免疫胶体金技术在兽医检验中的应用

《上海畜牧兽躐遵讯》2009串第6期 ·77· 免疫胶体金技术在兽医检验中的应用 李云飞 鄂海红冯晓东 黄素珍 (山西农业大学动物科技学院 山西太谷030801) 免疫胶体金技术即免疫金标记技术(Immunogold labdlingtechnique)。髑胶体金作为特殊橼记物的研究始予20 螯鳃50每我耪，1962零Fe继bert等掇遘了臻获薅金搽诡缨 胞避符电子显微镜静研究。1971年，Faulk和Taylor将胶体 金引人免疫化学，首次阁免疫金标记技术研究沙门菌壁细胞 抗原成分，又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近几年随 着该技术的不断发展，胶体金已广泛应髑于电镜、流式细胞 仪、篼疫印迹、渡捃受痰测定、霾裰斑点众／镶、斑点金免痰渗 滤及免疫层橱。兔瘦黢体金技术谗为一静耨斡免疫学方法， 困iiii舆有敏感性高、特异性强、稳定性好，操作简便、快速，分 析结果准确、易于判寇撺优点。因此自矮问世以来，在医学、 动檬物检疫、食品安全监督各研究领域_i媳速发展。近年来， 它受多地被应用于免疫学朔细胞学楣关分子水平斡检测搴。 客簇攀猃验孛懿应髑燕要是免疫层耩浚(immunochroma— togmphy)和快速免疫垒渗滤法(dot—immuogoldfiltrationas． say，DIGFA)。随着人们物质生活的改替，有关人与动物健康 的问题在现实生活中融娥得非常突出。从20世纪90年代 至今的多篇报道都是荚乎人与动物体棚美抗体和病愿体梭 遗传泌乳性能和采食消化生理机能不协调，致使高产乳牛储 养食人量和泌乳营养产出量呈负平衡，不得不分解体组织， 以满足产奶的营养需要，故牛体况下降。该阶段泌乳能力的 发撂慰键葵管理零孚浆褰羝反应最敏感，璞嬲营葬和忝皴审 草药复方容易提褰程缳持产奶耋。两拜孪谯泌乳盛期，乳骤缀 织容易被乳房炎致病躐予感染，从而引发乳房炎。 因此在泌乳盛期阶段要加强隐性乳房炎的普查工作，对 于隐性乳房炎普查强阳性的病例给予治疗，可用公英散，以 滂热解毒，消肿散癜。处穷组成：薄公荚、佥镶莸、连起、一变 羹藐、澈燹母、丝蹑臻、麓路通。8溱药粉醛，怼薅，潼玺，混键。 4．3泌乳中期 泌乳中期是指产后第101--200d之间。在该阶段，奶牛 奶产纛开始逐渐下降。除加强该期奶牛的饲养管理外，可谯 此阅农镪料中添加增乳努，以补气养搬，通经下乳。处方缌 残：象黄甍、党参、警瑟、j||萼、势王不嚣褥、籍骆逶、瀑芦。7 妹药粉碎为粗粉，过筛，混匀，混饲。 此外，该阶段奶牛缀过一个漫长的泌乳时期以后，容易 出现气血两虚、胎动不安。对于有流产征兆或者有习惯性流 产的孕畜，可饲喂或煎水内服安胎方，以朴气血，安胎。处穷 缝成：毙参、黄芪、自零、熟绝、当爨、自麓、强芎、续瞬、黄芩、 炙嚣攀。lO昧药耪薄为糠粉，过戆，混匀，混镯或熬承内凝。 4．4泌乳后期 奶牛产后201d左右至于奶期这段时间称为泌乳后期， 是泌乳期向干乳期过魔的时期。该阶段的特点是，由于受胎 盘激素鞫黄薅激素的臻爆，产奶量开始犬壤度下降，每月递 减终8％～12％。在乎奶翦一震，霹饲曦炒麦芽，竣霞乳消 肿，减少奶牛泌乳，加滤千奶。 测的。 l 免疫胶体金技术的基本原理 受疲黢俸金菝拳是泼黢俸金终秀示踪拣悫魏或曼色麓， 应用予抗琢抗体的一种薪激的免疫标记技术。由于它不存 在内源酶甲扰及放射性同位豢污染等问题，鼠利用不同颗粒 大小的胶体金还可以作双鬣甚至多重标记，使定位更加精 确。因此融成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后 黪一静毅攒据记技术。