现代薄层色谱（平面色谱）技术

现代薄层色谱(平面色谱)技术 Dr. Eike Reich and Anne Blatter, CAMAG – Laboratory, Sonnenmattstrasse 11, CH-4132 Muttenz, Switzerland, eike.reich@camag.com 1． 介绍 薄层色谱（TLC）是最古老的色谱技术之一，至今仍是现代实验室不可或缺的分析手段， 其中的一个重要原因是 TLC 能够提供图像，可以直观地看到色谱分离结果；另外，超强的 适用性、分析时间短、分析每一样品花费低也是其优点。图一显示的是同一块薄层板上两种 紫锥花属植物（紫锥菊,蒲草）及其不同比例混合物的指纹图谱。全部分析所需时间包括点 样、展开、显色和照相约只需约 20分钟。两个不同种类的样品可以通过标示物质清晰地予 以区分，混合物的组成可通过与标示物斑点对比颜色深浅半定量估算，或采用光密度扫描定 量分析获得更准确的结果。 图一 硅胶 HPTLC（高效薄层色谱）分离金光菊根（紫锥花属）提取物 由于 GC-MS，HPLC-DAD-MS的分离效果好、结果可靠、准确性高，已成为当今首选 的色谱技术。然而，人们也许会问，是否需要所有的分析都投入非常大的财力物力，而仅仅 得到一个简单的结果，例如那些伪品和杂质的鉴别和测定只需一张图像就可解决。这种情况 下薄层色谱展开后衍生得到的的彩色条带就很有用，可作为扩展信息。TLC 不但是一种应 用广泛的分析手段，并且可以以很小的投入得到很好的结果，同时可作为其它技术的补充。 2． 基本概念 a． 方法学 TLC 是一项离线色谱技术，所有步骤独立（包括点样、展开、衍生、照相、检测和计 算等），按照时间和位置分割。这就提供了非常广的适用性。同时，许多的独立参数对分析 1 结果会产生影响。由于薄层板是一次性使用的，这就确保了所有的样品和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品在完全一致 的条件下分离。同样的原因，在薄层色谱中样品基质对固定相的污染不是问题，不象柱色谱 那样，而且展开后的色谱保存在薄层板上，可用不同参数进行多次计算，不必重复分离。 另一方面，TLC 是一个开放系统，结果受到许多因素影响，例如实验室中的光线、氧 气、烟雾、湿度和尘埃等，因而实际操作中要将尽可能多的参数——尤其是展开室的立体结 构和饱和、点样体积和溶剂及薄层的类型和活性——标准化并保持固定。 b． 固定相，TLC对 HPTLC 高效薄层色谱（HPTLC）采用涂层颗粒直径为 5μm左右，并且直径分布窄的高效预制 板，和传统的 15μm颗粒的普通 TLC板相比，分离度高（ 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 一）。 平均颗粒度 颗粒度分布 涂层厚度 分离距离 分离时间 试剂消耗 检测限，吸收 荧光 TLC 10-15μm 宽 250μm 100-150mm 30-200min 50mL 100-1000ng 1-100ng HPTLC 5-7μm 窄 100,200μm 30-50mm 3-20min 5-10mL 10-100ng 0.1-10ng 表一 采用 HPTLC板能提高分辨率，进行光密度扫描时能降低背景噪音，检测限较普通 TLC 低一个数量级，展开时间和试剂消耗也显著降低，因而 HPTLC薄层板已逐渐取代普通 TLC 板成为主要应用的固定相。 图二是用 TLC和 HPTLC板分离熏衣草油的比较。HPTLC采用一次展开，耗时 8min， 与 TLC两次展开，展距 15cm，耗时 35min的效果相当。 a b c 图二 2 硅胶分离熏衣草油（Lavendula officinalis） a) TLC 第一次展开 b)TLC 第二次展开 c)HPTLC 单次展开 薄层色谱的一个特点是固定相选择面宽，包括极性的如 CN，DIOL和 NH2，反相如 RP2， RP8和 RP18。