青岛大学
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应用SELDI--TOF--MS技术筛选早期胃癌血清生物标志物研究
姓名：李春伟
申请学位级别：硕士
专业：普通外科
指导教师：张佃良
20110517
应用SELDI-TOF-MS技术筛选早期胃癌血清分子标志物研究
摘要
目的：应用表面加强解吸电离一飞行时间质谱(surface-erthancod
laser
desorption／ionization
time．of-flight
mass
spectrometry，SELDI．TOF．MS)技术对胃癌
患者血清蛋白指纹图谱进行分析，筛选候选肿瘤标志物以建立诊断模型，寻找更可
靠的评价
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
用于早期胃癌诊断和临床分型以指导个体化治疗，旨在进一步提高对
肿瘤分期和预后的判断，以更好地监测治疗效果。
方法：表面加强解吸电离一飞行时间质谱技术及其配套蛋白质芯片检测169例胃
癌患者和83．例健康人的血清蛋白质组图谱，运用Biomarker
Wizard
TM和
Biomarker
PatternsTM软件分析处理数据筛选具有明确临床价值的分子标记物或其
组合，以进行早期分子诊断并建立胃癌诊断分类树模型。
’
结果：胃癌组血清与正常人血清蛋白质谱共有34蛋白表达存在统计学差异
(p
方案
气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载
睁"。因此，有必要探索研究创伤小、费用低、便于筛查，具有高度特异性和灵
敏度的肿瘤标志物进行早期胃癌的诊断。
自进入20世纪80年代以来，人们已经开始在胃癌患者外周静脉血中寻找与胃癌
相关的生物标志物，以期能够对早期胃癌进行尽早诊断。目前发现与胃癌相关的肿
瘤标志物主要有癌胚抗原(CEA)和糖链抗原19．9(CAl9．9)、125(CAl25)、242(CA242)、
50(CA50)等睁103。但这些指标敏感性、特异性均较低，尚不足于用来进行早期胃癌的
诊断。最近大量研究表明，单个肿瘤标志物尚不足用于早期肿瘤的诊断，有不少学
者利用多个肿瘤标志物组成一个蛋白质组诊断模型进行全身多个系统肿瘤的诊断，
比如肝癌‘n1刳、卵巢癌nH"、乳腺癌n蝴1、肺癌乜4删、前列腺癌嘲训、膀胱癌D2刊、胰
腺癌Ⅲ1、食管癌∞明’大肠癌∞1等疾病的差异蛋白质组学研究中发现多种疾病相关的候
选蛋白标志物。关于胃癌肿瘤标志物的研究也有所报道，只是目前所报道胃癌相关
标记物临床价值具有不确定性，这一方面反映了许多研究规模较小，纳入病例数偏
少，随访时间较短，统计学报告差；另外目前报道的研究大多数分析单一肿瘤标记
物的临床价值，对联合应用几种标记的组合分析不足。所以，还需要高质量的
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
科学的多中心试验以得出可靠的结论，急切需要迸一步研究。
近几年，新兴的表面增强激光解吸电离一飞行时间质谱(surface
enhanced
1aserdesorption／ionization—time
of
flight—mass
spectrometry
technology，’
SELDI-TOF-MS)技术为差异蛋白质组学研究提供了一个十分理想的平台，同时也为全
身多个系统肿瘤标志物的研究提供了一个理想的平台。SELDI-TOF—MS技术是由日本
著名科学家田中耕一发明，美国Ciphergen
Biosyetems公司进行进一步研究并使之
1
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商品化。该系统由3部分组成：①蛋白质芯片；②芯片阅读器③生物信息学。该技术
的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解析后形成荷电离子，不同质
荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱图案，可以显示不同蛋
白的相对分子量等信息。(工作示意图i如下)。SELDI技术能快速分析、处理大量质
谱图信息，将测得质谱图与正常人或某种疾病或者疾病不同阶段的标准图谱进行对
比，就能捕获该疾病不同阶段特异性的相关分子蛋白质。
蛾
麟
辫
图1
SELDI-TOF’船工作示意图
表面加强解吸电离一飞行时间质谱(SELDI—TOF—MS)技术不同与传统的蛋白质组
学技术，有以下一些优点：(1)1次可以实现上万种蛋白质检测分析，快速、简便、
易行、高通量、平行分析，；
(2)需样品量极少，只需25"-50个细胞所提取的蛋白
质即可；
