香港海鸥形菌检验技术的建立与应用

[基金项目 ]　2007年浙江省医药卫生科技计划 (2007A169) ; 2007 年杭州市科技局重点资助项目 (20070433Q03) [作者简介 ]　倪晓平 (1955 - ) ,男 ,主任医师 ,主要从事感染性疾 病监测与管理工作。 【论著 】 香港海鸥形菌检验技术的建立与应用 倪晓平 1 ,孙建荣 1 ,项海青 1 ,查捷 1 ,任淑华 2 ,李长春 1 ,孔庆鑫 1 ,金慧 1 ,徐虹 1 ,俞骅 1 ,周田美 2 ,赵洪峰 2 (11杭州市疾病预防控制中心 ,杭州 　310006; 21杭州市第一人民医院 ,杭州 　310006) [摘要 ]　目的 :建立香港海鸥形菌 (Laribacter hongkongensis, LH)的社区获得性胃肠炎患者及淡水鱼类标本采样、运输、培 养、分离及鉴定方法。方法 :于 2005年 ～2006年 ,采集社区获得性胃肠炎患者及淡水鱼类新鲜粪样 ,分别接种 SS、XLD、 CCDA、TCBS、MacConkey琼脂 (MA)以及改良头孢哌酮 MacConkey琼脂 (CMA)等 6种培养基 ,对典型的菌落 ,进行常规生 化试验 ,凡氧化酶、触酶试验阳性以及三糖铁试验阴性的菌株 ,采用特异性 PCR检测确诊。结果 :社区获得性胃肠炎患者 的 LH检出率为 0153% (4 /759) ;淡水鱼类草鱼、鲢鱼与鲈鱼的阳性率分别为 9130%、8133%和 5188%。结论 :本文建立 的 LH 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型与基因型诊断技术适合于 LH的诊断 ;当前 LH缺乏血清学诊断 ,发展 LH的 PCR诊断方法具有现实意义。 [关键词 ]　香港海鸥形菌 ; 社区获得性胃肠炎 ; 淡水鱼 ; PCR [中图分类号 ]　R44615　　　　[文献标识码 ]　A　　　　[文章编号 ]　1004 - 8685 (2007) 12 - 2162 - 03 Establishm en t and applica tion of a set of d iagnosing m ethods for L a ribac te r hongkongensis N I X iao2ping1 , Sun J ian2rong1 , X iang Hai2qing1 , Cha J ie1 , Ren Shu2hua2 , L i Chang2chuen1 , Kong Q ing2xing1 , J in Hui1 , Xu Hong1 , Yu Hua1 , Zhou T ian2m ei2 , Zhao Hong2feng2 (11Hangzhou Center for D isease Control and Prevention, Hangzhou 310006, China; 21Hangzhou First Peop le′s Hosp ital, Hang2 zhou 310006, China) [ Abstract] 　O bjective: To establish a set of methods for L aribacter hongkongensis samp ling, transportation, culture, isolation and identification1M ethods:A ll fecal swabs were freshly collected from outpatients with community - acquired diarrhea and fresh2 water fish from 2005 to 20061Samp les were inoculated on six culture agar media: XLD, TCBS, SS, CCDA,MacConkey agar(MA ) and modified cefoperazone MacConkey agar (CMA) 1The characteristic colonies on the selective medium were selected out, and tested by three briefness conventional biochem ical tests1Those positive on the oxidase and catalase tests, negative on the trip le sugar iron agar were selected and identified by special PCR1Results:W e discovered four L1hongkongensis strians from 759 outpa2 tients with community - acquired diarrhea, the positive rate was 0153% 1The rate of grass carp, silver carp and perch were 9130% , 8133 and 5188% , respectively1Conclusion:A set of diagnosing methods for L1hongkongensis are established1PCR de2 tection is developed to be significant for L1hongkongensis identifying without serological diagnosing methods1 [ Key words] 　L aribacter hongkongensis; Community - acquired gastroenteritis; Freshwater fish; PCR 　　香港海鸥形菌 (Laribacter hongkongensis, LH )被认为是一 种新的食源性腹泻的病原体。该菌于 2001年 ,由 Yuen等 [ 1 ] 从一名患者的血液和胸腔脓液中分离到一株新的细菌 ,经鉴 定该菌为兼性厌氧 ,不产芽胞 ,革兰染色阴性 ,为变形菌门 ( Proteobacteria)、β - 变形菌纲 (B etaproteobacteria )、奈瑟菌科 (N eisseriaceae)的一个新属 ,由于该细菌在香港首次报道、且菌 体呈海鸥形 ,故命名为香港海鸥形菌 (L aribacter hongkongen2 sis1gen1nov1, sp1nov1)。嗣后 ,Woo等 [ 2 ]不仅在香港社区获得 性腹泻患者中分离到该菌 ,还在瑞士本土以及该国前往亚洲、 欧洲、美洲和非洲的腹泻患者粪样中检出该菌 ;提示该菌是呈 全球性分布的重要病原体。2004年 ,Woo等一项多中心病例 -对照研究表明 , LH为社区获得性胃肠炎的潜在病原体 ,其 感染的危险因素包括食用淡水鱼及外出旅行 [ 3, 4 ]。 我们于 2005年 6月始 ,开展腹泻患者与淡水鱼类的 LH 检索工作 ,并于 2005年 11月在中国内地首次从一名社区获得 性腹泻患者中分离到该菌 [ 5 ] ;至 2006年底 ,共从 4例腹泻患者 及 3种淡水鱼中分离到 21株 LH。两年来 ,我们根据 Lau等文 献报道 [ 6 ] ,简化了有关 LH检验程序 ,并部分改良了分离培养 剂的配方 ,建立本实验室有关 LH的表型与基因型诊断技术。 1　材料与方法 111　培养基 参照文献 [ 6 ]制备 SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂 (MA)以及改良头孢哌酮 MacConkey琼脂 (CMA )等 6种培养 基 ,但本文对 CMA中的头孢哌酮 (Cefoperazone)浓度略做调 整 ,剂量较文献 [ 6 ]减少 50% ,其含量为 16 mg/L。 SS、XLD、 TCBS、MA及 CMA培养皿置 37℃, 48 h; CCDA培养皿置 5% CO2 环境培养 , 42℃, 48 h。上述培养基均采用中国检验检疫 科学研究所北京陆桥技术公司产品。 112　人体标本 2005年～2006年 ,对前往杭州市第一人民医院肠道门诊 就诊的社区获得性胃肠炎患者 ,统一登记流行病学调查表 ,内 容包括一般情况、腹泻特征、外出旅游史和近期饮食史等。无 2612 中国卫生检验杂志 2007年 12月 第 17卷 第 12期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Dec 2007; Vol 17　No 12 菌棉签采集新鲜粪便标本 ,插入 Cary - B lair运送培养基试管 , 带回实验室划线接种于 CMA等 6种分离培养基。 113　鱼类标本 于 2006年 8月、10月 ,两次对我市某大型酒家待杀新鲜 活鱼 (草鱼、鲢鱼与鲈鱼 )进行现场解剖 ,采用无菌棉签采集鱼 体中、后肠内粪便 ,插入运送培养基带回实验室 ,划线接种于 MA、CMA两种培养皿。 114　生化试验 参照文献 [ 1 ] ,从 MA、CMA培养基上分离到的无色、透明、 扁平状 ,直径在 015～110 mm 之间的微小菌落 ,进行氧化酶、 触酶、三糖铁反应试验。其中氧化酶、触酶试验同时阳性 ,且 三糖铁反应阴性的可疑细菌接种于 AP I20NE、ID32E生化条 , 做进一步的生化试验。上述生化条均为法国生物梅里埃公司 产品。 115　基因诊断 11511　PCR模板 DNA的制备 　用接种环挑取经生化试验检 测为可疑菌落若干 ,于 500μl 无菌蒸馏水中 ,振荡混匀 , 7000 r/m in离心 5 m in,去上清 ;加入 500μl无菌蒸馏水 ,水浴 煮沸 10 m in, 7000 r/m in离心 5 m in,取上清液作为模板。