但对大多数分析来说，还是使用硅胶。原因之一是它对被分析物官能团的差异 选择性强，尤其对于定性分析，例如指纹图谱，通常需要尽可能多的分离/分析不同种类化 合物，吸收色谱非常适合这类工作。硅胶的另一优点是制造过程相对简便，能以较低价格保 持批与批之间质量的稳定。然而，不同厂商生产的薄层板对某些特定分析有明显差异（图三）。 例如采用显色反应测定时，粘合剂对分离会产生影响。在许多国家，自己铺板时采用羧甲基 纤维素做粘合剂，如果操作仔细，这些板也能提供较好的重现性，但是同采用聚甲基丙烯酸 酯为粘合剂的预制板相比还是有相当大的差距。 图三 不同厂商硅胶 60 HPTLC 板分离多种升麻属样品 对于定量分析还有其它两点特性非常重要：信噪比及长时间内交叉及板与板间的重现 性，只有一些著名厂家生产的板才能达到要求。有时需在分析方法中固定使用某一厂家的薄 层板。其他板材的适用性能通过校验显示。需要注意，一些药典方法中提到的硅胶 G 薄层 板（石膏做粘合剂）几乎没有预制板。 c． 点样 点样过程需满足两个基本要求：第一，点样位置需精确；第二，尤其对于定量分析，点 样体积需要精确和准确。为了提高分离效率，原点在展开方向应该尽可能小，对于 HPTLC， 应小于 1.5mm，这就使得采用点状点样时体积受到严格限制。在 HPTLC板上点状点样体积 通常为 0.1-1μL。 点状点样时样品溶剂在薄层板上扩散会分离样品从而在原点产生环状的所谓“环形色 谱”，这会使样品组份在点样点上分布不规则，导致展开后斑点扩散不对称。为了确保原点 位置紧凑，选用的样品溶剂溶解性应尽可能小。 通过比较可以看到，采用非接触喷雾式条带状点样，在同样的色谱条件下，可提高解析 度和检测限。条带状点样可确保样品在整个长条上分布均匀。对于低浓度样品，它也可以通 过增大点样体积提高分辨率而不必担心条带的质量变差（图四）。 3 图四 熊果提取物甲醇溶液样品在 HPTLC 板上分别用点状（接触式）和条带状（喷雾式）点样后 分离。视频光密度分析显示条带状点样有更好的分离度（红色箭头）。 d． 展开 I．气相 薄层色谱有别于其他色谱技术，除了都有固定相和流动相外，还存在气相。气相会对分 离结果产生显著影响。 在密闭的展开室中存在四个竞争过程（图五）。 1． 展开剂组分及其蒸气最终建立相平衡。由于每一种组分的饱和蒸气压不同，气相的组成 与展开剂组成有明显不同。 2． 已经被流动相润湿的那部分薄层也同气相产生相互作用。这一过程中极性小的更容易进 入气相。和 1不同，这一过程主要受吸附力影响而非蒸气压。 3． 未被溶剂润湿的干燥固定相会吸附气相中的分子。这一过程也达到一个平衡叫做吸收饱 和。极性成分更易于被从气相中吸附到固定相表面。 4． 展开过程中流动相的组分被固定相分离产生第二前沿。 4 图五 展开室中的过程，详情见文章描述 1和 3可如下控制： · 用浸有展开剂的滤纸置于展开室中，等一段时间后再展开——展开室饱和 · 将板放在展开室中，不同展开剂接触，同气相进行相互作用——预平衡 2和 3产生的干扰可通过在涂层上方一到几毫米处盖一块盖板得到有效控制，这叫做“三 明治”式展开。 1和 3的平衡建立后，流动相的组份间吸附特性差异越小，由 4产生的第二前沿越不明显。 第二前沿在饱和很好的展开室及预平衡后的薄层板板上很少见到，但在“三明治”展开室， 尤其是在 OPLC（Over Pressure Laminar Chromatography，超压平面色谱）中非常显著。 II. 展开室类型和饱和 大多数情形下薄层色谱是在固定相、流动相和气相不平衡的状态下进行的，这就是为什 么很难用数学方法表述正在展开的展开室条件，只有在尽可能固定所有参数时才能得到重复 性好的结果。