(3)较高的信噪比；
(4)可以对小分子量的蛋白质进行鉴定；
(5)可以
和基因芯片结果进行比较分析，在蛋白质组和基因组之间建立联系；(6)应用多个
未明确性质的蛋白质或肽信号可联合组成诊断模型，对全身各系统肿瘤的早期诊断
比单一的肿瘤标志物更准确可靠，敏感性特异度更高等。SELDI-TOF-MS技术克服了
诸多传统蛋白质组学研究中无法解决的问题，实现了蛋白质芯片技术临床检测应用
的飞跃。高通量的质谱技术为寻找新的标志物用于早期肿瘤的诊断和监测治疗效果，
已经成为一个临床医学研究的新方向。本课题设计总路线如下图2。
图2本课题设计总路线
3
资料和方法
第一章资料和方法
1．1研究对象
选取我院及青岛市立医院普外科2009年5月至2010年5月连续入院的原发性
胃癌病人作为研究对象。胃癌分期标准按American
Joint
Conunittcc
on
Cancer(7th
ed，
2010)。所有病人均为汉族，经病理证实为胃腺癌，入选病例排除标准如下：(1)年
龄大于75岁；(2)患有神经性厌食、炎性肠病、免疫性疾病和内分泌疾患；(3)感
染；(4)幽门梗阻；(5)心力衰竭(心功能大于3级)、肝衰竭(Child分级C级)、
肾衰竭；(6)近4个周经过外科治疗、内镜支架术、放射治疗或化学治疗；(7)经受
过可以严重影响新陈代谢或体质量的药物治疗。健康人血清标本取自本院健康查体
中心，排除标准同胃癌排除标准，并随访一年，无胃癌病例发生。所有研究对象入
组前均取得病人或家属的知情同意，并经过医院伦理委员会的批准。
1．2试验材料
·
1．2．1主要仪器
1．STS-2脱色摇床(上海琪特分析仪器有限公司)
2．震荡器MSl
Minishaker(广州仪科实验室技术有限公司(IKA
Works
Guangzhou
ID
NO：L001500
3．Refrigerated
centrifuge
(SIGMA
Type：1—15K)
4．Gi
lson
Pipette
(上海肇嘉浜路590号)
5．pH
meter(SARTORIUS
PB20)
6．Electronic
Balance(rag
level)(SARTORIUS
BS210S)
7．Tips
P2，P20，P200，P1000(AXYGEN)
8．15
ml
vial(AXYGEN)
．
9．0．5
ml，1．5
ml
Microcentrifuge
tube(AXYGEN)
10．高速台式离心机
型号：TGL-16B
(上海安亭科学仪器厂)
11．加热磁力搅拌器
(IKA
RH—KT／C)
12．Ul
tra-low
temperature
freezer(-80摄氏度冰箱)(KELON型号：BCD一2
19wAK)
13．一30。摄氏度冰箱
(KELoN型号：BCD-219WAK)
14．自动制冰机(automatic
ice
machines)(Grant：
FM
70A)
4
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15．制去离子水机(or
Millipore)(PALL
Model：PL5121)
16．SELDI—TOF—MS仪器及其配套的弱阳离子交换芯片(WCX2)(购自美国
’
Ciphergen公司)
1．2．2主要试剂
1．尿素(urea)
2．乙睛(CAN)
3．三氟乙酸(TFA)
4．芥子酸(SPA)
5．三经基甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液(Tris—HCL)
6．经基呱嚓乙磺酸(HEPES)
．
7．3一环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)
8．无水NaAC
9．二硫苏糖醇(DTT)
(以上试剂均购自美国Sigrma公司)
10．U9的配置-5ml：
(9M
Urea，
50n!lMTris—HCl，
2％CHAPS，pH9．0)
称取2．709
Urea(MW
60．06，终浓度为9M)，加入HPLC
H：O
3ml和1M
Tri
s—HCI
250ui
pH9．0充分溶解；在上述溶液中加入CHAPS
0．1
g充分溶解；再用HPLC
H：O定容至4．5ml，
pH
9．0，加入DTT
0．059，定容至5ml；分装入500ul离心管，每管100
ul，封口，
放入-80。C深低温冰箱保存。
I
i．WCX-2
buffer的配置200ml：(50IIlM
NaAC，pH4．0)
称取无水NaAC
0．829，溶
入180ml
HPLC心O中；用HCI调pH4．0，HPLC
H20定容至200
ml，4"C保存。
12．其他试剂：HCL，HpLCHZO，生理盐水等。
1．3试验方法
1．3．1标本采集与处理
