PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成

第 26卷 第2期 2007年 3月 分析测试学报 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) V01．26 No．2 206—210 PM P柱前衍生高效液相色谱法分析 杜氏盐藻多糖的单糖组成 戴 军 ，朱 松 ，汤 坚 ，王 曼 ，尹鸿萍 ，陈尚卫 (1．江南大学 分析测试中心，江苏 无锡 214036；2．江南大学 食品科学与安全教育部重点实验室， 江苏 无锡 214036；3．中国药科大学 生命科学学院，江苏 南京 210009) 摘 要：建立了柱前 PMP衍生高效液相色谱法分离检测8种中性糖、2种糖醛酸及2种糖胺的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。筛选出 适合PMP衍生物分离的色谱柱为Eclipse XDB—C 。，以0．1 m L磷酸盐缓冲液一乙腈为流动相，考察了pH值 和乙腈体积分数对各种糖的PMP衍生物的保留及分离的影响，确定最佳 pH值为6．7，最佳乙腈体积分数为 17％；比较了不同衍生反应时间和萃取除杂前不同量盐酸中和反应产物时醛糖 一PMP衍生物的峰面积大小变 化，从而得到较佳的样品衍生化条件。应用优化的色谱条件和样品制备方法，测定了由杜氏盐藻提取纯化的 多糖级分 PIMa和 PIMb的单糖组成，其测定结果与高效阴离子交换色谱法的结果基本一致。 关键词：杜氏盐藻；多糖；单糖；高效液相色谱；柱前衍生化；1-苯基_3一甲基_5一吡唑啉酮 中图分类号：0657．72；0629．112 文献标识码：A 文章编号 ：1004—4957(2007)02—0206—05 Analysis of Monosaccharide Compositions in Polysaccharides fron D．Salina by Pre—column Derivatization Hi Performance Liquid Chromatography DAI Jun ，_．ZHU Song ，TANG Jian ， ，WANG Min ，YIN Hong—ping ，CHEN Shang—wel‘ (1．Testing&Analysis Center of Southern Yangtze University，Wuxi 214036，China；2．Key laboratory of Food Science and Safety，Ministry of Education，Southern Yangtze University，Wuxi 214036，China； 3．College of Life Science，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China) Abstract：A simple and sensitive high performance liquid chromatographic method for simultaneous determ ination of eight kinds of neutral monosaeeharides，two kinds of uronic acid and two kinds of gly— cosamine by pre．column derivatization with 1-phenyl-3一methyl一5一pyrazolone(PMP)has been devel— oped．The effects of volume ratios of acetonitrile to phosphate buffer and pH of mobile phase on reten— fion and separation 0f PMP derivatives of the ten monosaeeharides were investigated with Eclipse XPB— C1 Column(4．6 mm X 250 mm)．The results showed that the optimum volume ratio of acetonitrile to buffer was 17 ：83 and that the pH was 6．7．The variations of the peak areas of monosaeeharides deriv— atives due to different reaction times and amounts of HC1 for neutralization of the reaction systems were compared to obtain better sample preparation conditions．Th e developed method was successfully ap— plied to the analyses of monosacchariffe compositions in the polysaccharide fractions(PIMa and PIMb) from Duanaliell口Salina(D．Satina)．