这中间展开室形状和饱和起了关键作用！很不幸，这表明每一展开室的色谱结 果不同，既没有“好”，也没有“坏”的展开室（图六）！然而，某些展开室能更好的控制参 数。在开发方法时要选择合适的展开室，通常通过实践来选择，例如哪一种最容易得到，哪 一种最常使用，哪一种最方便实验室结果对比等。当然，经济也是和重现性同样重要的因素。 5 a b c d e 图六 用硅胶 HPTLC 分离两种不同的五味子，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-乙酸（70：33：3），茴香 醛显色；a)水平展开(HDC)并饱和，b)HDC 不饱和，c)HDC“三明治”式，d)双槽展开缸(TTC) 并饱和，e)TTC 不饱和 III．展开距离 由于 TLC 中流动相的速度不是固定的，而是随展开时间和展开距离增加而降低，所以 展开距离有一定限制。通常在 HPTLC板上 5cm展距分辨率较高（图七）。可以在展开前用 铅笔对溶剂前沿位置做一小标记，但不要在整个板上画或刮出一条线。 a b c d 图七 展距对结果的影响：硅胶 HPTLC 分离春黄菊油。a)3 cm，b)5 cm，c)7 cm，d)9 cm IV．多级展开（梯度展开） 全自动多级展开(AMD)是瑞士 CAMAG公司在 Burger的研究基础上研制而成的分步梯 度展开系统，它可在 HPTLC 板有限的展距内达到最大的分离效果（8cm 展距可分离出 40 多种组分），其分离能力可同 HPLC比拟，同时又保留了薄层色谱的优点。 不同于柱色谱技术的梯度分离，AMD的梯度由溶解能力最强的溶液开始，并随每一步 展开，溶液的溶解能力依次降低，展开距离较上一次提高。一般对于 20至 25步的展开，每 一步展开，距离增加不超过 3mm。两步展开之间展开室内的溶剂被排光，并用真空将薄层 板抽干，并可在展开前进行气相预平衡。通过 AMD可将展开斑点聚集在很窄的条带内（聚 焦效应），典型的峰宽为 1mm，这也使得以前 TLC无法分离的多组分混合样能够得以分离。 6 AMD是一项重现性非常好的技术，典型的应用领域包括分析杀虫剂、脂类及生物活性 物质监控等（图八）。 图八 AMD 分离杀虫剂（德国标准方法 DIN 38407 Part 11） e．衍生、照相和计算 可对一些特殊或非特殊的化学物质非常方便的进行色谱前或色谱后衍生是薄层色谱的 一大优势,有许多衍生试剂可供选择。对于液体衍生试剂可采用喷雾或浸板方式。喷雾具有 快速、方便及试剂消耗少等优点，但同时也会产生烟雾，需要小心排除（可采用喷雾抽气箱）。 采用浸板设备浸渍显色均匀，但试剂消耗大（最多 200mL）。 为了最充分利用薄层色谱的视觉效果，可对薄层板进行照相。现在视频照相和数码照相 广泛应用于此。采用合适的光源，对同一块薄层板在 UV 254nm，UV 366nm及可见光下（衍 生前和/或后）对此检测可提供更多有用信息，尤其是指纹图谱分析。 为了方便目测，TLC板上常常含有所谓的 UV-指示剂（F254），在 UV 254nm激发下产 生绿色或蓝色荧光。对 UV 254nm有吸收的物质存在于斑点上时发射的荧光会减弱。HPTLC 通常采用光密度法（扫描）定量计算，板上分离后的斑点用一束长宽可选的光条扫描，仪器 内的光敏感应器检测反射光。样品区域（片段）和无样品区域的光信号差异和同一块板上已 知量的标准品斑点比较。光密度测定可采用吸收法或荧光法，光谱带宽为 190-800nm。吸收 法测定通常给出的数据更符合非线性方程，只有在非常小的浓度范围内可采用线性方程计算 （图九），而荧光法能较好地符合线性方程。 7 图九 hyperforin 校准曲线，上：50-250ng，下：45-140ng 区别于经典光密度分析，对于 HPTLC板的电子图像可采用视频光密度分析计算。