所有病例及对照组均于早晨抽取空腹静脉血5ml，4"C静置2h，然后于4"C以
3000r／：min离心lOmin，吸取上层血清分装，每管50ul，立即置-80。C深低温冰箱
保存。标本采集与处理示意见图1．1。
5
资料和方法
I
清晨～空腹母取5llII全血
U
4℃静置静置2小时
U
l
4℃以3湖t／：min离心10mj琢
量}
吸取上层血淆分装成每管50-J
U
I立即置一簟℃冰箱保存，
图1．1标本采集与处理示意图，
1．3．2血清样品处理
．
．
1．从．80℃深低温冰箱中取出血清样品，放置冰盒上融解；
2．以10，000币m，4。C离心2分钟；
3．每个芯片点需要血清3ul，将血清样品冰浴振荡30分钟并用2倍体积U9缓冲液
稀释；
5．将9ul上述样品加入108ul相应的结合缓冲液中，使血清样品的总稀释倍数达到
约40倍，混匀，避免产生气泡。
．
6．将处理好的血清样品上样到芯片上。
1．3．3芯片的选择
．常用芯片包括WCX-2(弱阳离子交换芯片)、SAX2(强阴离子交换芯片)、
IMAC．3．Ni(固定金属亲和表面芯片)和H4(疏水芯片)等化学修饰芯片。其中研究发
现【32-33]：化学修饰的WCX-2芯片，有弱阴型离子羧基结合其表面，通过与被分析
物表面正负电荷基团的相互作用而捕获蛋白，所得到的蛋白峰较多，蛋白分离效果
较好，且差异明显、稳定性强。本实验通过预实验验证上述芯片，结果现示WCX．2
芯片所得到的峰最多、蛋白分离效果最好、差异明显和稳定性强。预实验操作流程
(图1．2)。
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SEL翻嚣Q雾壤瞄
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Sample
’
1溯q警黧■——嘲炒
图1．2
SELDI．TOF．MS预实验操作流程
1．3．4们x．2操作步骤
1．小心取出WCX-2的芯片，在芯片背后标记时间、芯片种类、人血清样品的姓
名等基本资料。
2。将上述芯片装入生物芯片处理器(Bioprocessor)中。在组装生物芯片处理器
时，注意密封。
一
3．在每孔中加入200ul结合缓冲液(50
mM
NaAC，pH
4．0)，置振荡器400-600
转，分并震荡5分钟，再甩掉缓冲液。重复操作一次。操作时，注意保持芯片每
个点表面湿润；加缓冲液后要注意观察芯片表面有无气泡，假如有气泡产生，
用取液器吹去，其枪头不要接触到芯片上各点的表面。
4．上样，在芯片处理器每个孔中加入处理好的血清样品lOOul，置振荡器400—600
转，分。4"C震荡1小时。
5．甩出样品，然后将甩出的样品甩入预先装有消毒剂的容器内。
6．每孔加入结合缓冲液200ul，(50
mM
NaAc，pH
4．0)，置振荡器(400-600转
，分，4℃震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入200ul结合缓冲液，重复上述
操作一次。
7
————————————_—_——__-————-————-—_——__--_●-—--_-_l-—————_-_-_-_-I__-—————————————一
。
．
窒型塑查鲨——
7．每孔加入HPLC水200ul，然后立刻甩出。
8．快速拆开芯片处理器，取出芯片待干后，在每孔上加SPA
0．5
ul，干后在重复
加SPA0．5ul一次。
9．待干后，即上机测定。实验操作流程示意图见图1．3。
图1．3
SELDI-TOF-MS实验操作流程示意图
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1．4数据的采集与结果分析：
利用PBS-C型蛋白质芯片阅读仪读取数据，’每日用标准多肽和标准蛋白质分子
校正仪器。蛋白质芯片阅读器设置如下：检测敏感度8，激光强度165，优化蛋白质
荷比范围2000—30000kDa，最低信噪比为5，每个样品收集50个点。采用Biomarker
Wizard软件分析胃癌组与健康对照组血清蛋白质谱差异，两组之间蛋白峰比较采用
t检验，确定两组之间P
计划
项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载
全面发展及完善，后基因组计划的概念被许多著
名科学家提出，并将研究重点集中蛋白质水平。蛋白质组(proteome)源于蛋白质
(Pprotein)和基因组(genome)两个词的组合，是由澳大利亚著名科学家Wilkins和
Viiliams在1994年在意大利一次国际蛋白质组学研讨会上第一次提出，主要是指
细胞内所有蛋白质的存在形式及其活动方式，后来引申为一种基因组所表达的全套
蛋白质，而一种基因组可包括一种细胞乃至一种生物㈨1。目前，蛋白质组的确切定
