免疫胶体金技术影响因素分析

中国畜牧兽医 2009年第36卷第5期 经验交流 ·199· 免疫胶体金技术影响因素 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 张付贤1’2，王兴龙2 (1。吉林大学农学部畜牧兽医学院，长春 130062；2．军事医学科学院军事兽医研究所，长春130062) 摘要：免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点，受到国内外科研丁作者及基层工作人员的普遍关注。笔者从耗材的 选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素，为制备胶体金检 测产品提供理论依据和技术参考。 关键词：免疫胶体金技术；影响因素；选择；检测 中图分类号：Q-33 文献标识码：A 文章编号：1671-7236(2009)05—0199—04 自20世纪70年代，Faulk等(1971)用胶体金 作为特殊标记物进行研究以来，建立的各种免疫胶 体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特 点，在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛 应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗 粒、抗原与抗体动态结合的反应过程，在这个过程中 每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过 程中每个环节又受到很多因素的影响和制约，下面 将影响免疫胶体金技术的因素作一分析，为成功制 备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1．1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在 试验中至关重要，作为反应载体影响到整个试验的 成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的 聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相 同，对生产出的膜的性能产生较大影响一膜的孔径 和分布结构不同。膜孔径减小，膜的实际可用表面 积递增，膜结合蛋白的量也递增；膜孔径越小，层析 速度也越慢，金标复合物通过T线的时间就越长， 反应也就越充分；因此膜孔径越小灵敏度越高，但是 同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机 会，也就是假阳性越高(李云等，2002)。用于金标免 疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素／ 醋酸纤维素混合膜，不同的包被蛋白对膜有特定要 求，试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小 和分布结构的膜，找到合适的平衡点，使胶体金的标 收稿日期：2008—11—28 作者简介：张付贤(1982一)。男，河南人，硕士，研究方向t兽医微 生物与免疫学。 通信作者：王兴龙(1959一)，男，吉林人，博导，从事分子免疫学 研究。E—mail：wangxl-2006@163．com 基金项目：吉林省科技厅 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(20050549)。 记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等，2007)。 1．2 结合垫的选择结合垫位于层析系统的中间， 一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低，能 很好地负载胶体金标记物和待检测样品，而不被吸 附(张美玲，2006)；玻璃纤维素膜具备以上优点，同 时具有一定的硬度，为试验中常用。 1．3样品垫及吸水纸的选择样品垫和吸水纸位 于胶体金免疫层析系统的两端，对于胶体金层析系 统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据 试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水 纸，保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而 不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测 样品为血清，则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜 即可；如果检测样品为毒素，则可选择质量好的吸水 纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力，保证 样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸 收和蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫 快速试验中非常关键，如果金颗粒直径的变异范围 太大就会影响到试验的稳定性和重复性，如果金颗 粒的形状不规则或粒径不均一，使得胶体金标记物 容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底 色过深和假阳性现象；而且胶体金质量不好，胶体金 结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离，从 而影响试验结果(Bassab等，2001)。 