该方 法的优点是快速、简单和操作直观，计算是在一个“可见”的色谱上进行的，而不同于扫描 光密度分析，整个过程在“暗箱”中进行（图十）。 8 图十 HPTLC 分析北美黄连（Hydrastis canadensis）和掺杂物（UV366nm 下显示荧光的化合物， 为了更好的观测将颜色翻转） 3． 应用 a． 草药的质量控制 I．确认 药用植物的确定是薄层色谱最早的应用领域，通过比较同一块薄层板上的样品和对照物 的差异进行判定。测试中样品必须达到预先设定的标准，如数量、顺序、位置和分离的条带 的颜色。对于草药，最简便的方法是并排比较一个药品（参照物）和另一个药品（样品）的 HPTLC 指纹图谱。这一过程唯一需要规定的是所确立的需要检测样品的检测灵敏度，即样 品可以通过测试，而其它样品如掺杂物无法通过。 HPTLC 指纹图谱的最大价值主要在于色谱的视觉印象，如果用多次检测可以进一步扩 展，可以检测及描述各组分的光谱而无须知道每一斑点色谱的化学特性。另一优点是薄层色 谱总是能够看到所有的样品，并且几个样品可以很容易的并排比较。对于原料、药物萃取物 及成品都可进行鉴别。该方法也适用于复杂样品如复方药物（图十一）。 9 图十一 紫锥花属根及常见伪品 HPTLC 色谱图 从左到右：Echinacea purpurea, Echinacea pallida, Echinacea angustifolia, Echinacea atrorubens, 2E,4E,8Z,10E/Z-十二烷基四烯酸异丁基酰胺，β-谷甾醇，鹿舌草 punctata，银胶菊 integrifolium （2 种不同样品） II．稳定性测试 药用物质及成品的稳定性测试是 HPTLC一个相当新的应用。在这一测试中需 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 药物 在规定的储藏条件下经过一段时间不发生变化。另一方面，任何发生的变化需要能够被检测 到。建立规定方法时通常对样品采用强制降解，如光照、高温、潮湿和水解等。采用 HPTLC 指纹图谱进行稳定性测试需要方法稳定、重现性好。严格的标准化、图像文档及现代化仪器 设备可以保证达到要求（图十二）。 图十二 Vitex agnus-castus 强制降解后萃取物的 HPTLC 色谱图 从左到右：对照品，光照、HCl、NH3、 TFA、 DEA、 H2O2、加热（溶解萃取）、加热（干 萃取）、氧化 10 III．标示物定量 TLC 在草药分析中大多数的应用是对标示物进行定量分析。由于分离能力的限制，对 于草药这样复杂的样品通常无法完全分离所有成分，所以大多数测定采用 HPLC。然而人们 常常忽视，实际上，只要有合适的仪器及方法，HPTLC达到定量分析的要求并不困难。HPTLC 具有样品处理简单，对特定的组分可采用特殊的优化方法分离，可采用特殊的色谱前或色谱 后衍生等优点。但是，如果不作调整，大多数用于鉴别的指纹图谱方法是不能用于定量分析 的（图十三）。 a b c 图十三 11 光密度扫描定量熊果中的对苯二酚。 a)对苯二酚随溶剂前沿迁移 b)薄层板预平衡 10 分钟后，对苯二酚处在溶剂前沿后 c)对苯二酚校准曲线 b． 食品和饮料分析 TLC在食品和饮料方面的应用已有很长的历史，最近的一些应用如下： I． 分析葡萄酒中的有机酸分析 TLC非常适合于监控葡萄酒生产中苹果和酸乳酸的发酵。样品无须提纯，分析时间短， 可同时处理大量样品，尤其适合大的酿酒厂（图十四）。溴酚蓝显色，采用光密度扫描，波 长 430nm，吸收模式定量计算，每种酸的检测限为绝对量 3μg。 