义是：一种细胞、组织或生物体拥有的全套蛋白质，它不仅在同一机体的不同组织和
细胞中不同，而且在同一机体不同生理状态、不同发育阶段及不同外界环境下也有
不同‘驯。
蛋白质组学(proteomics)是一门新兴的学科，以蛋白质组为研究对象，大规模、
系统地研究蛋白质的特征及微细结构m1，尤其是蛋白质分子水平的研究，包括蛋白
质表达、蛋白质间相互作用、翻译后修饰等，由此获得疾病发生发展过程、细胞生
理生化特征和调控网络广泛、完整的认识。随着蛋白质组学研究，差异蛋白质组学
越来越受到科学家重视，并通过疾病组和对照组的比较分析，其在疾病研究中的应
用潜能得到充分展示，从而获得对于疾病发生发展及细胞代谢整体过程全面的认识
C4t]。蛋白质组学最大的优势是可以在实验中观察一个或一组蛋白质或蛋白质亚型在
特定时间下，其在生理或病理状态所发生的相应变化H引。
3．2蛋白指纹图谱技术在肿瘤研究中的应用
蛋白指纹图谱技术最早是由许洋博士于本世纪初在中国提出，并于2004年8月
在《亚太地区国际肿瘤生物学和医学暨第21届国际肿瘤标志物学术会议》和2005
年4月《美国第96届肿瘤年会》上正式报道蛋白指纹图谱技术在中国的应用。蛋白
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指纹图谱仪技术的原理：芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解析后形成荷
电离子，不同质荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱图案。
将所检测人的蛋白质图谱与正常人标准图谱相对照，分析有无差异，就知道这个人
的图谱是是否患有某种疾病，或是存有某一种或一组尚未探明的新的特异性分子标
志物。几十分钟或几分钟就可以完成整个质谱的测定过程，十分迅速，方法敏感、
特异性高，同时一般不会破坏所测定的蛋白质化学结构。
蛋白指纹图谱技术通过对蛋白质动态、全程的分析观察，对疾病早期微小变化
进行探索，将病人全套血清蛋白质变化记录下来：绘制成蛋白指纹图谱就可以显示
所测样品中各种蛋白质不同信息，并将这张图谱标准图谱进行对照，就能发现捕获
到与疾病相关的、新的、敏感性特异性高的血清蛋白质及特征。
3．3应用SELDI-TOF-MS筛选结胃癌或早期胃癌血清蛋白标志物
近年来，SELDI-TOF-MS技术在多种肿瘤的研究中已经得到越来越多的应用。临
床医学研究表明，早期发现是肿瘤治疗的关键，筛选特异性敏感性高的肿瘤相关生
物标志物对肿瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。SELDI—TOF—MS技术主要由蛋白质
芯片、芯片阅读器和生物信息学3大部分组成，具有操作简便、检测快速、多样本检
测、灵敏性和特异性高等优点。根据美国国立肿瘤研究所多中心的三期临床试验得
出结论：SELDI-TOF-MS技术是目前最有希望的对肿瘤进行早期检测诊断的技术。在
蛋白质组学研究中，蛋白质的分离技术、质谱技术和蛋白质数据库的进步完善，将
对早期肿瘤进行诊断的研究有着重要作用。
本实验结合蛋白质组学技术和蛋白指纹图谱技术，利用SELDI—TOF—MS技术对实
验组I期胃癌47例、对照组II期胃癌39例、III期胃癌46例、IV胃癌37例、健
康人83例血清样品进行蛋白检测，结果发现质荷比分别为2873m／z、5762
m／z、4526
m／z、6121
m／z、3163
m／z、和7778
m／z的6个差异蛋白指纹图谱具有显著性差异
(P35岁、不良饮食习惯、肿瘤家族史及临床症状等，初
筛出高危个体，再行X线摄片、内镜检查，这种普查检出的胃癌中，早期胃癌占15％一25
％，且1／3无临床症状。据统计，无症状胃癌患者中半数左右手术病理证实为早期胃
癌，大部分无淋巴结转移；然而有症状的胃癌患者只有33％为早期胃癌，且其中57
％已经发生淋巴结转移n¨。所以对高危人群采用传统方法筛查是一项艰巨的工作，
耗费巨大物力、财力、精力，效果仍欠理想。
2影像学检查
2．1
B超检查：单纯腹部B超检查受消化道腔内气体干扰，难以诊断早期胃癌n引；
胃癌只有发展到一定阶段，才能被B超检验出来，临床意义不大，不能作为临床有
效诊断早期胃癌的方法。
2．2
X线检查。x线胃肠钡餐检查为常用的检查方法。一般常规的X线检查早期
胃癌诊断率低，疑诊病例须行低张气钡双重造影检查，才能提高早期胃癌的诊断率。
上消化道钡餐检查简便有效，患者容易接受，在胃癌的诊断中具有重要作用，常被
作为初步检查的方法。随着双对比造影检查方法的完善，良好的双对比照影影像为
显示溃疡及溃疡周围结构的微细变化提供了条件，明显提高了上消化道钡餐检查鉴
别诊断疾病的能力。