The analytical results obtained on the whole agreed with those ob— mined by high—perform ance anion—exchange chromatography with pulsed—amperometrie detection． Key words：Duanaliella salina；Polysaeeharides；Monosaeeharide；High perform ance liquid chroma— tography；Pre—column derivatization；1一Phenyl-3一methyl-5一pyrazolone 杜氏盐藻(Duanaliella Salina)是单细胞、无细胞壁的绿藻类浮游生物，人工大规模培养杜氏盐藻主 要用于提取 ．胡萝 卜素。其提取后的藻渣中存在含量丰富的多糖类物质，由于具有免疫调节、抗病毒、 抗肿瘤等多种生物活性，其研究开发具有重要意义 ]。而盐藻多糖的单糖组成的分析是其性质、结 构及构效关系研究的一项基本且重要的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。由于单糖极性较强，结构相近，且缺乏光学活性，故为 了改善其分离选择性和提高检测灵敏度，人们常将多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色谱法分离和检 测 -rj。其中l一苯基-3一甲基一5一吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色谱法反应条件较温和，产物无立 收稿日期：2006—10—25；修回日期：2006—12-25 基金项目：云南省省院省校科技合作项目(．2001 MAABA00A028) 作者简介：戴 军(1958一)，男，江苏盐城人，副研究员，硕士；汤 坚，联系人，Tel：0510—85863353，E—mail：daihplc@163．corn 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 戴 军等：PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成 207 体异构，紫外检测灵敏度较高，故得到较为广泛的应用 I9]。本文针对多糖中可能含有的单糖种类较多 的特点，在前人工作的基础上，对该方法进一步进行了较系统深入的优化研究，从多种不同反相柱中 筛选出分离选择性较好的EclipseXDB—C 柱，以0．1 mol／L磷酸盐缓冲液一乙腈为流动相考察了乙腈比 例和pH值对8种中性糖和2种糖醛酸的PMP衍生物的保留值及分离效果的影响，比较了不同反应时 间的衍生产物峰面积大小和衍生反应后使用不同量盐酸中和体系时的后续萃取效果，并利用优化的方 法测定了杜氏盐藻多糖的单糖组成。同时用离子色谱法对其结果进行了验证比较，两方法的分析结果 基本一致。 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 Agilentl100高效液相色谱仪，包括 G1311A四元泵，G1315B DAD检测器，G1313A自动进样器， G1379A在线脱气机，G13 16A柱温箱，Agilentl 100化学工作站(美国Agilent公司)；ICS3000离子色谱 仪(美国 Dionex公司)。 衍生化试剂：1一苯基一3一甲基-5一吡唑啉酮(PMP)，纯度 99％ (美国 Acros Organics公司)；乙腈， HPLC级(美国Tedia公司)；三氟乙酸，纯度不低于99％(国药集团化学试剂有限公司)。 单糖 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品：葡萄糖(Glc，99％)、甘露糖(Man，99％)、半乳糖(Gal，≥99％)均购于上海化学试 剂公司；鼠李糖(Rham，I>99％)、岩藻糖(Fuc，I>99％)、葡萄糖醛酸(GlcUA，I>99％)、半乳糖醛酸 (GaiUA，I>97％)均为美国Sigma—Aldrich公司产品；木糖(Xyl，98％)、氨基葡萄糖(GlcN，98％)、氨基 半乳糖(GaIN，99％)均为美国Acros Organics公司产品；核糖(Rib，>99．O％)、阿拉伯糖(Am，99％)均购 于厦门星隆达生化试剂有限公司。超纯水；其它试剂均为分析纯。 杜氏盐藻多糖用内蒙古兰太生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司提供的杜氏盐藻粉提取和纯化制得 。 1．2 混合单糖标样的衍生 分别取 100 的混合单糖标准液(各单糖质量浓度均为0．36 g／L左右)与 100 L的0．6 mol／L NaOH溶液，置于 1 mL的具塞试管中混合均匀；再取5O 的混合液于5 mL的具塞试管中，加 5O 0．5 mol／L的PMP(O．435 5 g／5 mL)甲醇溶液，漩涡混匀；在7O o(=烘箱中反应 100 min；取出放置 10 min冷却至室温；加5O trL 0．3 mol／L的HC1中和；加水至1 mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃 去氯仿相，如此萃取3次。将水相用 0．45 m微孔膜过滤后供 HPLC进样分析。 1．