胃肠微生态学检测方法及临床意义

物叫做原籍菌群 ( autochthonous flora), 在正常情况下不 会转移到其他微生态环境, 如果转移了微生态环境一般不 能定植 ( co lon ization), 但是一旦转移成功了, 它就变成 外籍菌群 ( a llochthonous flora)。细菌易位 ( BT ), 一是由 原籍菌转为外籍菌, 而成为浮游菌群; 另外是胃、肠道菌 群包括过路菌向肠黏膜下转移。 关于细菌易位, 最初由 H erbst在 1844年提出的。他 认为大的颗粒如淀粉等可以通过肠道屏障进入体内。 1968 年, W o lkhe im er与 Schulz证实淀粉颗粒的确可以通过健康 人的肠壁进入体内。但是, 细菌易位这个术语直到 1977 年才被 Berg RD与 Gar lington, AW 证实。他们认为, 肠腔 内活的细菌能通过黏膜进入黏膜下的基底层 ( lam ina pro� pr ia), 并进而进入肠系膜淋巴结 (M LN ) 或其他器官 [ 7]。 BT的认识和防治是当代抗感染、调节微生态平衡的 重要举措。许多慢性病如癌症、肝功障碍衰竭、贫血及多 脏器功能衰竭等, 以及外伤、烧伤、暴饮暴食、酒精中毒 等都可能发生 BT。BT发生的诱因还有抗生素的应用。长 期、广谱抗生素的应用, 可造成肠菌群紊乱, 也是导致 BT发生的直接原因。 在肠菌群中需氧或兼性厌氧菌与厌氧菌的比是 100�1, 甚至 1 000�1, 但就这 1� 0% ~ 0�1%的需氧或兼性厌氧菌 的确成为 90%以上的 BT原因菌。细菌转移到黏膜下的基 底层, 与巨噬细胞和树突状细胞 ( DC ) 相遇, 大部分被 杀死, 少量存活的细菌又可向远隔脏器转移, 引起感染或 中毒血症如感染性中毒性休克 [ 8]。 参考文献 [ 1] 康白. 微生态学原理 � 微生态基础 [M ] . 大连: 大连出版 社, 2002: 16- 36. [ 2] 康白, 袁杰利. 正常微生物群是一个新的人体生理学系统 [ J] . 中国微生态学杂志, 2003, 15 ( 2 ): 62- 65. [ 3 ] 康白, 袁杰利. 微生态学应重视共生生理学研究方向 [ J] . 中国微生态杂志, 2003, 15 ( 4) : 139- 195. 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B iosciM icoflora, 2005, 23 ( 3) : 61- 90. 2006- 05- 09收稿 本文编辑: 郑春雨 作者单位: 中国医科大学附属第二医院检验科, 辽宁 沈阳 110004 E - m ai:l liuy@ cmu2h� com !文章编号∀ 1005- 2194 ( 2006) 13- 0963- 03 胃肠微生态学检测方法 及临床意义 刘 勇 !中图分类号∀ R5 !文献标识码∀ A 刘勇, 男。副研究员。 中国医科大学附属第二医院 检验科主任, 实验诊断学硕 士生导师。兼任 #中华医学 检验杂志∃ 临床微生物专家 组委员, #中华微生物与免疫 杂志∃ 临床微生物专家组委 员, 中华医学会检验学会辽 宁省分会委员。曾发表多篇 论著, 并承担多项省、市级 科研课题。主要从事抗菌药 物的体外和动物实验阶段的 研究, 至今已有多项研究成果。 胃肠微生态系是人体微生态学的重要组成部分, 了解 其不同部位的微生态学状况, 应采取不同部位的标本进行 检验, 可采用插管法和剖腹手术时采取标本, 但由于采样 方法繁琐, 患者依从性差, 一般不予采用。以粪便菌群作 为评估胃肠道生态状况的指标, 由于其标本易得, 已成为 目前普遍采用的方法。 事实上, 粪便微生物群落的变化, 是由微生物本身、 宿主及宿主外环境等多种因素综合作用形成的, 它并不是 大肠以上各生态系的简单汇总, 却又与各生态系菌群的变 化有着千丝万缕的联系。