胃癌可以发生在胃的任何部位，胃窦发病率最高，其次胃小弯，再其次贲门；
胃大弯和前壁发生率较低。胃癌的大体形态，随病期不同可分为早期胃癌、进展期
胃癌。早期胃癌是指局限于粘膜层和粘膜下层肿瘤，不论其范围大小及有无淋巴结
转移；可分为3型：I型隆起型，II型浅表型，ⅡI型混合型n引。在早期胃癌上消化道
造影钡餐征象中，I型病变向胃腔内突出，可以形成充盈缺损；II型病变征象显示浅
三角形或不规则溃疡形；III型无明显的隆起或凹陷，仅破坏胃小湾区，病变黏液有
边缘不整、大小不一的颗粒状阴影或局部异常积钡，有时在俯卧位和直立充盈相时
可看到边缘毛刺征，诊断较前两型困难。各型早期胃癌有时还可呈现局部胃壁僵硬，
僵硬区与正常胃壁的分界明显，似刀切样。进展期胃癌又可分为中、晚期胃癌，胃
癌深度超过下黏膜层，己侵入肌层者称中期，己侵及浆膜层或浆膜层外组织者称晚
期n劓。胃癌有很多的病理形态分型方法，Borrmann分类法应用最为普遍，可分为4
型：①巨块型；②限局溃疡型；⑨浸润溃疡型；④浸润型。一般进展期胃癌上消化
道钡餐造影表现有：①充盈缺损，多见于蕈伞型；②胃腔狭窄，胃壁僵硬，主要由
浸润型胃癌引起；③龛影，见于溃疡型胃癌；④黏膜皱襞破坏、消失、中断；⑤癌
瘤区蠕动消失u引。
，
虽然能发现大多数病变，但胃癌漏诊率较高，尤其早期胃癌漏诊率更高，其原
因主要是早期恶性病变的恶性征象不明显、常规钡上消化道钡餐检查对胃粘膜的微
细结构显示不足。另外上消化道钡餐检查仅能显示胃粘膜表面的病变，不能很好显
示肿瘤侵犯及腹腔脏器转移的情况。胃癌的X线诊断必须结合临床，必要时行胃镜及
病理组织活检检查。对于一些疑难病例，仍需结合X线、胃镜、活检等各种方法的综
合诊断n酬。
2．3
c1．检查：在胃的CT检查中，检查前的准备工作至关重要。一般要求禁食6—8
小时，于检查前5
min肌注20mg
654-2，使胃处于低张状态，消除胃肠蠕动造成的胃壁
假性增厚及伪影。关于对比剂，目前国内外学者n7。183均主张使用方便、无味、价廉、
安全的水做为阴性对比剂使用。用量应视病人状况而定，一般要求800ml左右。胃壁
在饮水充盈并呈低张状态后，平均厚度为2．7±1．7mm，胃体部较薄，厚度一般为
0．7-2．Omm，超过2．5mm者可视为异常。胃食管交界区和胃窦部胃壁较厚，分别在
1．5-3．Omm、2．5-5．Omm，超过5．0
mm多属异常。CT在胃癌中的主要表现包括：①胃壁
增厚；②软组织肿块；④周围结构侵犯；④腹腔腹膜后淋巴结肿大；⑤远处转移n9】。
目前传统CT检查对早期胃癌的诊断比较困难，多层螺旋CT扫描速度快，层更薄，
分辨率有了明显提高，可多期扫描，清楚显示肿瘤生长、侵犯胃壁周围脏器、淋巴
结及远处转移情况，更重要的是明显提高了胃癌分期的准确性及微小肿瘤的检测率
‘舢¨。Moss和Cook提出阻蝴1临床上常用的CT分期参照标准。To期：胃壁没有改变，
胃周脂肪层正常；T。期：单层型表现为局部胃壁增厚而没有胃壁明显强化，或只有
胃壁明显强化而没有胃壁增厚；多层型表现为胃壁增厚和明显强化，但没有中外层
的突然消失；T：期：单层型表现为胃壁强化并局部胃壁增厚，三层型表现为胃壁强
化并胃壁中层的突然消失，两层型则为胃壁外层突然消失；增厚胃壁的边缘尚光滑，
或胃周脂肪层内出现少量软组织条带：T。期：增厚的胃壁边缘呈网状或不规则形，
或者病变处的胃周脂肪组织模糊；T。或T4：胃癌组织和邻近脏器问的脂肪层消失；T。：
邻近脏器的浸润。胃癌T分期是影响切除率的主要因素，胃癌CT的最大价值是术前判
定能否手术切除肿瘤，减少不必要开腹手术的发生。
CT在胃癌分期诊断中尚存在一定的局限性，对早期胃癌的检出率低，_一般仅为
40％，尤其是小的溃疡型早癌Ⅲ1。CT分期还存在过高和过低现象。分期过低主要是
由于正常大小的淋巴结已发生转移或胰腺、肝内、腹膜的小转移灶不能检出。分期
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过高主要是癌肿尚未穿透胃壁全层，但其周围脂肪层消失；溃疡型胃癌时溃疡底部
凹凸不平，且有腐烂组织及出血凝块附于溃疡壁，致堤壁角测量有误‘一1。此外，
有时候胃部CT将反应性增生及炎性淋巴结误认为转移灶。C，r在胃癌诊断中也有漏检
的问题，主要原因有扫描层较厚而病灶较小或多病灶时仅发现1个病灶而忽视另1个
病灶。此外潴留液及患者的呼吸运动也可影响CT诊断的准确性。
3内镜检查
目前内镜检查是发现早期胃癌最有效的方法。临床上常用的内镜主要有电子纤
维胃镜和超声内镜。电子纤维胃镜可贴近胃黏膜表面观察，发现黏膜细微改变。根
据日本科学家的观察研究，提高早期胃癌诊断率的重要环节是发现早期胃癌的特征
和细微变化，宜将早期胃癌分为3型：I型隆起型，II型浅表型，Ⅲ型凹陷型。内镜
下的主要表现为粘膜粗糙感、处之易出血、斑片状充血及粘膜糜烂。隆起型早期胃