胶体众是鑫氯金酸(糙觚瓯)在逐琢 翔鲡自碘、抗坏盎酸、穆橼酸钠、鞣酸等俸麓下，被还源丽析 出纳米尺殿的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，并由于静 电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱 碱环境下带负电荷，可与蛋囱质分子的正电荷熬圃形成牢固 的结合，瘀予这种结合是静泡缝合，所以不影睫蛋自爱的生 耪褥往。狡体金除了与蛋囱凌结会浚卦，还霹泼与诲多其它 生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。免疲胶体金颗粒 具有高电予高密度的特性，檄屉微镜下金标鬣白结合处，可 见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时， 肉眼可见筑色或粉红色斑点，阚两可用于定性溅半定量的快 4．5干奶期 进入妊娠后期，停止挤奶到产犊前15d。称为干奶期。 于奶时间的长短根据母牛的年龄、体况、泌乳性能丽定。一 觳是毒5～75d，平均势50～60d。予奶褰是鸯夸镯养警瑾遗 翟孛的一个霪要环节。手奶期 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 纯的饲养案理对于骀梵 的发育、诹牛的健康有着直接的关系。 此外，奶牛代谢快，产热多，单位体重的散热面积小，汗 腺机能不发达，不利于皮肤蒸发散热，适宜生涵温度在lO～ 15"C左右，形成了il|寒怕热瓣生物学特性，当舔境遂度较裹 爵热争豹璧产性能将会受蠲鹅显影昀。我餮掰方夏季气澄 较高，平均气温都在30℃以上，并且持续时间长，因此对于南 方建立的有机牧场，应采取有效措施缓解奶牛热应激，维持 奶牛持续高产。当夏季气温超过25℃时，可饲喂抗应激方以 辛凉解 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ，溥热解毒。处方缀成：菊花、连翘、薄棼、荆莽、淡 蔓菠、孛蒡挚、接梗、淡镗睁、羹革、芦攘，将上述芬物耪碎秀 楹粉，过赡，混匀，混饲。 参考文献 [1]李胜利。蘸国强．任师喜。等．娥立我国有机奶生产体系需要解决 的问题(J)．中国畜牧杂志。2006。42(20)：13～17． 【2】张丹最，簸农赣．有橇魏秘蠢极襞裁瑟静开发￡l】。孛嚣襞蜇。 2004。3：37～38． (3]张爱冒．蹲必基．中国有机奶发展的实践与憨考(J)．中国乳业， 2007。5：54～58． (4]张克春．豢成与创新我国南方地区有机奶牛饲养情理新模式【J】． 乳业科学姆技术。2008。2：16． 【5】嚣秀兹，燕馁+孛孳药黪剃袈华巍痨炎懿骚究遴鼹(j】。韶蘩蓊学 与动耱医学，2001，18(2)：33～36． (6]李如治．奶牛热应激研究现状(J)，中国奶牛，1995。(4)：38～40． 万方数据 ·78· 《上海肖牧兽医通讯》2009年第6期 速受疫捡溅。 2胶体金的镧备 胶体金的制备多采用还原法。氯金酸(HauCl。)是主要 还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、白磷、硼氢化钠、抗 坏血酸等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备 0。8--150nm不等的胶俸金。 2。薹柠檬酸三钠还原法制备金溶获 取0．01％氯金酸水溶液100ml加热至沸，搅拌下迅速 加入1％柠檬酸三钠水溶液0．