粪便的微生物群落, 在定性和定 量上都是恒定的, 不同年龄、不同饮食和不同种族均不会 使其发生质的变化。只有当宿主处于病理状态时, 尤其是 发生胃肠道疾病时, 才会使粪便菌群出现异常。 粪便干重的 1 /3 ~ 2 /5由细菌组成, 其数量巨大, 种 类繁多, 约有 500种的细菌 [ 1]。在常见的十几种细菌中, 绝大多数为专性厌氧菌, 包括双歧杆菌、乳杆菌、优杆 菌、拟杆菌、消化链球菌等, 也有少量的兼性厌氧菌、专 性需氧菌和微需氧菌, 如肠杆菌属细菌、肠球菌、葡萄球 菌、酵母样菌等。 目前分析检测粪便中细菌数量和种类 (也称为肠道 %963%中国实用内科杂志 2006年 7月 第 26卷 第 13期 菌群分析 ) 的方法很多, 总体可归纳为以下 3大类。 1 培养法 此法将新鲜粪便直接接种于多种不同的培养基上, 对 生长出来的菌落进行鉴定 (一般鉴定到种 )。通过控制接 种粪便重量的方法可以对肠道菌群进行定量培养。将每种 细菌的数量与参考值进行比较, 或计算 B /E (双歧杆菌 / 肠杆菌 ) 值, 即可评估肠道菌群的状况。 B /E值 > 1表示 肠道菌群组成正常, B /E值 < 1表示肠道菌群失调, B /E 值越低失调越严重 [ 2]。 由于粪便中的细菌种类繁多, 即使仅培养有意义的细 菌, 也需要十几种甚至几十种培养基, 且鉴定过程复杂, 耗时长。因此, 此种方法常用于肠道菌群方面的科学研 究, 而不适于临床常规检验 [ 3- 4]。 2 分子生物学方法 即使使用了最先进的培养方法, 我们用光学显微镜直 接观察到的细菌中, 也有 40% ~ 80%是不能培养出来的, 那么只能用分子生物学的方法证实其存在。目前, 在肠道 菌群的研究领域, 用于研究的新技术, 如: 16s rRNA基 因的聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、脉冲场凝胶电 泳、荧光原位杂交技术等 [ 5- 6]。 3 镜检法 镜检法是目前广泛采用的进行肠道菌群分析的方法, 由于所需设备简单, 操作简便, 耗时短, 很适宜临床应 用。该方法是通过油镜观察革兰染色粪便涂片的菌群象, 估计细菌总数、球菌与杆菌比例, 革兰阳性菌与革兰阴性 菌的比例, 结合各种细菌的形态特点、有无特殊形态细菌 增多等结果来综合判断菌群状况。 3� 1 粪便涂片的制作 取一洁净载玻片, 在新鲜粪便上 多处蘸取标本, 以 30&~ 40&的角度, 匀速推片于洁净的 载玻片上, 使其厚度与血膜相似。推片后立即用清水冲 洗, 并置于消毒剂中消毒后, 才可继续使用。 取标本时应注意粪便的颜色、性状, 是否有膜状物, 遇黏液便、胨样便或水样便, 可用便签直接涂片或滴注涂 片, 涂片可稍厚。 3� 2 染色方法 革兰染色法, 阳性菌染成紫色, 阴性菌 染成红色, 合格涂片中阳性菌和阴性菌要对比鲜明。 3� 3 显微镜检查方法 3� 3�1 观察细菌总数 观察菌群涂片时首先要计数细菌 总数, 这是肠道菌群是否处于平衡状态的一个重要指标。 没有必要对细菌数进行准确计数, 初学者可以先计数部分 (如 1/8视野 ) 油镜视野中细菌的数量, 再对整个视野进 行估计, 观察几个视野后取平均值。一般来说, 每视野细 菌数在 501~ 5 000个为正常, 101~ 500个为轻微减少, 11~ 100个为明显减少, 11个以下为显著减少, 也有高于 5 000的情况, 但较少见, 临床意义不大。细菌总数减少 则与肠道菌群失调存在密切关系, 应引起重视, 并结合细 菌类别构成等指标进行综合评估。 3�3�2 细菌类别构成 仅仅计数细菌总数并不能完全反 映肠道菌群的状态, 细菌种类及数量与粪便性状和胃肠道 功能有着密切的联系, 而且正常粪便中常见细菌的构成是 基本恒定的, 不受稀释和浓缩的影响。因此粪便中细菌类 别构成是更有意义的指标。 