癌表面不平，可发红或稍带苍白，表现可有出血、糜烂及白苔附着。浅表型早期胃
癌黏膜褪色，失去原有光泽。凹陷型早期胃癌，应注意凹陷周围黏膜皱襞的变化，
例如呈阶梯状凹陷、皱襞末端变色或虫咬状中断。内镜下鉴别良恶性溃疡至关重要，
首先是肉眼下形态的辨识，下列指征对良恶性溃疡有重要鉴别意义：(1)黏膜皱襞
良性溃疡达口，恶性中断；
(2)溃疡边缘污斑是恶性溃疡征象；
(3)阶梯状凹陷
是恶性的特征嘲。胃镜的肉眼观察结合其他辅助检查，胃癌的诊断正确率可达
97．4％幽】。内镜诊断靠肉眼观察病变，因此凡是能影响肉眼观察的因素就可以导致漏
诊，如表面污物覆盖，医师经验水平等，再者由于个体差异以及病变本身的动态变化
等因素的影响，对病变早期的判断也有一定难度。电子纤维胃镜检查的盲点是对胃
壁外侵犯、淋巴结转移、远隔脏器转移无法判定。
超声内镜是将超声波和内镜结合起来的一种检查方法，具备内镜和超声的双重
功能。将超声探头导入胃腔贴近病灶进行扫描，既可直视胃黏膜病变，又可清晰观
察病灶的浸润深度以及探查胃周围淋巴结和附近脏器转移情况，为早期胃癌的确诊
和治疗前TNM分期而选择合理的治疗方式提供依据。超声内镜下，正常胃黏膜分为黏
膜层、粘膜肌层、黏膜下层、固有肌层、浆膜层5层，分别显示为高回声、低回声、
高回声、低回声、高回声5层清晰结构，黏膜肌层的显像对早期胃癌浸润深度的判断
尤为重要。层次结构的改变是超声内镜下T分期的依据。在检查隆起型黏膜早期胃癌
时，除隆起性病变外，可发现第1层和第2层结构紊乱，第3层仍保持完整和连续性
的表现。．检查黏膜下早期胃癌时，可见肿瘤浸润引起的第3层不规则和狭窄，但无
中断现象。鉴别早期胃癌和进展期胃癌的准确率可达90％，判断癌肿对各层累及的正
确率可达70％-80％啪1。近10年来超声内镜引导下细针穿刺及活检可获组织进行病理学
检查，对胃癌病理活检准确率达94％口¨，对胃癌侵犯深度判断准确率为81％，淋巴结
综述
转移准确率为73％。但超声内镜检查越有11％的病例因肿瘤周围炎症而发生分级偏高，
又因未发现癌的微小侵润或侵润较深而分级偏低者越占4％。淋巴结转移检出率也有
一定得局限性瞄羽。
．
有研究认为：恶性溃疡可以反复形成、愈合，具有愈合一溃疡一再愈合一再溃疡的
特点，若内镜检查时正遇上溃疡愈合期，则观察到的仅是基本正常的胃黏膜或趋于
良性溃疡的形态。内镜表现也容易与其他疾病混淆，胃癌发生出血、梗阻、穿孔等
并发症，常被草率地误认为消化性溃疡。
临床循证医学研究证明，内镜检查联合多种辅助检查，早期胃癌的检出率仍低
于20％，检出的大多数患者为进展期胃癌或己发生远处转移的晚期胃癌。内镜检查费
用高、耗时长，不适合我国大面积的普查筛选，同时检查时也给病人带来诸多不适，
急切需要发展一种新技术，便于早期胃癌的诊断。目前，分子生物学技术的发展及
蛋白质组学的研究为早期胃癌诊断闪出了一道亮光，是最有希望早期检测肿瘤方法．，
为肿瘤的研究提供了新的思维模式。
4血清学肿瘤标志物检测
．
胃癌被认为是一种多基因，多步骤的复杂性疾病，其发生发展是多个基因突变
的过程。针对这一疾病，除了寻找新的治疗手段，更重要的是提高早期胃癌的诊断
水平。目前胃癌的诊断主要依靠X线、CT、内镜及病理学检查，这些检查手段具有侵
入性，给患者身心带来一定得损伤。为寻求简便、快捷、无损伤、无痛苦的检查方
法，人们开始在胃癌患者外周血检测中寻找与胃癌相关的肿瘤标志物，以期能够进
行早期胃癌诊断。最近大量研究表明，单个肿瘤标志物尚不足用于早期肿瘤的诊断，
有不少学者利用多个肿瘤标志物组成一个蛋白质组诊断模型进行全身多个系统肿瘤
的诊断，比如已经在肝癌‘3洲1、卵巢癌陋驯、乳腺癌‘4‘H41、肺癌H渊1、前列腺癌‘撕刳、
膀胱癌隋渊3、胰腺癌嘀钉、食管癌汹1、大肠癌㈣等疾病的比较蛋白质组学研究中发现
了多种疾病相关的蛋白标志物。
近年来，学者将重点集中于血清学检测，即肿瘤相关分子标志物的检测。肿瘤
标志物是指由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身，或分泌至血液或其他体液，或
因肿瘤组织刺激，由宿主细胞产生而含量明显高于正常参考值的一类物质，大多数
为蛋白质类物质。从理论上说，任何疾病在出现病理改变之前，其细胞、组织和体
液中的蛋白质成分及数量都会有相应改变。人血清是一个相当丰富并不断变化的蛋
白质系统，单一分子标记物难以追溯到相关的细胞、组织，而发现一组与特定细胞、
组织癌变相关的血清蛋白质并对其进行研究有可能直接获取疾病相关的特征性分子
标志物。以蛋白质组成成分为研究对象的蛋白质组学的方法为肿瘤的研究提供了新
青岛大学硕士学位论文
的思维模式。
研究表明，血清、尿液等体液中含有大量疾病标志物，而且血液中可能含有大
量未发现的可用作疾病标志物的多肽呻3。目前肿瘤标志物常用的检测技术有免疫学
