NIV毒素和硒对软骨蛋白聚糖代谢的作用

论　　著 NIV 毒素和硒对软骨蛋白聚糖代谢的作用 曹 ˜华1 ,曹峻岭2 ,曹励民1 ,李蔚勃2 (1 西安医学院检验教研室 ,陕西 西安 710021 ;2西安交通大学医学院地方病研究所、教育部环境与疾病 相关基因重点实验室 ,陕西 西安 710061) 　　摘要 :目的 　研究大骨节病有关病因因素 N IV 毒素和硒对软骨细胞外基质蛋白聚糖代谢的损 伤和保护作用 ;探索其引起软骨细胞变性坏死的机制。方法 　在体外单层培养的人胚软骨细胞中 加入 N IV 毒素和硒 ,5 d 后收集软骨细胞和细胞培养液 ,利用半定量 R T2PCR 方法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 蛋白聚糖 核心蛋白 mRNA 在软骨细胞中的转录情况 ;利用咔唑2硫酸法检测软骨细胞培养液中葡萄糖醛酸 水平。结果 　N IV 毒素使软骨细胞中蛋白聚糖核心蛋白 mRNA 水平明显下降 ,毒素培养液中葡 萄糖醛酸的浓度明显增加。毒素加硒组与毒素组变化趋势一致 ,但数值略下降。组间差异有统计 学意义 ( P < 0. 05) 。结论 　N IV 毒素能从转录水平抑制软骨细胞蛋白聚糖的合成 ,加速蛋白聚糖 降解 ,造成基质中蛋白聚糖代谢紊乱 ,关节软骨受到损伤。补硒可以在一定程度上拮抗 N IV 毒素 对软骨细胞的毒性作用 ,但保护作用有限 ,不能从根本上防止损伤的发生。 关键词 :软骨细胞 ;N IV 毒素 ;硒 ;蛋白聚糖 ;大骨节病 　　　中图分类号 :Q581 ; R363 ; R684. 1 　　文献标识码 :A　　文章编号 :100128883( 2008) 0120001203 Effects of nivalenol and selenium on the metabolism of aggrecan in chondrocytes CAO Pei2hua1 , CAO J un2ling2 , CAO Li2min1 , L I Wei2bo2 (1 X i’an Medical Universit y , X i’an S haanx i 710021 , China; 2 I nsti tute of Endemic Diseases , Envi ronment Related Gene Key L aboratory of Minist ry of Education , X i’an J iaotong Universit y , X i’an S haanx i 710061 , China) 　　Abstract :Objective 　To investigate t he effect of nivalenol and selenium on t he metabolism of aggrecan in t he cultured chondrocytes , and to explore the mechanism involved in cartilage aggrecan catabolism in t he process of kashin2beck disease. Method 　Aggrecan mRNA expression was st ud2 ied by R T2PCR. The concent ration of GlcUA in cult ure medium was determined by dip henyleni2 mine2sulf uric acid met hod. Result 　N IV significantly decrease aggrecan mRNA expression. That selenium can partially antagonize t he effect of N IV on aggrecan mRNA expression. The content of GlcUA in medium wit h N IV was higher than t hat in other group s. Conclusion 　N IV could inhibit chondrocyte synt hesis aggrecan , p romote t he loss of aggrecan f rom cartilage. All t he effect s result in the metabolic disorder of t he cartilage aggrecan , which event ually leads to irreversible mechani2 cal dest ruction of t he cartilage. It suggested t hat selenium can partially alleviate t he effect s of N IV on chondrocytes cult ured in vit ro . Key words :chondrocytes ;nivalenol ; selenium ;aggrecan ;kashin2beck disease 收稿日期 :2007211229 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30471499) 作者简介 :曹 ˜华 (1974 - ) ,女 ,陕西西安人 ,硕士 ,主要从事生物化学与分子生物学检验的教学工作。 