3 样品制备 吸取 100 L质量浓度为4～5 g／L的多糖样品溶液于5 mL的具塞刻度试管中，加入 100 的4 mol／L TFA，充N 封管，110℃烘箱中水解2 h ；冷却后打开盖，加200 甲醇后用N 吹干，如此 重复加甲醇并用 N 吹3次，去除 TFA；加入 50 0．3 mol／L NaOH溶液充分溶解残渣，再加 5O 0．5 mol／L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，同样在7O℃的烘箱中反应100 min，冷却后按“1．2”同法中和、 萃取，并用微孔膜过滤。 1．4 色谱条件 1．4．1 液相色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB—Cl8，250 mm×4．6 mmi．d．，5 m；流动相： 0．1 mol／L磷酸盐(pH 6．7)缓冲液一乙腈(体积比为83：17)；柱温：30℃；检测波长：250 nm；流 速：1 mL／min；进样体积：20 。 1．4．2 离子色谱条件 色谱柱：CarboPac PA20 3 mm×150 mm；流动相：A为 H20，B为250 mmol／L NaOH，C为1 mol／L NaAc，三元梯度洗脱程序：0～21．0 mm，99．2％ A，0．8％ B，O％ C；21．1 min， 94．2％ A．0．8％ B，5％ C；30．0 min，79．2％ A，0．8％ B，20％ C；3O．I～5O．0 min，2O％ A，80％ B， O％ C。流速：0．5 mL／min；积分脉冲安培检测器，金电极 ，四电位波形。进样体积：2O 。 2 结果与讨论 2．1 色谱柱的选择 以0．1 mol／L磷酸盐(pH 6．7)缓冲液 一乙腈(体积比为83：17)为流动相，分别试用Waters Atlantis 维普资讯 http://www.cqvip.com 208 分析测试学报 第 26卷 dC18、 Waters Symmetry C18、ZORBAX Extend—C18、ZORBAX Eclipse XDB—C18、Hypersil AA—ODS、Venusil XDP C 6种不同反相柱(均为250 mm×4．6 mm i．d，5 m)进行“1．1”中所述8种中性糖和2种糖醛酸 的分离，结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明ZORBAX Eclipse XDB—C， 柱分离效果较好，且分析时间较短(图1)。 2．2 流动相 pH及乙腈体积分数对分离的影响 以磷酸盐缓冲液 一乙腈为流动相反相分离PMP一醛糖衍生物时，缓冲液的pH是一重要的影响因 素，文献选用的pH大多为5～6左右 I81加J。本文先用0．1 mol／L磷酸盐缓冲液(pH 6．0)一乙腈作流 动相，考察了乙腈比例对上述8种中性糖和2种糖醛酸在ZORBAX Eclipse XDB．C 柱上的保留值及 分离效果的影响，结果显示：乙腈的体积分数为17％时分离较好。实验进一步考察了缓冲液的pH对 各种糖的保留值及分离效果的影响。结果表明：pH为6．7左右时分离效果最佳，分析时间较短，出 峰间距较均匀。图1显示在该最佳条件下两种糖胺也可与这8种中性糖和2种糖醛酸同时分离(两组 混标色谱图显示于同一坐标中)。本文方法不需梯 度洗脱即可同时实现 l2种单糖 一PMP衍生物的分 离，比文献中的分离效果好，且同时分离的单糖 较多。 2．3 衍生化反应时间的选择 文献中的衍生化反应时间大多为 30 min_6。I9 J， 个别选用2 ]。本文在其它条件(如“1．2”所述)相 同情况下，将上述8种中性糖和2种糖醛酸的混合 标样分别采用不同反应时间(30、50、70、100和 120 min)进行衍生化，考察衍生化产物的峰面积大小变 化 ，结果表明：反应时间为 100 min时各种糖的 PMP衍生产物的峰面积均为最大值，70 min次之； 100 min时各种糖的PMP衍生产物总的峰面积比30 min大30％左右，故衍生化反应时间选为100 min。 2．4 酸度对萃取效果的影响 衍生反应完成后，为去除过量的衍生化试剂， 需用氯仿萃取。由于如图 2所示的 PMP一醛糖衍生 产物的化学结构中含有碱性基团(在较高 pH值时不 解离，因而易被氯仿萃取而损失)，故在萃取前中和 反应体系中的碱所用的盐酸量对糖的 PMP衍生物在 萃取过程中的定量回收或损失应有一定的影响。若 中和不够，pH较高，糖的PMP衍生物在氯仿中有 一 定的溶解度，在萃取中的损失较显著_l 。因此文 献中有使用等当量的盐酸中和反应液中的氢氧化 图1 12种单糖 一PMP衍生物的色谱分离图 Fig．1 Chromatograms of 1·phenyl·3一methyl-5一pyrazolone (PMP)derivatives of twelve kinds of monosaeeharides H N 图2 PMP(a)与 PMP—Glc衍生物(b)的结构式 Fig．2 Structures of PMP(a)and PMP—glucose derivatives(b) 钠_6 J，也有使用过量的盐酸中和使pH为酸性(pH 3～4 或4～5_8]，即相当于本法中使用57 L或62 的HC1中和)。本文考察比较了不同体积(50、57、62、67 )的HC1(0．3 mol／L)中和后的萃取效 果，结果表明，使用等当量的盐酸(50 )中和即可，此时大多数单糖一PMP衍生物的峰面积较大，且 l0种糖衍生物的总的峰面积最大。此现象说明pH值太低也会增大单糖 一PMP衍生物的损失，这可能 是因为在酸性条件下，衍生产物不太稳定。 