胶体金的制备除了保证药品的质量外，制备过 程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环 境和所用容器的清洁度(翟雷等，1996)。所有进入 溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成 的胶体金出现聚堆现象，容器最好经酸洗和硅化处 理。操作环境应保持清洁无尘粒，最好有专用工作 万方数据 ·200· 经验交流 中国畜牧兽医 2009年第36卷第5期 区。其次，配制溶液均需使用双蒸水或三蒸去离子 水配制，烧制胶体金最好用去离子水。再者是不同 的还原剂对胶体金质量的影响。胶体金制备基于还 原法，改变还原剂的性质和浓度，可制备粒径不同的 胶体金悬液。根据试验目的选择胶体金的粒径，根 据选择的粒径确定还原剂，如制备金颗粒直径在5 ～12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸还原氯金 酸；如制备大于12nm直径的金颗粒的胶体金则用 柠檬酸三钠还原氯金酸。此外不同的烧制 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 、胶 体金的制备量、还原剂的加入方式、加热容器的大小 及加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小和均一性 (唐景峰，2006)。根据所需胶体金的粒径和数量，结 合自身试验条件选择合适的胶体金制备方法。 3标记蛋白与相关抗原、抗体的制备 标记蛋白、T线和C线的抗原或者抗体的纯度 和浓度直接影响金标探针的质量。获得纯度高、浓 度适中的抗原、抗体，关键在于制备和纯化方法的选 择及条件的优化。试验前须采用高速离心去杂质， 应用饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、透析除盐等一系列 处理方法，尽可能去除单克隆抗体、二抗和相关蛋白 溶液中的高浓度的杂质和多余离子，避免其干扰目 的蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的 凝聚(李希友，2006)；特别是硼酸盐和磷酸盐不利于 胶体金和蛋白的结合，应尽量避免接触。同时，充分 处理各种大分子蛋白，使其尽量分散为单体和具有 适当的分子质量，提高胶体金与蛋白质的结合比，便 于与胶体金充分而稳定的结合。 4胶体金的标记 胶体金标记的两个关键环节是标记时的pH和 最佳蛋白质标记量的确定(吴海波，2006)。根据胶 体金标记的原理，只有在pH接近和稍高于蛋白质 的等电点时，胶体金蛋白质的吸附力最强；pH过高 过低都不利于两者的结合，因此标记时选择精密的 酸碱度测定仪器或者试纸条，采用不同方法重复校 正，并进行梯度试验找到最佳的标记pH。溶胶与 被标蛋白质的用量比例是否合适是影响标记成功的 一个重要因素。过多蛋白质标记，造成浪费的同时 引起试纸的拖带现象；过少蛋白质标记，导致胶体金 标记不完全，从而降低试纸的灵敏度及假阳性现象 的出现。也需要在试验中进行梯度试验，反复比较 不同标记量的标记物在破坏试验中的稳定性，确定 最佳的标记量(邓省亮等，2007)。 5 膜包被条件的优化处理 膜的包被条件，包括膜的封闭、环境的湿度、T 线和C线上抗原或抗体的浓度、点膜条件、温度、包 被时间等，需要结合试验实际情况进行反复调整。 包被过程中需要特别注意以下两点：①膜上T线和 C线抗原或抗体的包被量要相对饱和；②包被后的 膜一定要在适宜的温度下彻底干燥，否则会造成拖 带、显色不清晰，灵敏度也大受影响(张辉，2008)。 5．1封闭对使用的膜进行处理，特别是进行封闭 是一个十分有争议的问题，理论上来说购买回的膜 基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用。 如果点膜前将膜浸泡在封闭液内进行封闭处理，必 然扰乱了膜内正常的物质分布，由此引发了许多不 必要的麻烦。但是如果在实际的试验操作过程中， 发现没有进行封闭的膜出现非特异性条带或者出现 拖带现象，或遇到膜不封闭就无法将蛋白质或抗体 包被在膜上的问题，就应考虑封闭问题。建议在制 作试纸条过程中根据各自标记物的性质及其在膜上 的显色情况来选择封闭与否，如果标记效果比较好 且在膜上显色清晰而无拖带及假阳性现象出现，则 完全没有必要进行膜的封闭。反之，可进行膜的封 闭，查找不理想现象出现的原因。用来对膜进行封 闭的物质很多，多选用大分子蛋白质如牛血清白蛋 白(BSA)、聚乙二醇(PEGMW20000)等(戴荣四， 2004)。常用的封闭方法有流动封闭和膜上定点封 闭，前者将封闭物处理在样品垫上，后者将作用物质 配成溶液喷涂在膜的特定位置上。 5．2环境湿度环境湿度对点膜过程非常重要。 最佳湿度一般在45％～65％。湿度过低，膜上容易 聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试时出现疏 水斑；湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起 T线、C线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度 的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平 衡一段时间。