CⅡ促进CI阻遏蛋白合成,进入溶原生长状态。