由于通过涂片镜检的方法无法精确区分细菌种类, 一 般就细菌形态和染色性将细菌分为 4大类, 即革兰阳性杆 菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌, 通过 计算 4者的比例来评估肠道菌群的特征。 具体计数方法为: 计数 1 000个细菌中各类细菌的百 分率。可先计数部分视野中 (如 1 /8视野 ) 各类细菌数, 然后估计全视野中的各类细菌数。 由于正常粪便中数量最多的细菌如双歧杆菌、乳杆 菌、优杆菌、拟杆菌等均为革兰阳性杆菌。因此, 革兰阳 性杆菌在正常粪便中所占的比例最大, 其次为革兰阴性杆 菌。各类细菌随年龄改变会有一些变化, 尤其是婴幼儿 期, 革兰阳性杆菌所占比例在出生后会逐渐增多, 至半岁 时达最高, 以后逐渐下降。成人时期, 革兰阳性杆菌与革 兰阴性杆菌的比例约为 3�1左右。革兰阳性球菌和革兰阴 性球菌的量较少, 只占总数的 5% ~ 20%。40岁以后, 阳 性杆菌逐渐减少, 阴性杆菌逐渐增多。60岁以后, 两类 细菌的数量趋向于接近, 阳性杆菌只略多 5% ~ 10% , 此 时阳性球菌和阴性球菌只占 5% ~ 15%的比例。详细的各 年龄细菌比例参考值见表 1[ 7]。 3�3�3 特殊形态细菌 有时会在粪便菌群涂片中, 看到 一种非正常细菌明显增多, 甚至占绝对优势, 如酵母菌、 葡萄球菌和艰难梭菌, 这些菌是严重的假膜性肠炎和真菌 性肠炎的病原菌, 应引起高度重视。 3�4 结果报告方式及临床意义 肠道菌群的报告方式有 2种, 即比例法和分度报告法。 3�4�1 比例法 以球菌与杆菌比例的方式报告, 简称球 杆比, 参考值为 1�3 (成人 )。也可直接报告 ∋革兰阳性 杆菌�革兰阴性杆菌�革兰阳性球菌 �革兰阴性球菌( 的比 例 (直接比例法 ), 如 60�34�5�1, 参考范围见表 1。 如结果在参考范围内, 则表明菌群正常, 如果球杆菌 比 > 1 /3, 表明菌群失调, 比值越大, 失调越严重, 可出 现比例倒置。菌群失调时, 直接比例法的后 2个或 3个比 值会升高, 第 1个比值下降, 这种变化越严重, 表明菌群 失调越严重。 3�4�2 分度报告法 根据涂片中细菌的总数, 菌群中细 菌的构成比例, 有无特殊形态细菌增多等情况, 结合患者 的年龄、粪便性状、使用抗生素状况等综合分析, 将失调 程度分为 3度, 具体参考 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 见表 2。 %964% CH INE SE JOURNAL OF PRACTICAL INTERNAL MED IC INE Ju l2006 Vol�26 No�13 表 1 各年龄组细菌比例平均值的正常参考值 ( % ) 革兰阳性 杆菌 革兰阴性 杆菌 革兰阳性 球菌 革兰阴性 球菌 革兰阳性 杆菌 革兰阴性 杆菌 革兰阳性 球菌 革兰阴性 球菌 婴幼儿 (n= 23) ~ 1岁 78�40~ 94�50 3�50~ 16�60 1�50~ 2�60 0�30~ 1�70 0 d 胎粪一般无菌, 偶可见革兰阳性杆菌或杂菌 儿童 (n= 30) ~ 1 d 37�00~ 61�50 38�50~ 60�90 0~ 2�20 0~ 0�01 ~ 2岁 68�30~ 90�60 7�50~ 26�60 1�80~ 12�20 0�20~ 2�10 ~ 2 d 60�00~ 71�60 34�80~ 36�90 3�00~ 3�50 0~ 0�01 ~ 5岁 51�70~ 86�30 10�60~ 37�70 2�00~ 13�20 1�10~ 5�40 ~ 3 d 66�90~ 82�70 16�00~ 31�40 1�30~ 1�60 0~ 0�05 ~ 10岁 56�70~ 88�50 7�60~ 30�70 