7ml，并充分混匀，继续煮沸 10rain，溶液颜色由深蓝色逐渐变为红色，冷却聪以蒸馏水 恢复到愿体积，郎为制备的胶体企溶液，与4℃邂光保存。如 攒：麓备戆金滚获其霹琵光嚣簸嵩吸波峰在535黼，Alcm／ 535=1．12。众溶胶的光散射饿与溶胶颗粒的火小密切相 关，一旦颗粒火小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉 眼可见的显麓的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或称 免疫凝集试验的基础。 金溶黢颞懿戆壹径纛制餐涎瓣入戆拧檬酸三钠量是密 锈籀关酶，保持箕俺条俸恒定，仪敬变搬大鹃柠檬酸三锈量， 可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶。 2．2柠檬酸三钠一鞣酸混合还原法 用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶，操作方法 如下：取4ml1筠柠檬羧三钠(Na3c6H507。2H20)，舷入0～ 5ml1冁鞣酸，9～5ml25mmo／Lbcch(俸积毒联黢船大量 相等)，以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml，加热至60℃ 取1ml1％的HAuCh，加于79ml双蒸馏水中，水浴加热至 60℃，然后迅速将上述柠檬酸一鞣酸溶液加入，予此温度下 保持一定时嬲，待溶液颜色变成深红色(约器0．5～1h)后， 3}冬溶滚黧熬黧沸瓣，缳撩沸簿5min鄯霹。改变鞣敬懿燕人 量，制得的骏体颗粒大小不同。用以上体系制备的肢体金颗 粒直径约为5nm。 2．3白磷避原法 在120ml双蒸馏水中加入1．5ml1％氯金黢和1．4ml 0，1mol／L鹣(．303，然曩魏久1ml-：ff分之一锪秘发戆鑫骥乙 醚溶液，混匀鬃室温放譬15min，在霞流下煮沸纛至红褥色 转变为红色。此法制得的胶体盛直径约6nnl，并有很好的 均匀度，但自磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。 2．4硼氢化钠还原法 在覆冷4"C鹣40ml双蒸承巾热入0。6ml％氯金酸永溶 液0。2mol／LK2C03溶滚2ml。粼藉揽捧下，迅德加入薪鲜 配制的硼氢化钠溶液(O．5mg／m1)0．4ml，分3～5次加入，直 至溶液颜色从蓝紫色变为橙红色后的不再改变为止，继续搅 拌5min，即得直径为2～5nm的胶体金。 2。5抗坏血酸还燕法 取1％畿龛酸承溶滚1ml至麓瓶蠹，魏入1。5ml 0．2mol／I-,K2003和25ml双燕水，混匀后置冰潲内，搅拌下 加入1ml0．7％抗坏血酸溶液，溶液呈紫红色。随后加入双 蒸水至100ml，加热溶液变为筑色为止。制得胶体金颗粒直 径为8～13nnl。 3免疫胶体金标记 3。l蛋白质的处理 由于盐擞成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并易使溶 胶聚沉，故致敏前应先对低离予强度的水透析。鬣白质溶液 庞绝对澄游至无缓小檄粒，否弼应先麓微琵滤貘或超逮离·§ 除去。一般情嚣下波避免磷酸校离子翔硼酸横离子瓣存在， 蹦为二者均可吸附下颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。 3．2蛋白质最适用量的选择 将待标记的鬣囱质储存液作系列稀释后，分别取1ml (禽蟹自质5-40mg)嬲到1ml致体鑫溶液孛，另设一管不 瓣缀鸯凌懿怼照管，5rain磊藤入0，lml10％NaCI溶浚，滋 留后静置2h，不稳定的金溶胶将发嫩聚沉，能使胶体盒稳定 的最适蛋白量再加lO％即为最佳标记蛋白量。 