2．5 检测线性及检出限 将8种中性糖和2种糖醛酸配制成一系列不同浓度的混合标样，分别按“1．2”衍生化，并在“1．4” 所述条件下进样检测，以测得的各种糖的峰面积对相应浓度作工作曲线，结果见表1。以3倍信噪比计 得这l0种单糖的检出限为0．081～0．271 nmol(表1)。由此可见，本方法的检测线性很好，线性范围较 宽，检测灵敏度较高。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第2期 戴 军等：PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成 209 y：peak area； ：sugar concentration(mmol／L) 2．6 杜氏盐藻多糖的单糖组成测定 按“1．3”中的水解和衍生化方法及“1．4”中的色谱条件测定了纯化后的两个主要盐藻活性多糖级 分H 的单糖组成，其结果和色谱分离图谱见表 2和图 3。PD4a和 PD4b的各糖组分峰的定性除据保留 时间和 DAD紫外光谱图外，还用液相色谱 一质谱联用分析给予验证(Lc—Ms分析内容另文发表)。在 PIMa图谱中，分别靠近核糖(Rib)和葡萄糖(Glc)峰前均有一小峰，两者保留时间分别与葡萄糖胺和半 乳糖胺标样的PMP衍生物保留时间很接近，但用LC—MS分析证实这两峰均不是糖胺。为了以不I司方 法验证本文方法的定量结果，同时用离子色谱法 也测定了这两个多糖级分水解后的单糖组成，其结 果与 PMP柱前衍生化法基本一致(见表2)。 表2 杜氏盐藻多糖级分PD4a和 PIMb的单糖组成(摩尔分数x／％，n=3) Table 2 Monosaccharride eompositions of two polysaccharide fractions(PD4a and PD4b)from D．salina(mol fraction x／％．n=3) 习 图3 杜氏盐藻多糖级分PD4a和PD4b水解样品的PMP衍生化产物的色谱图 Fig．3 Chromatograms of PMP derivatives of acid hydrolyzates of two polysaccharide fractions(PD4a and PD4b)from D．salina 3 结 论 本文建立的PMP柱前衍生化高效液相色谱分析单糖的方法准确可靠，灵敏度较高，可I司时分离检 维普资讯 http://www.cqvip.com 210 分析测试学报 第26卷 测的单糖数量较多，取样量少，且分离效果较理想。本法尤其适用于微量多糖样品的单糖组成测定。 由本法测定的杜氏盐藻活性多糖级分的结果显示，PD4a中主要含有半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡 萄糖及盐藻糖5种中性糖，还含有少量糖醛酸；另一种多糖级分PD4b中主要含有核糖、葡萄糖、半乳 糖、阿拉伯糖及木糖5种中性糖，不含糖醛酸。 致谢：戴安中国有限公司北京应用研究中心的梁立娜博士和上海农科院食用菌研究所的刘艳芳工 程师对本文的离子色谱分析实验给予热心帮助，谨表衷心谢意! 参考文献： [1] 丁 新，李玲凤．关于盐藻多糖的研究[J]．海湖盐与化工，1996，24(6)：4—6． [2] FABREGAS J，GARCIA D，FERNANDEZ—ALONSO M．In vitro inhibition of the replication of haemorrhagic septicaemia virus(VHSV)and African swine fever virus(ASFV)by extracts from marine microalgae[J]．Antiviral Res，1999，44 (1)：67—73． 『3] HONDA S．Post—column derivatization for chromatographic analysis of carbohydrates[J]．J Chromatogr，A，1996，720： 183—199． [4] ENGLYST H N，QUIGLEY M E，HUDSON G J．Determination of dietary fibre as NSP with GLC，HPLC or spectrophoto- metric measurement of constituent sugars[J]．Analyst，1994，1 19：1497—1509． [5] MEYER A，RABA C，FISCHER K．Ion-pair RP—HPLC Determination of sugars，amino sugars，and uronic acids after derivatization with p-aminobenzoic acid『J]．Anal Chem，2001，73：2377—2382． [6] HONDA S，AKAO E，SUZUKI S，et a1．High—performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ul— traviolet—absorbing and electrochemically sensitive 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