0.0 4054.5 0.0 2.0 10.0 [ug ] malic acidAre a pe rm.de v .: 0 % sdv : 3.5 r = 0.9980 a0 = -355.08 a1 = 447.55 Line ar R e gre ssion C AM AG S O FT WAR E (c) 2000 Ve rsion 图十四 上：葡萄酒中有机酸的 HPTLC 色谱图，1-4 标准品（随 Rf 值增加依次为：苹果酸、乳酸、 12 琥珀酸），5-7 澳大利亚红葡萄酒，8-10 加入标准品的葡萄酒样品 下：苹果酸的校准曲线（2-10μg 绝对量） II． 糖浆中的低聚糖测定 该方法开发并提供给制糖工业，作为监控蜂蜜中的低聚糖含量的有效工具，是一个低成 本同时分析大量样品的方法。将 1g糖浆溶于 400mL蒸馏水，样品无须提纯，采用 AMD九 步色谱分离（图十五）。 图十五 AMD 2 分离监控糖浆，4-氨基苯酸色谱衍生 III． 食品中黄曲霉毒素分析 黄曲霉毒素是由霉菌黄曲霉和寄生菌代谢产生的，具有致癌性并能损害人体免疫系统。 最重要的天然黄曲霉毒素是B1, B2, G1 和 G2 。下列方法通过协同研究证明是有效的。黄曲 霉毒素通过液相萃取从基质中分离，注入含B1, B2, G1 和 G2 相应抗体的免疫性柱体，黄曲 霉毒素从柱子中冲洗出来后点样于HPTLC板上，用叔丁基甲醚-甲醇-水（480：15：5）展开， 光密度扫描定量分析（图十六）。 13 图十六 HPTLC 分离定量分析黄曲霉毒素 14 c． 生物活性物质测定 生物测试应用是 HPTLC最新发展的领域之一。个别化合物色谱分离后，用生物/生化毒 性测试检测活性物质，包括在一测试体系中破坏成适合测试的有机体。在适当营养液中的孢 子、酵母细胞、细菌或细胞器（象叶绿体）等都可均匀地点在薄层板上。酶抑制测试也可在 薄层板上直接进行。生物信号如生长的抑制或促进，发光的抑制或促进及光合作用的抑制可 用于薄层板上毒性/活性物质的定位。结果可用摄像系统拍照保存并用确定的毒性单位定量。 I．ChromBiodip 人体及兽药中抗生素使用的增加导致了微生物的变异，这激发了对非法使用抗生素的检 测及新抗生素的研究。TLC结合MERCK开发的新型 ChromBiodip ™生物自记录测试包为抗 生素活性测试提供了简单高效的方法。 色谱分离样品后，测试的微生物枯草杆菌分布在整个板上。抗生素会抑制细菌生长，而 在没有抗生素的位置细菌不受影响。培养后活性微生物用MTT-四唑盐显色，死细菌区域在 蓝-紫色背景下显黄色（图十七），抗生素检测限约 100 ppt 关于艾滋病ppt课件精益管理ppt下载地图下载ppt可编辑假如ppt教学课件下载triz基础知识ppt 。 图十七 城市废水和表层水中抗生素活性监控。从左至右 1：未过滤的输出水，2：过滤的输出水，3： 过滤残渣，4：输入水，5：空白，6：清洁水，7：轻度污染的湖水 II． 生物发光（BioLumineX） 由于生物体系的发光选择性地对应于特定的生物活性化合物，对于色谱中特定的生物活 性测定，生物发光提供了优异的选择性。 分析问题有关的毒性物质可以利用海洋细菌 Vibrio fischeri 。Vibrio fischeri的生物发光 同细菌细胞内的生命过程紧密结合，所以在薄层板上毒性物质会显著减弱细菌发光，在含有 被分离物质的区域形成黑暗斑点。对于毒性物质的检测典型的检测限可达皮摩尔。混合物中 可以用于确定毒性成分的细菌生物发光最快反应时间为几秒钟（图十八）。视频或照相方法， 例如采用 X射线接触曝光，可用于检测发光减弱的物质斑点。 15 a b 图十八 不同量的春黄菊油测定 a）茴香醛 b）Vibrio fischeri。硝基苯酚（最后 3 条轨道）为毒性参比。 4． 结论 通过上面一些例子我们可以了解，TLC 是适合于许多应用领域定性定量分析的有力工 具。如需有关方法的具体细节请同作者联系。 16 分析葡萄酒中的有机酸分析 糖浆中的低聚糖测定 食品中黄曲霉毒素分析