检测技术、分子生物学检测技术及蛋白指纹图谱技术。免疫学检测技术和分子生物
学检测技术比较成熟，已经研究出多种胃癌相关的肿瘤标志物，如CEA、CA724、
CAl9—9、CA50、AFP、CA242、B2一MG、胃癌抗原、组织多肽抗等已经广泛用于临床
‘躺¨。单一肿瘤标志物特异性、敏感度均低，不能满足胃癌的早期诊断、鉴别诊断、
疗效及预后评估在临床应用的要求，而联合检测多种肿瘤相关标志物能明显提高早
期胃癌的检出率。
．、
蛋白指纹图谱技术最早是由许洋博士于本世纪初在中国提出，并于2004年8月
在《亚太地区国际肿瘤生物学和医学暨第21届国际肿瘤标志物学术会议》和2005
年4月《美国第96届肿瘤年会》上正式报道蛋白指纹图谱技术在中国的应用。该技
提出后在中国医学界迅速引起巨大的反响。据美国权威杂志《癌症研究》报道，10—15
年时间一个癌细胞可以长成癌，蛋白指纹图谱技术可以检测出前列腺癌形成3—5年
前的蛋白图谱。因此早期发现、早期诊断肿瘤在理论上完全可能的，这为癌症病人
的早期诊断、有效治疗乃至彻底治疗闪出了一道亮光。
蛋白指纹图谱技术的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解析后
形成荷电离子，不同质荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱
图案。将所检测人的蛋白质图谱与正常人标准图谱相对照，分析有无差异，就知道
这个人的图谱是是否患有某种疾病，或是存有某一种或一组尚未探明的新的特异性
分子标志物。几十分钟或几分钟就可以完成整个质谱的测定过程，十分迅速，方法
敏感、特异性高，同时一般不会破坏所测定的蛋白质化学结构。该技术通过对蛋白
质动态、全程的分析观察，对疾病早期微小变化进行探索，将病人全套血清蛋白质
变化记录下来；绘制成蛋白指纹图谱就可以显示所测样品中各种蛋白质不同信息，
并将这张图谱标准图谱进行对照，就能发现捕获到与疾病相关的、新的、敏感性特
异性高的血清蛋白质及特征。
近几年，新兴的表面增强激光解吸电离一飞行时间质谱(surface
enhanced
1aserdesorption／ionization—time
of
flight—mass
spectrometry
technology，
SELDI—TOF—MS)技术为差异蛋白质组学研究提供了一个十分理想的平台，同时也为全
身多个系统肿瘤标志物的研究提供了一个理想的平台。SELDI—TOF—MS技术是由日本
著名科学家田中耕一发明，美国Ciphergen
Biosyetems公司进行进一步研究并使之
商品化。该系统由3部分组成：①蛋白质芯片；②芯片阅读器⑧生物信息学。该技术
的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解析后形成荷电离子，不同质
综述
荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱图案，可以显示不同蛋
白的相对分子量等信息。SELDI技术能快速分析、处理大量质谱图信息，将测得质谱
图与正常人或某种疾病或者疾病不同阶段的标准图谱进行对比，就能捕获该疾病不
同阶段特异性的相关分子蛋白质。
表面加强解吸电离一飞行时间质谱(SELDI—TOF—MS)技术不同与传统的蛋白质组
学技术，有以下一些优点：(1)1次可以实现上万种蛋白质检测分析，快速、简便、
易行、高通量、平行分析，；
(2)需样品量极少，只需25,---'50个细胞所提取的蛋白
质即可；
(3)较高的信噪比；
(4)可以对小分子量的蛋白质进行鉴定：
(5)可以
和基因芯片结果进行比较分析，在蛋白质组和基因组之间建立联系；(6)应用多个
未明确性质的蛋白质或肽信号可联合组成诊断模型，对全身各系统肿瘤的早期诊断
比单一的肿瘤标志物更准确可靠，敏感性特异度更高等。SELDI—TOE-MS技术克服了
诸多传统蛋白质组学研究中无法解决的问题，实现了蛋白质芯片技术临床检测应用
的飞跃。高通量的质谱技术为寻找新的标志物用于早期肿瘤的诊断和监测治疗效果，
已经成为一个临床医学研究的新方向。
Su等∞刃运用SELDl-TOF-MS技术对127例胃癌患者和100例健康对照组、9例良性胃
疾病对照组、9例结肠癌对照组的血清样本进行检测，捕获3个有显著差别意义的蛋
白波峰，质荷比分别是1468、3935和7560
m／z，3个蛋白波峰可组合成诊断胃癌蛋白
租模型，对胃癌和非胃癌患者血清样本盲法分析预测，胃癌诊断的敏感性为85．3％
特异性88．O％，准确性为86．4％。Qian等阳1用SELDI-TOF—MS技术分析了30例胃癌和
30例非胃癌血清样本，发现16个波峰有明显统计学差异，其中9个蛋白峰在胃癌患者