通讯作者 :曹峻岭 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事骨软骨生化、地方病发病机制及软骨组织工程的研究。 Tel : (029) 82655193 ; E2mail : caojl @mail . xjtu. edu. cn ·1·国外医学医学地理分册 　2008 年 3 月第 29 卷第 1 期 　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　大骨节病 ( kaschin2beck disease , KBD) 是一种 危害十分严重的地方性骨关节病 ,其最主要的病理 变化是关节软骨细胞变性坏死 ,软骨基质代谢紊乱。 大骨节病的病因仍不清楚 ,目前国内研究的重点是 真菌中毒和缺硒复合学说[1～3 ] 。流行病学资料报 道 ,大骨节病区的玉米和小麦中均检测到雪腐镰刀 菌烯醇 (N IV) 等真菌毒素 ,且病区与非病区间呈显 著性差异[4 ] 。国内外对骨关节病的研究发现 ,在软 骨基质降解过程中 ,蛋白聚糖的丢失是目前所知的 关节软骨损伤过程中最早发生的事件之一[5 ] ,远远 早于胶原的降解和关节软骨出现病理改变 ,因此 ,蛋 白聚糖的丢失可以看作是骨关节疾病发生发展的始 动因素。软骨细胞是大骨节病的靶细胞 ,因而以软 骨细胞为研究对象 ,阐明 N IV 毒素和硒在关节软骨 基质蛋白聚糖代谢中所起的作用 ,对我们研究大骨 节病的发病机制有着重要的指导意义。 1 　材料与方法 1 . 1 　试剂 N IV 毒素 (日本和光纯药工业株氏会社 ) , Na2 SeO3 (重庆俞州精细化工厂) ,DM E/ F212 培养 基 ,RNA 提取试剂 TRIzol (美国 Invit rogen 公司) PCR 反应体系 (美国 MBI 公司) ,反转录试剂盒 (美 国 MBI 公司) 。 1 . 2 　细胞培养 软骨细胞培养的步骤见文献[6 ] ,收获的原代培 养细胞经胰酶消化后传代 ,以 40 万/ 瓶接种于培养 瓶中。置于 CO2 培养箱 37 ℃培养。稳定 24 h 后分 别换入含实验因子的各组培养液 ,48 h 换培养液 1 次 ,于实验因子作用 5 d 后 ,收集细胞培养液待检。 1 . 3 　实验分组 采用随机分组 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 方法。培养瓶单层培养分为 4 组 :即对照组 (含 15 %新生牛血清、青霉素 100U/ ml 和链霉素 100U/ ml 的 DM E/ F212 培养液) 、N IV (0. 1 mg/ L) 组、对照加硒组、N IV (0. 1 mg/ L) 加硒 组。每个小组含样本 5 例。 1 . 4 　引物设计 Aggrecan 上游引物 : 5′2CTCCACT GCCT GT2 GAA GTCACCAC23′ Aggrecan 下 游 引 物 : 5′2GCACCA T GCCT2 TCT GCT TCCGA G23′ GA PD H 上 游 引 物 : 5′2ACT GCCAC2 CCA GAA GACT GT GGA T GG23′ GA PD H 下游引物 : 5′2T TACTCCT T GGA G2 GCCA T GT GGGCC23′ 1 . 5 　总 RNA 提取和 R T2PCR 具体步骤见文献[7 ] 。 1 . 6 　细胞培养液中葡萄糖醛酸水平的测定 在细胞培养液中加入饱和醋酸钠无水乙醇溶 液 ,收集沉淀并加入四硼酸钠硫酸和咔唑试剂 ,在 530 nm 波长处 ,比色测定。 2 　结果 2 . 1 　R T2PCR 结果 图 1 中 620bp 处可见到荧光印迹 ,为蛋白聚糖 核心蛋白 (Aggrecan) 扩增条带 ;在 465bp 处可见到 荧光印迹 ,为 GA PD H 扩增条带。利用凝胶成像系 统 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 后 ,通过 IODAggrecan/ IOD GA PD H 计算各 组的相对值 ,可以看出 :与对照组相比 ,其余各组的 值均低于对照组 ,尤以毒素组最为明显 ;毒素加硒组 比毒素组高 ,但比加硒组低 (比较结果见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1) 。 