， 5．3 T线和C线上抗原或抗体的浓度T线和C 线上抗原或抗体的包被浓度直接影响其与金标记物 的结合比例，最终影响试纸条条带的显色效果。包 被浓度过低，膜上的条带显色不清晰或出现条带中 空现象；包被浓度过高，会导致C线不显色或者出 现拖带现象。若要获得反应稳定、显色清晰的试纸 条，须对2条线上抗原或抗体的配合浓度及两者与 金标记物的结合比进行调整和比对，以期得到最佳 万方数据 中国畜牧兽医 2009年第36卷第5期 经验交流 ·201· 的组合。 5．4点样位置不同的T线、C线点样位置将带 来不同的灵敏度，点样位置上移，金标复合物通过T 线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高；反 之灵敏度降低。可采用这个方法来改变灵敏度和消 除假阳性。 5．5点样仪器目前有2种点样方式，划膜式和非 接触点膜式。非接触点膜式优于划膜式，划膜式需 用软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质较 为软脆，划管会在其表面留下印痕。划痕容易对层 析的金标复合物形成阻力，导致假阳性，同时容易出 现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线，影响 结果的判定。点样仪器不仅可以控制T线、C线点 样位置，也可通过点膜仪器各种参数的调整控制T 线与C线宽度及喷膜速度等细节，达到最好显色效 果。需要在试验过程反复调整各项参数做比对试 验，观察试纸条的显色情况来决定。 6缓冲液 缓冲液构成胶体金免疫层析技术的液相载体， 在不影响胶体金与蛋白质、抗原与抗体、硝酸纤维素 膜与T线及C线蛋白结合的前提下，并为它们的结 合反应提供最佳的酸碱环境。缓冲液并不是通用 的，不同的反应体系需要不同的缓冲液来支持，这就 需要试验者结合自己的试验尝试不同的缓冲液，确 定适合自己的缓冲液配方。常用的缓冲体系是在选 用的缓冲液(磷酸盐、硼酸盐等)中添加相应的作用 物质配制而成，所谓作用物质是解决反应体系出现 的菜一特定问题而添加的相应物质。比如通过在缓 冲液中添加适量的表面活性剂(如Tween-20)，可起 到增加亲水力、增色和避免线条中空现象；也可同时 添加几种物质。通过它们之间的相互协同作用共同 解决相关的问题，如少量NaCl，减少信号强度，消除 假阳性；糖和聚乙二醇作为保护剂。能减缓老化速 度，也可以增加亲水力，但也要注意作用物质的添加 宜简不宜繁。试纸条制备过程中的很多处理液都是 在选择的缓冲液的基础上添加相应的作用物质配置 而成的(如封闭液、结合垫处理液等)。 7样品的处理与结果的判定 7．1样品的处理方法和加祥量临床送检标本(如 全血、血清、血浆)，不同的单位和检测人员采用的处 理方法不统一，也会对结果判定造成影响。如血浆 内大量的纤维蛋白原，影响到层析的速度及均一性， 直接影响到抗原抗体结合，处理不当甚至出现一种 非特异性结合。检测时样品的添加量要相对充足， 使膜上的反应充分进行，以便得到清晰的结果。加 样量过低，会导致样品在试纸条上层析不充分而出 现假阴性。 7．2 结果的判定 由于使用胶体金产品的工作人 员分布在不同的层次、不同的部门。判定结果时有很 大的随意性，判定时间不统一，特别是在工作环境、 温度、湿度的影响下，根据标志线的显色时间随意判 定结果，而忽略了厂家制定的有效时间。因此在检 测时要求工作人员能及时分辨出试验结果出现的假 阳性、假阴性现象及异常条带，能在查找原因后复检 或结合相关的检测方法重新检测进行比对和确认， 避免漏检和错检(黄永莉等，2003)。 8产品的保存和验证 8．1产品的储存刚生产出的试纸条或检测卡一 般含有5％～10％的水分，储存过程中环境过于过 湿都不利于产品的储存。环境过于膜上的水分蒸 发，会使膜变得疏水、带电荷并变脆；环境过湿影响 金标记物的质量及T线、C线的显色效果；因此成 品的试纸条和检测卡应进行防潮设计，存放时间过 长时一般要求避光、密封保存。环境的温度也影响 标记物、抗原、抗体的生物活性，在低温条件下可有 效延长产品的储存时间。 3．2成品验证试验验证试验包括特异性试验、线 性灵敏度试验、稳定性试验、样品检测、干扰试验、批 间批内重复性试验等10个试验，综合评定产品的质 量(尧蒙，2005)。成品验证试验需要的时间比较长， 特别是产品的稳定性试验需要在很长的时间内定期 抽样检测。应结合自己的试验，参照相应的国家或 行业 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，制定针对性的试验检测成品的特异性、稳 定性、重复性及灵敏度等指标，为进一步的优化和最 终制成优质的检测试纸条或检测卡提供数据支持。 综上所述，胶体金免疫层析技术的各个环节受 到种种因素的影响，也使得以免疫胶体金技术建立 的检测方法在实际应用过程中也存在着一些问题， 如胶体溶液的稳定性较差、存放时间相对较短及灵 敏度受到多种因素的影响而下降等，导致免疫胶体 金技术的应用受到一定限制。随着科技的进步，这 些问题将在今后的研究中被逐步改善．免疫胶体金 技术也将更进一步显示其巨大的优越性，实现半定 量或定量检i煲!l及多元化检测。拓宽其在光镜、电镜、 万方数据 ·202· 经验交流 中国畜牧兽医 2009年第36卷第5期 流式细胞仪、免疫印迹技术、生物芯片等领域内中的 应用。 