以 LH杭州株 LHHZ242模板 DNA为阳性模板对照 ,并以蒸馏水 为阴性模板对照。 11512　特异性 PCR的引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 　根据我们首次分离到的香 港海 鸥 形 菌 杭 州 株 (代 号 LHHZ242; Genbank 登 录 号 : DQ396525)的 16S rRNA 序列设计引物 ,序列为 P2F: 5′TT2 GAGGGTGCCCGAAAGGGA3′, P2B: 5′CTACCCACTTCTGGCG2 GATT3′。 11513　反应体系 (50μl) 　10 ×PCR缓冲液 5μl, 25 mmol/L MgCl2 4μl, 215 mmol/L dNTPs 4μl, 5 U /μl的 Taq DNA 聚合 酶 0125μl, 016 mmol/L 的引物各 1μl,模板 DNA 5μl,双蒸 水 29175μl。 11514　反应程序 　94℃ 5 m in; 94℃ 015 m in, 55℃ 015 m in, 72℃ 1 m in, 35个循环 ; 72℃ 5 m in。 11515　16S rRNA基因测序 　从特异引物 PCR阳性菌株中 , 随机抽样 ,进行 16S rRNA基因 PCR扩增 , 方法参照文献 [ 2 ]。 PCR扩增产物由上海 Sangon公司进行序列测定。 116　透射电镜 ( TEM )观察 取 LH人体株 LHHZ242与草鱼株 LHHZ27,经无菌蒸馏水 洗脱 , 2% PTA染色 2～5 m in,在 TEM下观察其菌体大小及形 态特征。 2　结果 211　人体 LH检出结果 2005年 ～2006年 ,采集 759份社区获得性腹泻患者粪便 标本 ,分离到 LH菌株 4株 ,检出率为 0153% ;该 4例患者未检 出沙门菌、志贺菌、致病性大肠杆菌、弧菌和空肠弯曲杆菌 ; 4 例患者粪便涂片检查寄生虫虫卵和卵囊结果也均阴性。4例 LH感染者均居住在杭州市 ,发病前 2周内均未离开过杭州 ; 4 例感染者的主要临床特征为 :黄色水样腹泻 ,日腹泻 3～10次 不等 ;不发热 ,除一例有阵发性腹痛外 ,其余 3例无腹痛 ;无呕 吐、无里急后重。临床使用沙星类药物治疗有效。所有患者 在服药后两天内停止腹泻。 212　鱼类 LH检出结果 共采集 3种淡水鱼 ,计 194条 ,分离到 LH17株 ,阳性率为 8176% ;其中草鱼 129条 ,分离到 LH 12株 ,阳性率为 9130% ; 鲢鱼 48条 ,分离到 4株 ,阳性率为 8133% ;鲈鱼 17条 ,分离到 1株 ,阳性率 5188%。经 Fisher′s Exact Test检验 , 3种淡水鱼 阳性率差别无统计学意义 (χ2 = 01104, P = 11000)。 213　LH菌落特征 经 48 h培养后 ,菌落在 CMA培养基上呈无色、透明、扁平 状 ,边缘光滑整齐 ,直径在 015～110 mm 之间的微小菌落 ;在 MA上可见少量的上述可疑菌落混杂在众多的粉红色菌落之 中。菌落挑取时与琼脂面无粘连。 214　LH生理生化特征 从人体、鱼类分离到的 LH菌株 ,氧化酶、触酶试验为阳性 及三糖铁试验阴性。采用 ID32E、AP I20NE试剂条进行检测 , 其生理生化试验结果除 CAP ( Yuan等报道 [ 1 ]为阳性 ,本文结 果为阴性 )外 ,均与香港株 HKU1相符合 ,革兰染色阴性 ,尿素 酶和精氨酸双脱氢酶阳性 ;鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阴 性 ;不能利用柠檬酸盐 ,不能还原硝酸盐 ,不发酵葡萄糖 ,不发 光 ,不溶血 ;动力十分明显等特征。香港海鸥形菌杭州株 LH2 HZ242株与香港株 HKU1的生化特征比较详见表 1。 表 1　L HHZ 242杭州株与 HKU1香港株的生化特征比较 生化反应或酶 香港海鸥形菌(HKU1株 ) LHHZ242株 ID32E AP I20NE 氧化酶 + + ODC (鸟氨酸脱羧酶 ) - - ADH (精氨酸双脱氢酶 ) + + + LDC (赖氨酸脱羧酶 ) - - URE (脲酶 ) + + + βGAL (β - 半乳醣苷酶 ) - - - NO3 (硝酸盐还原 ) + + IND (产吲哚 ) - - - ESC (水解七叶灵 ) - - GEL (水解明胶 ) - - GLU (葡萄糖发酵 ) - - - 同化有机碳源 　MAN (甘露醇 ) - - - 　MAL (麦芽糖 ) - - - 　ADO ( adonital) - - 　MNT(丙二酸钠 ) - - 　GLU (葡萄糖 ) - - - 　SAC (蔗糖 ) - - 　LARA (L - 阿拉伯糖 ) - - - 　RHA (L - 鼠李糖 ) - - 　 INO (肌醇 ) - - 　SOR (D - 山梨醇 ) - - 　NAG(N -乙酰 -葡萄糖胺 ) - - 　GNT(葡萄糖酸盐 ) - - 　CAP (癸酸 ) + - 　AD I(己二酸 ) + + 　MLT(苹果酸 ) + + 　C IT(柠檬酸钠 ) - - 　PAC (苯乙酸 ) - - 215　基因诊断结果 氧化酶、触酶与三糖铁 3项生化试验均符合筛选 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的 标本 ,共计 21株 ,其中人体株 4株 ,鱼类株 17株 ,经特异引物 PCR检测 ,结果均阳性 (部分结果见图 1)。从中选择 8株 (人 体 2株 ,鱼类 6株 )进行 16S rRNA基因序列分析 ,经 BLAST比 对显示 , 与 Yuen 等报 道 [ 1 ] LH 香 港 株 HKU1 (登录 号 : 3612中国卫生检验杂志 2007年 12月 第 17卷 第 12期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Dec 2007; Vol 17　No 12 AF389085)相应序列的相似度达 99% ～100% (人体株 Gen2 Bank登录号 : EF032599、EF032594;鱼类株 GenBank登录号 : EF032595～ EF032598、EF032600、EF032601)。 图 1　香港海鸥形菌特异引物 PCR扩增产物电泳照片 1、2来源于人体 ; 3～9来源于鱼类 ; 10为阴性对照 ; 11为阳性对照 216　LH电镜下观察结果 LHHZ 242株与 LHHZ 27株在 TEM下菌体均呈海鸥形弯 曲 ,菌体长为 215～315μm,菌体两端均可见鞭毛 ,鞭毛长约 910μm,约为菌体的 3倍 ;单端鞭毛数量最多可达 9根 ,其中 LHHZ 242株最多可见 5根 ;而 LHHZ 27株则最多可达 9根 (见图 2a、b) ;来自不同生物体的菌株形态与大小无差异。 图 2　香港海鸥形菌 TEM 照片 ( 15000 ×) a为人体菌株 LHHZ242; b为鱼类菌株 LHHZ27 3　讨论 本文调查结果显示 ,杭州市社区获得性胃肠炎患者 LH阳 性率为 0153% (4 /759) ,略高于香港患者 (0145% ) [ 3 ] ;而鱼类 平均阳性率为 8176% ,则明显低于香港地区的 24%的阳性 率 [ 7 ]。目前 ,中国四大著名的淡水鱼种 ,草、青、鲢、鳙 ,除青鱼 外均已报道检出 LH [ 7 ] ,鲢鱼系本文首次检出。 自 2001年发现 LH以来 ,该菌被证明与胃肠炎、旅游者腹 泻以及食用淡水鱼有关。根据患者旅游史 ,提示该菌可能呈 全球分布 ,患者至少到过 4个大陆 ,亚洲、欧洲、非洲和中美 洲。但是 ,根据资料显示 ,在全球范围内 ,从本地腹泻患者中 分离到该致病菌的国家和地区目前仅为香港、瑞士和中国内 地。 本文对 MacConkey琼脂中的头孢哌酮浓度进行了调整 , 将 MacConkey琼脂中的头孢哌酮 ( Cefoperazone)浓度设置为 16、24及 32 mg/L 不同的 3个剂量组 ,经预试验结果显示 , 32 mg/L剂量组几乎无菌落生长 ,而 16 mg/L 组则可见到第 4 区的单个菌落生长 ;而 24 mg/L通常只能见到第 2区有菌落。 为了提高 LH的检出率 ,尽可能不遗漏一例可疑菌落 ,本文将 MacConkey琼脂中的头孢哌酮 ( Cefoperazone ) 浓度设置为 16 mg/L。 LH在 CMA平皿上的典型菌落形态为无色、透明、扁平状 , 边缘光滑整齐的微小菌落 ,易挑取。本文采用国产与进口琼脂 比较显示 ,典型的菌落在国产与进口 MacConkey琼脂 (OXO ID LTD1)上 ,其菌落大小无差异 ,但透明度略有区别 ,国产琼脂上 的菌落透明度较好 ,而在 OXO ID琼脂上则略带淡灰色。 　　目前 ,鉴定 LH需经过较复杂的生化试验 ,整个过程耗时 费力 ,不利于快速检测。为此 ,本试验首先是挑选 CMA平皿 上的典型菌落 ;再行 3项简便的生化试验 ,即氧化酶、触酶试 验同时阳性 ,且三糖铁反应为阴性的菌株 ,其诊断为 LH的可 能性极高。本试验检出的符合这 3项生化试验的 20余株可疑 菌株 ,后经 PCR检测 ,均被确诊为 LH。故氧化酶、触酶试验、 三糖铁试验可作为 LH的初筛方法。 PCR检测方法优点较为突出 ,其用时短 ,灵敏度较高 ,易 于操作。其检测结果与 16S rRNA基因序列分析、TEM观察结 果完全吻合 ,因此该方法可以作为 LH检查的确诊方法。