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HEK293FT细胞培养.doc

HEK293FT细胞培养

zhang敏z
2019-02-11 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《HEK293FT细胞培养doc》,可适用于医药卫生领域

细胞培养细胞是用型腺病毒株系转化,含有AdE区的人胚肾亚三倍体细胞系,是一种E区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMasterUniversity的FLGraham与JSMiley于年用DNA转染技术构建而成。细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,细胞允许Ad和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于细胞的大规模培养。细胞在无Ca或含Ca培养基中可同样生长,也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在FBSDMEM中能生长很好。一般来讲,:传代后,一周可以长满。严禁过度生长,这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积,影响病毒斑的形成和转染,传代时也不易打散。悬浮的细胞很容易大规模培养,但不容易长期保持稳定。细胞在传代次以后,其表型可能改变,生长状况不再完全是单层的了,偶尔会形成局部的细胞成团聚集,应立即抛弃,重新引入新传代的细胞。细胞培养特性:、细胞明显适应酸性环境,pH值在~时,可顺利贴壁生长,换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。、传代:倒去废液,PBS洗一次(轻),用EDTA与Trypsin消化,生长良好细胞,培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化s,然后吸去,再让剩下的EDTATrypsin作用s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化,反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。小时小时以上细胞贴壁。细胞传代时机为达汇合,传代比例为:。、细胞在低代时容易贴壁,生长良好,在传到几十代以后,易聚集成团,且贴壁不牢,用PBS冲洗时即可能脱落,即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液,最好购入时先大量冻存。、复苏细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以ml培养瓶待细胞长满瓶底的~时消化冻存,复苏时将其全部接种至个ml瓶中时较为合适。刚复苏的贴壁很慢,复苏接种后小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。、转染:体外应用细胞进行细胞转染时,如果是采用磷酸钙转染,一定要注意细胞不要全部长满细胞培养盘,长满细胞时加入磷酸钙就会使细胞大片的脱落,最好是当生长到或时进行磷酸钙转染,可以避免细胞的大量脱落。其它的经验:、用大瓶培养较小瓶要好,可能是更有利于均匀的分布,利于营养的摄取、培养液要新鲜,每次只配ml,分为瓶,不用的培养液,冻存在度,、要及时传代,最好是细胞基本铺满培养瓶底部,但是细胞之间还没有完全贴紧,总是多少有空隙的时候最好。、如果细胞贴壁不好,可能是消化过久,或是培养瓶不够干净,当然要除外细胞污染。、如果使用用玻璃培养瓶或皿,可以采用高压灭菌的明胶溶液预处理培养瓶培养皿,方法是将明胶加入培养皿,使之浸泡到底面的各个部分,然后吸出,置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。培养基GIBCODMEM粉剂,加双抗,HEPES,NaHCO配置高糖的DMEM培养基ml,一袋DMEM培养基(GIBCOBRL)用去离子水溶解加入NaHCOg加入谷氨酰胺g(终浓度为mM)加入青霉素万U(终浓度uml),链霉素万U(终浓度uml)定容ml过滤除菌、分装到两个消毒的ml瓶子中加入灭活小牛血清ml。

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