2�50~ 12�20 2�00~ 6�70 ~ 4 d 79�20~ 86�20 12�40~ 19�20 1�40~ 1�70 0~ 0�10 成人 (n= 61) ~ 5 d 85�50~ 87�50 11�00~ 12�80 1�40~ 1�70 0�08~ 0�40 18~ 25岁 54�30~ 78�30 12�20~ 35�20 2�30~ 10�50 2�40~ 9�00 ~ 7 d 75�40~ 90�10 7�20~ 20�80 1�30~ 2�90 0�10~ 0�60 ~ 40岁 54�30~ 78�60 12�20~ 35�20 2�20~ 12�50 2�40~ 9�00 ~ 15 d 72�40~ 93�30 5�30~ 18�90 0�80~ 1�90 0�10~ 0�80 ~ 55岁 39�40~ 59�30 37�30~ 49�60 2�40~ 5�90 3�40~ 6�70 ~ 1个月 76�10~ 95�20 3�30~ 21�80 0�90~ 2�60 0�20~ 1�10 ~ 65岁 35�30~ 56�80 44�30~ 49�60 2�30~ 5�90 3�60~ 6�70 ~ 3个月 80�70~ 95�90 3�20~ 17�00 0�90~ 2�90 0�30~ 1�50 66岁以上 34�50~ 55�20 26�10~ 49�60 2�80~ 10�90 3�30~ 7�40 ~ 6个月 82�10~ 96�40 2�30~ 15�80 0�50~ 2�60 0�20~ 1�10 表 2 菌群失调分度报告的依据 (参考标准 ) 涂片结果 粪便外观 临床意义 )度菌群 失调症 细菌总数在正常范围、正常低值或略有减少。革兰阳 性杆菌在正常低值, 革兰阴性杆菌多有增加, 革兰阳 性球菌在正常高值或略增多, 类酵母样菌, 梭菌未见 或极少量。总之, 仅是数量和比例轻度改变 可以是正常成形软 便, 或不成形软便 或稀便 为潜伏型, 较轻的菌群失调, 临床症状 不明显, 可逆, 即只要去除病因, 不经 治疗也能恢复 ∗度菌群 失调症 细菌总数明显减少或无明显改变, 偶见部分病例细菌 显著减少。革兰阳性杆菌明显减少; 革兰阴性细菌明 显增多, 有时达 90%以上, 有的病例革兰阳性球菌增 多 (常见有葡萄球菌、链球菌 ) , 杆菌和球菌比例倒置 (正常值约为 75�25左右 ) , 类酵母菌或梭菌明显增多。 总之, 粪便菌群已有明显改变 多为程度不等的稀 便, 也可为黏液便、 水样便、脓血样便 或柏油样便 为局限型, 中度的菌群失调, 不可逆, 不经治疗难以自然恢复。临床有慢性病 的表现, 如慢性肠炎, 慢性痢疾, 溃疡 性结肠炎, 肾盂肾炎等。∗度菌群失调 需要积极治疗, 协助患者恢复菌群平衡 状态 +度菌群 失调症 细菌总数呈明显减少。粪便中原来的菌群大部分成员 被抑制, 只有一种细菌或真菌占绝对优势, 最常见有 葡萄球菌、白色念珠菌、致病性大肠埃希菌、艰难梭 菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌等。总之, 原菌群 中的某一种少数菌成为菌群的绝对优势菌是 +度菌群 失调症的主要特点, 应同时做粪便细菌的分离和鉴定 多为程度不等的稀 便, 也可为黏液便, 常呈黄绿色或黑色, 有时可见膜状物 为弥漫型, 严重的菌群失调, 又称二重 感染。主要表现急性腹泻与肠功能紊乱。 由葡萄球菌和艰难梭菌引起的假膜性肠 炎, 真菌性肠炎可伴有电解质失衡、低 蛋白血症, 病情重或凶险。 +度菌群失 调的病人必须及时积极治疗, 挽救病人 生命 参考文献 [ 1] 康白. 微生态学原理 [M ] . 大连: 大连出版社, 2002: 219 - 244. 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