3．3标记 在接近并略为岗子蛋自爱等电点的条件下进行胶体金 搽淀是毙较会逶戆，程瑟穗琵下蛋鑫貘分子在金鬏数裘溪戆 吸附量最大。 4胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存 胶体金具有很商的动力学稳定性，在洁净的玻璃器胍中 可较长时间保存，弦稳定因素不受破坏时自身凝聚极幔，放 爨数年不发生凝聚。熬入步诲薮腐勰霹套翻予缳存，缳彩苓 巍时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颓簸并不 影响以后胶体金的标记，使用时为掇高标记效率可先低速离 心去除凝集颗粒。影响稳定的因素盘要有电解质、溶胶浓 度、温度、非电解魇簿。 多静蛋白度、麓聚糖、PEG2000、鞠获等稳为良好妻毫骞分 子稳定裁，PEG纛黢渔是最常焉静稳定髑。稳定翔蠢鬻大 作用：一为保护胶体众的稳定性，使乏便于长期保存；：为防 止戏减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合 理选择是十分重要的，不适当的稳定荆有时也会导致非特异 饿反瘟。 兰金溶藏啜辩鬃鑫爱嚣，溶荻懿豫定毪隧溶滚pn蠢燮 纯，箍这种变他又取决于吸附蛋自旋的等电点。如ConA、过 载化物酶等，当pH较低时保持稳寇，提高pH则显得不稳 定，接近等电点或略商时又变得稳寇了。标记后的胶体众溶 液可用O。2～O．5mg／mlPEG2000作为稳定剂。在4～lO℃ 熬存数胃有效，苓客溶冻。贮存孛霹熬会发垒翟褒不露瓣凝 聚，可离心除去。 5 免疫胶体金技术在兽医检验中的应用 5．1病原微生物的检测 5．1。1病毒的检溅：差长美等用免疫胶体金试验诊断发病 率蹇、死亡抉、疑缎鑫l垄蘩熬痣毒感凝熬鹅痣弼，缝莱隽禽 漉感阴性，根据晒床症状帮病变谤滗、免疫胶俸金试验以及 瘸毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽I型副黏病毒病，实现了 对禽I型副黏病毒瘸的快速鉴别诊断。程安春等应用锻加 强胶体金探针检测提纯的鸡减蛋练含镊病毒(EDSV)抗原的 焱低捡出量隽0。11719≯gfml，竣戴法捡涮了人王感染熬50 潮鹋采集懿襻零，辩卵巢、辕臻管蛱郄、疆喉部、较壳臻魏疆 饿率均为100％。粪便阳性率为92％。王泽霖等采用胶体金 标记纯化的羊抗鼠IgG，建立了一种对鸡传染性支气管炎病 毒进行检测的银加强金标免疫技术(sliverenhancedcoUoidal goldassay，SECG_A)，SECGA检测抗蹶《惩IBV早期梭测，具 凌器待弄往、快逮、敏感、篱便、绩暴耱翔定。朱璜炎莓溪免 痰胶体金试纸膜进行快速检测传染性法氏囊病毒(Infec— tiousbursaldiseasevirus，IBDV)的研究，试验结果能够识别不 间的IBDV毒株，包括强毒和弱毒，为IBDV的检测开辟了一 万方数据 《上海畜牧兽医通讯》2009年第6期 条新的、快速的途径。郑呜等用胶体金标记抗原，运用双抗 原夹心法于国内首先建立了猪瘟病毒抗体检测免疫层析试 纸条。认为该方法操作简单、灵敏度高、特异性好，能区分强 弱毒感染，适合猪瘟的临床诊断。徐葛林等采用柠檬酸三钠 还原法制备胶体金颗粒标记抗狂犬病病毒单抗，结果表明， 该诊断试纸条只与狂犬病病毒抗原有特异性反应，与乙型脑 炎病毒、正常小鼠脑组织等均无交叉反应。该诊断试纸条与 酶联免疫法(ELISA)试剂盒比较检测了48份可疑狂犬病犬 唾液样品，两种方法的符合率为88．