本文 设计的 LH筛选与确诊方法是 :在选择性培养基上生长的典型 菌落 ;革兰染色阴性 ;氧化酶、触酶同时阳性 ,且三糖铁阴性 ; 经特异引物 PCR检测为阳性的菌株 ,即可判定为 LH菌株。 TEM下的 LH鞭毛变化较大 ,人体株的鞭毛单侧最多为 5 根 ;而鱼株最多可达 9根。Yuen等首次发现的 HKU1株则为 无动力的 [ 1 ] ;嗣后 ,Woo等在所有的腹泻患者粪便中分离到的 菌株则均有动力的 ,并在电镜下观察到菌体两端带有鞭毛 ,但 未报道鞭毛的数量 [ 2, 4 ]。本文发现的不同生物体来源的菌株 , 其鞭毛数量的差异是因为来自不同生物体的菌株所显现的特 征 ,抑或是取样的误差所致 ,有待进一步研究。 综上所述 ,为了有利于临床上及时发现 LH感染相关的腹 泻患者 ,深入开展流行病学与临床学的研究 ,发展一套简便、 实用、特异的实验诊断技术十分重要。为此 ,本文建立了一套 LH实验室诊断技术 ,包括表型诊断与基因诊断 : ①挑选头胞 哌酮改良 MacConkey琼脂选择性培养基上的典型菌落 ,加革 兰染色阴性 (筛选 ) ; ②3种简单的生化试验 ,即氧化酶、触酶与 三糖铁试验 (筛选 ) ; ③特异性 PCR检测 (诊断 )。本文认为当 前 LH尚缺乏血清学诊断技术 ,因此 ,开发 PCR诊断技术具有 其重要意义。 [参考文献 ] [ 1 ] Yuan KY, Woo PC, Teng JL, et al1Laribacter hongkongensis gen. nov. , sp1nov1, a novel gram - negative bacterium isolated from a cir2 rhotic patient with bacterem ia and empyema [ J ] 1J Clin M icrobiol, 2001, 39: 4227 - 42321 [ 2 ] Woo PC, Kuhnert P, Burnens AP, et a l1Laribacter hongkongensis: a potential cause of infectious diarrhea [ J ] 1D iagn M icrobiol Infect D is, 2003, 47: 551 - 5561 [ 3 ] Woo PC, Lau SK, Teng JL, et al1A ssociation of Laribacter hongkon2 gensis in community - acquired gastroenteritis with travel and eating fish: a multicentre case - control study[ J ]1Lancet, 2004, 363: 1941 - 19471 [ 4 ] Woo PC, Lau SK, Teng JL, et a l1Current status and future directions for Laribacter hongkongensis, a novel bacterium associated with gastro2 enteritis and traveler′s diarrhea [ J ] 1Curr Op in Infect D is, 2005, 18: 413 - 4191 [ 5 ] N i XP, Ren SH, Sun JR, et a l1Laribacter hongkongensis isolated from a patient with community - acquired gastroenteritis in Hangzhou City [ J ]1J Clin M icrobiol, 2007, 45: 255 - 2561 [ 6 ] Lau SK, Woo PC, Hui W T, et a l1U se of cefoperazone MacConkey agar for selective isolation of Laribacter hongkongensis [ J ] 1J Clin M i2 crobiol, 2003, 41: 4839 - 48411 [ 7 ] Teng JL, Woo PC, Ma SS, et a l1Ep idem iology of Laribacter hongkon2 gensis, a novel bacterium associated with gastroenteritis[ J ]1J Clin M i2 crobiol, 2005, 43: 919 - 9221 (收稿日期 : 2007 - 08 - 08) 4612 中国卫生检验杂志 2007年 12月 第 17卷 第 12期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Dec 2007; Vol 17　No 12