中高表达，质荷比为7567和5252
m／z的蛋白峰可以建立胃癌诊断的质谱模型，然后
用来检测其余70例血清样本，敏感性90％，特异性86．7％，准确性88．6％。Liang
等删用SELDI-TOF-MS技术检测胃癌患者、胃炎患者和健康志愿者血清蛋白谱，发现
质荷比为5910、5084和8691
m／z的蛋白峰有明显差异，用这3个标记物建立胃癌诊断
的蛋白质谱模型，进行双盲检测胃癌与健康人血清样本，阳性预测值93．3％，阴性
预测值100％；检测胃癌与胃炎血清样本，阳性预测值93．9％，阴性预测值90．9％。
以上实验结果均优于目前临床上经常使用的胃癌相关的血清标记物，如CEA、CAl99、
CAl
25和CA724等。
表面加强解吸电离．飞行时间质谱(SELDI．TOF．MS)技术在早期胃癌诊断的差异蛋白质组
学研究中，虽然优于传统的蛋白质分析技术，但在临床实际运用中仍面临严峻挑战，其不足如
下：不能对所检测的蛋白质直接进行鉴定，对蛋白质性质、空间结构、功能等研究仍需要依赖
传统的蛋白鉴定技术，如激光解析离子化质谱仪、生物信息学、二维电泳、基质辅助等。质谱
信息的分析处理及分子生物信息学的广泛应用还有待进一步研究，芯片制各质量均一性、质控
方面及实验重复性评价等问题的研究还有待完善。随着芯片技术、质谱分析技术及蛋白质分离
青岛大学硕士学位论文
纯化技术的发展，以及在研究方法上新的突破和分子生物信息学工具的不断完善，在更高水平
上寻找新的肿瘤相关功能蛋白组和标记物成为可能，从而在肿瘤发生机制、诊断、分期和治疗
效果检测中取得重大突破，同时也为探寻新的诊断方法和治疗靶标提供有力依据，也为胃癌的
研究、早期诊断和早期治疗带来新的曙光。通过差异蛋白质组学的研究，寻找和确立一组早期
肿瘤相关的蛋白质特异性分子标志物．这些分子标志物将有可能成为发现早期肿瘤的“利器”。
5面临的问题与展望
采用回顾性及前瞻性队列研究，立足于整体角度，对目前报道的肿瘤标志物在
主要人肿瘤中以单一或新的组合形式进行大规模验证，筛选，进一步采用血清蛋白质
组的方法试图寻找新的肿瘤标记。建立以血清蛋白标记为主的人恶性肿瘤早期诊断，
分子分期指标体系与相关标准，国内外未见类似大规模的研究报道。使用
SELDL-TOF-MS研究人恶性肿瘤血清特异蛋白标记，系统筛选相关标记物及其组合，
将可以提高诊断的准确性。有可能发现更加精确和可重复的诊断方法，从而筛选出
用于人恶性肿瘤早期诊断的方案。对这些分子的纯化、鉴定等深入分析可以更深入
地了解肿瘤发病机理，同时为药物、生物治疗肿瘤提供重要的耙点选择和理论支持。
近年来，各国著名科学家包括不少诺贝尔获奖者，对肿瘤在分子生物学方面的
行为、特征进行了大量的研究探索，取得了多项非常有价值的研究成果，但这些研究
成果在降低肿瘤发生、降低肿瘤引起死亡等方面效果不显著。美国肿瘤学界曾经公
布一项权威性的比较研究，显示自上世纪70年代以来，虽然不断有新的早期肿瘤诊
断和检测治疗效果的方法问世，但是全世界早期肿瘤诊断率及肿瘤致死率并没有显
著改善。通过蛋白质组学研究来寻找和确立一批肿瘤蛋白的特异性分子标志物，这些
分子标志物将有可能成为早期发现肿瘤的“利器"。
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攻读学位期间的研究成果
1．李春伟，孙风波，张佃良，郑红梅，宋波．血清IL-IO水平与胃窦癌恶病质的关系·肠外与
肠内营养2010年3月第17卷第2期·
2．LI
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Cholangiocarcinoma．
3．Chunwei
Li,Dianliang
Zhang，Jian
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cancer
using
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serum
biomarkers
screening
for
diagnosis
of
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nT_TOF州S．(待发表)
37
致谢
致谢
值此论文完成之际，谨向三年来辛勤培育我的导师张佃良教授致以
最衷心的感谢!导师渊博的医学学识、高尚的为人风范、精深的专业造
诣、严谨的治学态度给我留下了深刻的印象并使我受益终生!
衷心感谢普外科的全体医护老师在临床工作和学习生活中给予我
的帮助和指导!
衷心感谢青岛大学医学院附属医院中心实验室的各位老师在本实
验中给予的帮助和支持!
最后，衷心感谢为我的成长付出辛勤劳动和无私关心的家人、朋友!
浙公网安备 33021202002483