2％，认为该诊断试纸条 非常适用于野外对动物脑或唾液中的狂犬病病毒抗原的检 测。王中力等采用柠檬酸三钠法制备胶体金颗粒，标记纯化 的犬细小病毒(Canineparvovirus，CPv)单克隆抗体，在玻璃 纤维紊膜上喷加纯化的犬细小病毒多克隆抗体，制成诊断 CPV抗原的快速诊断试纸条，并应用研制的CPV试纸条对 收集到的120份犬粪便样品进行检测，其结果与血凝试验结 果相比较，血凝效价在1：40以上，试纸条均能检测为阳性。 该试纸条与犬瘟热病毒及犬传染性肝炎病毒无交叉反应，且 试纸条保存6个月后，其检测结果重复性为10096。除此之 外，已经研制出的检测病毒的试纸条还有新城疫、口蹄疫等。 5．1．2细菌的检测：首次将免疫胶体金标记技术用于细菌 检测是Kalvatchev等，他们利用胶体金标记的抗立克次体的 多克隆抗体、单克隆抗体对标本中的立克次体进行了检测。 已经建立的结核胶体金免疫层析检测方法灵敏度达2mg／L， 特异性好，无交叉反应，与ELISA法相比阳性符合率达 93．8％，试剂稳定性达6个月。王中民等建立了一种简便快 速的胶体金免疫层析法(GICA)用于检测沙门菌。将抗沙门 菌多抗用抗原吸收法封闭与其它肠道杆菌的交叉反应，标记 胶体金溶胶制成探针，采用多膜复合的方法制成免疫层析 条。结果表明：该层析条灵敏度为2．1x10cfu／ml，不与大肠 杆菌(24株)、志贺氏菌(27株)、枸橼酸杆菌(2株)、变形杆菌 (6株)、耶尔森氏菌(8株)等其他肠道杆菌反应，而检测鼠伤 寒沙门菌(13株)、猪霍乱沙门菌(13株)和肠炎沙门菌(5 株)，均得阳性结果。37℃放置33d，检测结果无差异。该法 制备的免疫层析条检测灵敏度为2．1×10cfu／ml，在沙门菌 食物中毒菌量范围内。如预先经过一些简单的浓集处理(如 离心、膜过滤等)，能进一步提高细菌的浓度。闫中强等建立 了1种炭疽杆菌芽孢的快速检测方法。利用胶体金免疫层 析技术，采用双抗体夹心法检测炭疽芽孢杆菌，检测灵敏性 为1x10du／ml，该法能在20rain内完成检测。检测炭疽芽 孢杆菌同属的腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、 苏云金芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌结果阴性。在面粉、淀粉、奶 粉、脱脂奶粉、胰蛋白粉、琼脂等材料中掺人炭疽疫苗株芽孢 模拟“白色粉末”，均为阳性反应，检测底线仍为1x10 du／ml。环境样品的检测敏感性也相同。李恪梅等用布鲁菌 纯蛋白衍化物作为该检测板的包被抗原，建立了用胶体金标 记抗原，利用间接法检测人和不同动物血液样品中的抗布鲁 菌抗体的新方法。2006年王鹏等对研制的鼠疫单抗胶体金 标记试纸条进行了评价，结果表明，该试纸条不仅特异性高 达100％，出结果快(在15rain内出结果)，而且具有高敏感 性即能够检测浓度为0．5ng／ml粗制F1抗原，最小检出菌 量为lO万个。最近，研制的快速诊断大肠杆菌0157株的胶 体金试纸条，不仅敏感性高，可检测范围为1×105cfu／ml，特 异性好，与其他24种肠道菌(包括除0157外的大肠杆菌属、 ·79· 沙门氏菌属、耶尔森氏菌属等)不发生交叉反应。除此之外， 该试纸条还能检测出诸如奶粉、面粉、咖啡、点心以及蔬菜．。 水果等诸多样品中的0157大肠杆菌。此外，还有报道称研制 出结核杆菌、幽门螺杆菌等的胶体金快速检测。 5．1．3寄生虫的检测：吴锦雅等用抗sip38的单克隆抗体建 立血吸虫感染的金标试纸条对实验感染小鼠体内血吸虫抗 原rsjp38进行了检测，结果显示，尽管在整个实验过程中．