图 1 　Aggrecan、GA PD H 琼脂糖电泳图谱 表 1 　Aggrecan/ GA PD H 灰度比值 编号 分组 IODAggrecan IODGAPDH IODHAS - 2 /IODGAPDH 1 2 3 4 对照组 N IV (0. 1 mg/ L) 组 Se (0. 1 mg/ L) 组 N IV (0. 1 mg/ L) + Se 组 21899 2134. 6 14719 3063. 7 29454 31383 31988 33494 0. 74 0. 07 0. 46 0. 09 2 . 2 　细胞培养液中葡萄糖醛酸浓度 由表 2 可以看出 ,与对照组相比 , N IV 毒素使 细胞培养液中葡萄糖醛酸 ( GlcUA) 的含量增加 ;毒 素加硒组 GlcUA 的含量比单纯加硒组明显增加 ,但 与毒素组相比 ,数值降低。 表 2 　细胞培养液中 GlcUA 含量 (mg/ L) 组别 例数 GlcUA (x ±s ) 对照组 5 0. 3100 ±0. 0264 N IV (0. 1mg/ L)组 5 0. 4233 ±0. 04163 Se (0. 1mg/ L)组 5 0. 2667 ±0. 0251 N IV (0. 1mg/ L) + Se 组 5 0. 4002 ±0. 0463 ·2· 　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　国外医学医学地理分册 　2008 年 3 月第 29 卷第 1 期 图 2 　各组葡萄糖醛酸含量变化趋势图 经显著性检验 ,方差分析结果显示 (见图 2) :对 照组和 N IV 毒素组 ( 3 P < 0. 05) 、加硒组和 N IV 毒素加硒组 ( # P < 0. 05) 之间 GlcUA 含量具有显 著性差异 ,对照组和对照加硒组、毒素组和毒素加硒 组之间 GlcUA 含量没有显著性差异。 3 　讨论 蛋白聚糖是一类由糖胺聚糖共价连接于核心蛋 白所组成的糖复合物 ,是关节软骨细胞外基质的重 要组成部分。因此 ,可以通过监测胞外基质中蛋白 聚糖代谢的情况来了解软骨细胞合成和分解的情 况。 实验结果显示 ,N IV 毒素对蛋白聚糖的合成具 有抑制作用 ,表现为毒素组蛋白聚糖核心蛋白 mR2 NA 水平最低 ,其次是毒素加硒组。毒素组与毒素 加硒组基因表达无显著性变化。硒可以减轻但不能 完全对抗毒素对蛋白聚糖合成的抑制作用。国内外 对退行性骨关节炎 (OA) 疾患中蛋白聚糖改变的研 究尚存在争议 , CS2Szabo 等[8 ] 对 OA 患者研究发 现 ,与正常人相比蛋白聚糖核心蛋白 mRNA 水平及 蛋白表达增强。而 Bluteau 等[9 ] 报道体外诱导兔进 行性 OA 疾患时 ,其蛋白聚糖核心蛋白 mRNA 水平 降低。因此 ,N IV 毒素对软骨细胞基质中蛋白聚糖 所造成的损伤是否与 OA 存在类似或不同的变化机 制 ,还值得我们进一步深入研究。 GlcUA 是蛋白聚糖的重要组成成分 ,是软骨基 质代谢的重要产物 , GlcUA 含量的改变可以反映蛋 白聚糖的代谢状况 ,并间接反映出基质代谢正常与 否。该实验可见 :在 N IV 毒素作用下 ,软骨细胞培 养液中 GlcUA 的浓度明显增加 ,表明基质蛋白聚糖 的代谢状况发生了改变。加硒后 , GlcUA 含量有所 下降。但毒素组和毒素加硒组之间 GlcUA 含量没 有显著性差异。作者分析认为 : GlcUA 既是软骨细胞蛋白聚糖的结构组分 ,又是其 分解代谢的产物 ,一旦软骨细胞过度损伤 ,就有可能 破坏合成代谢和分解代谢的平衡 ,导致蛋白聚糖的 分解代谢增强 ,产生大量蛋白聚糖的组分 GlcUA 进 入胞外基质 ,细胞培养液中 GlcUA 含量升高。另 外 ,可能由于 N IV 毒素使软骨细胞发生坏死破裂或 细胞膜的通透性增加 ,细胞内 GlcUA 进入基质所 致。补硒后 , GlcUA 含量有所下降 ,说明硒对于软 骨细胞具有一定的保护作用。国内外对类风湿性关 节炎、骨性关节炎等关节疾病的研究认为 ,致病因素 导致软骨基质中蛋白聚糖代谢异常是导致骨关节病 中关节软骨变性坏死的主要病理因素。该实验支持 了这一结论 : N IV 毒素导致蛋白聚糖在 mRNA 水 平合成降低 ,而细胞培养液中 GlcUA 升高 ,提示毒 素一方面导致软骨细胞合成蛋白聚糖的能力下降 ; 另一方面在毒素作用下软骨胞外基质分解代谢增 强 ,蛋白聚糖解聚、丢失 ,表现为培养液中基质代谢 产物 GlcUA 含量明显增加 ,继而软骨细胞生存的内 环境发生异常 ,软骨细胞变性、坏死 ,关节软骨最终 受到损伤。 参考文献 : [ 1 ] 　杨建伯. 真菌毒素与人类疾病[J ] . 中国地方病学杂志 ,2002 , 21 : 3142317. 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