参 考 文 献 1邓省亮，赖卫华，许杨．胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素 B1的研究l-J]．食品科学，2007，28(2)：232～236． 2尧蒙．禽流感免疫胶体金快速检测技术研究[D]．重庆：西南农业 大学，2005． 3吴海波．0型口蹄疫病毒单克隆抗体的研制[D]．兰州：中国农科 院兰州兽医研究所，2006． 4张美玲．肺炎支原体抗体胶体金法快速检测试剂的研制与初步实 验室考核[D]．北京：军事医学科学院微生物流行病研究所， 2006． 5李云，焦春梅．胶体金免疫层析法检测梅毒螺旋体特异性抗体的 方法学评价[J]．实用医技杂志，2002，9(6)：410～411． 6李希友．鸡新城疫单克隆抗体制备及免疫胶体金诊断试纸条的研 制[D]．泰安：山东农业大学，2006． 7郑则乐，洪英，魏良宇．应用免疫金标检测试纸与其它方法检测猪 瘟抗体的比较[J]．中国畜牧兽医，2005。32(7)：51～52． 8唐景峰．布鲁氏菌抗原抗体免疫胶体金检测试纸的研制及初步应 用[I)]．长春：吉林大学，2006． 9黄永莉，程维兴，邢颜超．胶体金免疫层析技术检测HBsAg临床 应用评价[J]．临床军医杂志，2003，81(03)：89～91． 10翟雷，h晓萍，潘萍，等．免疫胶体金试剂的制备及应用胶体金免 疫电镜技术检测戊型肝炎病毒口]．微生物学免疫学进展，1996， 24(3)：17～19． 11戴荣四．鸡新城疫免疫胶体金诊断技术的研究[D]．长沙：湖南农 业大学，2004． 12BassabC，SyamalR．Manufacturinghighqualitygoldsol[J]． IVDTechnology，2001，8：46～54． 13FaulkMP．TaylorCM．AnImmunocolloidmethodfortheelec- tronmicroscope[J]．Immunochemisty，1971，8：1081． AnalysisoftheAffectingFactorsofImmuneColloidalGoldTechnique ZHANGFu—xianl¨．WANGXing-lon92 (1．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，JilinUniversity，Changchun130062，Chinaf 2．TheMilitaryVeterinaryInstitute，AcademyofMilitaryMedicalSciencesofPLA，Changchun130062，China) Abstract：Immunecolloidalgoldtechniquehasbeenreceiveduniversalattentionbythedomesticandforeignresearchersfor itsfast。accurateandsimplecharacteristic．Themainaffectfactorsofthetechniquewereanalysisedinthisresearch，themate— rialsandthemethodsforpreparingandlabellingthecolloidalgold，coatingthenitrocellulosefilter，thepreservationandstabili- tydetectionfortheenditem．Itisexpectedtoprovidethetheorybasisandthetechnologyreferenceforpreparingtheproduc。 tionofthecolloidalgolddetection． Keywords：immunecolloidalgoldtechnique；affectfactors；choose；testing 通过电穿孔法用血凝素蛋白DNA疫苗对小鼠进行单独免疫可以诱导其产生 针对H5N1亚型禽流感病毒的早期保护 LiyunZheng等著邱文英摘译胡小华校 摘要：试验背景：研制一种疫苗使人类免受H5N1亚型 禽流感病毒的感染是一项迫在眉睫的任务。DNA疫苗是传 统疫苗的替代品，可以预防新的H5N1亚型禽流感病毒的 出现。在本试验中，笔者对用表达H5N1亚型禽流感病毒 血凝素蛋白(HA)的质粒DNA进行单独免疫时在感染早 期是否可以使小鼠模型抵抗致死攻击进行了评估。试验方 法：在对小鼠进行致死攻毒前的第3、5、7天用HA疫苗分 别单独免疫1次。小鼠的存活率、肺中病毒的滴度及体重 的变化作为评估疫苗保护力的指标。在免疫后的不同天 数，摘除小鼠眼球收集血清并通过El。ISA和HI试验对特 异性抗体进行检测，用以测定HADNA疫苗介导的体液免 疫反应。免疫后分离脾细胞，通过EI。ISPOT试验测定抗原 特异性T细胞反应。试验结果：攻毒试验结果表明，用 H5N1亚型禽流感病毒HADNA疫苗进行单独免疫可以 产生针对同型致死病毒量的有效的早期保护。免疫学分析 显示，在免疫后的短时间内小鼠体内可以产生具有抗原特 异性的抗体及T细胞反应。疫苗的保护能力取决于所注 射的DNA的量及免疫后的持续时问。结论：与电穿孔法 相结合，用100pgH5N1亚型禽流感病毒HADNA疫苗对 小鼠进行单独免疫能够在同型病毒感染的早期产生保 护力。 关键词：电穿孔法；H5N1亚型禽流感病毒；血凝素蛋 白；DNA疫苗 (原栽：BMCInfectDis，2009，9：17) 万方数据