血 清抗体检测为阴性，但是对小鼠体内抗原进行实时动态检测 后发现，随着感染时间的延长，检出率逐渐增高。2004年，李 学伍等“采用免疫金标技术成功研制出旋毛虫病快速检测试 纸条，结果显示该试纸条具有良好的特异性，不与猪肺线虫、 猪囊尾坳、猪细颈囊尾蚴、猪米氏住肉孢子虫、猪蛔虫发生交 叉反应，其敏感性与ELISA相当，与ELISA及消化法的检测 结果符合率为100％，5rain内肉眼观察获得结果。2005年， 司进等对胶体染料试纸条法检测弓形虫病IgM抗体进行研 究，通过采用DDIA和进口试剂盒对弓形虫病流行病学调查 时收集的84份血清样本的检测，结果显示弓形虫病IgG抗 体快速检测胶体染料试纸条法与进口试剂盒进行相比，总体 符合率为97．6％。表明该法具有较高的弓形虫病诊断价值。 6结语 目前，兽医临床上许多病的检测方法仍较多地局限于传 统的血清学方法，检测时限长，增菌培养需24h，分离培养需 24h，初步报告需48h以上，实际操作中，需要3d以上才能 出报告，难以适应病原快速诊断的发展要求。近年来，免疫 胶体金技术以其特异性强、敏感性高、简便快速、无需特殊仪 器设备和试剂等优点。在兽医检验研究方面发挥着越来越 重要的作用，随着胶体金新的标记物和制备方法的发展，免 疫胶体金技术将会有更为广阔的应用前景。 参考文献 [1)王东男．张松乐．免疫胶体金技术在快速诊断中的应用【J)．中国 卫生检验杂志，2003，(6)：391～392． 【2]邵军军．常惠芸．胶体金免疫层析试纸条在病原体检测及医学诊 断中的应用[J]．实用诊断与治疗．2008．(1)：39～40．‘ 【3]方莹．免疫胶体金技术及其在微生物检测中的应用[J]．中国卫生 检验杂志．2006．(11)：1399～1401． ’ [4]司进．朱荫昌。徐明．快速胶体染料试纸条法检测弓形虫病IgM 抗体的研究【J)．中国血吸虫病防治杂志，2005。(2)：93～96． C53陆应麟．免疫胶体金探针技术研究进展(J]．解放军军医情报， 1989。(5)：257～258． (6】王东勇，张松乐．免疫胶体金技术在快速诊断中的应用(J)．中国 卫生检验杂志。2003，(6)：391～392． 【7]李晓华．胶体金标记技术及应用[J]．生物学通报。2004。(12)：54 ～55． 【8)詹曦菁，泰晓勇．标记技术在免疫检测中的应用与发展[J】．现代 中西医结合杂志，2001。(12)：2422--2423． [9]蔺俐仲，徐春志，靳朝．免疫胶体金技术及其在兽医临床上的应用 (J]．动物医学进展，2007，(2)：106～109． (10]王长美．陈昌海．徐正军，等．鹅禽I型副粘病毒病的快速鉴别诊 断[J]．畜牧与兽医，2005，37(6)：29～30． 【11)王爱华，王玉殊，孙继国，等．胶体金快速诊断方法对鸡减蛋综合 征病毒的检测[J]．中国兽医科技，1995。35(11)：856～858． (12]程安舂。汪铭书．廖德惠，等．银加强胶体金检测鸡减蛋综合症病 毒的研究[J]．中国兽医杂志，1997，23(7)：9～11． [13)王中力，宋晓晖．陈西召。等．犬细小病毒病免疫胶体金诊断技术 的研究[J]．中国预防兽医学报．2004．26(1)：62—66． [14]徐葛林．胡巧玲，吴杰，等．检测狂犬病毒的胶体金免疫层析法的 建立及应用CJ]．中国人兽共患病杂志，2004。20(3)：236--237． [15]王中民，李君文．王新为．胶体金免疫层析法快速检测沙门菌 (J]．微生物学免疫学进展。2004，32(4)：36～38． 万方数据