链霉素胶体金快速检测试纸条的研制

一29一 圆硪日 中国动物检疫2008年第25卷第5期 文章编号：1005-944X(2008)05-0029-03 链霉素胶体金快速检测试纸条的研制 何方洋 万字平宰木丁双阳1)冯才伟赵正苗吴小平 马孝斌 (北京望尔生物技术有限公司 100094) 摘 要：本研究建立了一种基于免疫胶体金技术的链霉素快速检测方法。该方法检测灵敏度10ng·ml一1(10 ppb)，蜂蜜样本检出限是40ng·ml～(40ppb)，单个样本检测时间为5—10min。所研制试纸条产品检测变异系数小，批 间、批内检测结果重复性良好，可以应用于蜂蜜样本中链霉素的快速检测和现场筛查，具有较高的市场应用前景。 关键词：链霉素；快速检测；胶体金试纸条 ResearchandDevelopmentofImmunochromatographicColloidGoldStrips forRapidDetectionofStreptomycin(Strep) Abstract：ArapidmethodfordetectionofstreptomycinWaSdevelopedbasedOilimmunochromatography technology，whichhasasensitivityoflOng·ml‘1(100pb)andaLODof40ng·ml一(40ppb)inhoneysampletimecost persinglesamplewiththestripis5—10min．Thepreparedcolloidgoldstripshadtheadvantagesofsmallinter— batchandintra-batch，C．V．andfinereproducibility，anditcanbeappliedforrapidscreeningofStreptomycin residueinhoneysamples． Keywords：Streptomycin；rapiddetection；colloidgoldstrip． 链霉素(Streptomycin．Strep)作为 一种抗生素在治疗家畜感染性疾病 中发挥着重要作用．但其耐药性强。 毒副作用较大．如果动物性食品中有 过量的链霉素残留．则可能对人造成 严重危害．如听力减退。胎儿畸形。肾 中毒等【1】。国际食品法典委员会、欧 盟、日本和我国都对其残留限量要 求。链霉素残留目前的检测方法[21主 要有仪器检测法．如高效液相色谱 (HPLC)法，荧光检测法，比色法，薄 层色谱法和质谱法等：微生物学检测 法如杯碟法，棉拭法。纸片法。Trc 法．电泳生物检测法和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 渗透法 等：免疫学检测法如基于链霉素特异 性单克隆抗体或多克隆抗体的 ELISA检测方法13】和光学免疫传感器 14l等。其中ELISA检测方法检测灵敏 度高．耗时少．可以用于复杂组分中 的痕量检测．目前市场上已有此类检 测试剂盒圈。 免疫胶体金技术作为一种免疫 学检测方法是将特异性的抗原或抗 体以条带状固定在硝基纤维膜上。胶 体金标记抗体吸附在结合垫上．当待 1)农业部国家善药安全评价中心，北京海淀 10D094 ★基金项目：北京市2006年科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 重大项 目(I)07050201170702) “通讯作者 检样本加到试纸条一端的样本垫上 后．通过毛细作用向前移动．溶解结 合垫上的胶体金标记试剂后相互反 应．再移动至固定的抗原或抗体的区 域时．待检物与金标记抗体的结合物 又与之发生特异性结合而被截留．聚 集在检测带上．可通过肉眼观察到显 色结果。具有体积小、携带方便、不需 要仪器设备、操作简单、可现场检测、 3。10min出结果及结果可由肉眼根 据T线颜色深浅判断等诸多优点．非 常适合对大批量样品进行现场初筛． 在兽药残留快速检测中颇受关注[61。 本研究在建立了链霉素的免疫胶体 金试纸条检测方法的基础上．对其技 术参数和检测指标进行了评定．并初 步应用于实际样本检测中。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1主要实验仪器恒温电磁搅 拌器(国华电器)。Biodot喷膜机(基因 公司)，切条机(上海韩感电子科技)， 电热恒温培养箱(天津中环)，其余为 实验室常规仪器。． 1．1．2主要试剂和材料氯金酸．柠 檬酸三钠等化学试剂购自北京化学 试剂公司；链霉素。双氢链霉素。硫酸 链霉素及各种交叉反应药物为常规 标准品：牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋 白(OVA)购自sigma公司：所用各药 物包被原由本单位制备。 1．13实验动物及细胞株Balb／c小 鼠f国家兽药安全评价中心实验动物 房馈赠)。分泌链霉素特异性抗体细 胞株为本单位制备保存。 1．2免疫胶体金检测方法建立 1．2．1链霉素单克隆抗体的制备及 检测 冻存的杂交瘤细胞株复苏后 进行克隆化培养．接种5只6。8周龄 Ba]b／e小鼠．收集腹水．纯化后进行倍 比稀释。测定效价：同时测定抗体对 链霉素类药物如硫酸链霉素、双氢链 霉素及其他抗生素如庆大霉素、卡那 霉素、新霉素、紫苏霉素等的交叉反 应率。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明该抗体只对链霉素、 硫酸链霉素、双氢链霉素均能产生反 应．可以应用于链霉素药物残留检 测。 1．2．2胶体金制备采用柠檬酸三 钠还原法制备胶体金161。具体操作是 取0．01％氯金酸水溶液100m1．用恒温 电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌． 并加入l％柠檬酸三钠水溶液3．5m1． 继续搅拌加热10min．至溶液呈透亮 的红色。室温冷却，用去离子水恢复 到原体积，4℃保存。冷却后的胶体金． 溶液进行紫外扫描．计算胶体金颗粒 粒径．结果为12．74nln，透射电镜复‘ 核结果为13．0：t-O．5nm．与紫外扫描鉴 定法测定结果接近。 万方数据 中国动物检疫2008年第25卷第5期 @帑研曲 一30— 1．23胶体金标记抗体蛋白用分 光光度计测定法确定稳定胶体金最 适抗体蛋白用量为每lml胶体金溶 液中添加36¨g抗体蛋白。按照此用 量进行金标抗体制备。具体操作是： 用0．1mol·L—K2CO，或0．1mol·L-I HCI调节胶体金溶液的pH值为9．0。 将10ml胶体金溶液加入50“烧杯 中，电磁搅拌器250rpm搅拌．逐滴加 入lml含0．36mg抗体蛋白的蛋白溶 液；逐滴加入3ml5％BSA．持续搅拌 10min：超速离心进行纯化。最后用 2％BSA的0．01mol·L-1PB(含0．02％ NaN，)将沉淀混悬为原体积的l／ 40．4℃保存。 将羊抗鼠二抗点样于NC膜上． 直接与金标Strep单抗反应，可见有 明显的粉红色斑点．表明金标抗体有 活性。 1．2．4包被抗原合成与筛选将三 种用不同方法合成的包被抗原分别稀 释到0．5mg·ml-I。再分别作1．5、1：10、 1．'20、1：40、1：80、1：160、1：320稀释。在 NC膜上点样．37℃温箱中干燥后．直接 浸泡于金标抗体溶液中．观察不同抗 原点样点的显色情况．最终选择包被 抗原C应用于试纸条的组装。 1．2．5抗原包被液筛选分别用A、 B、C、D、E五种不同配方的包被液将包 被抗原作1：20，1：40，1：80，1：160，1．320 稀释，在NC膜上点样．37℃反应20min 后烘干．用封闭液封闭．滴加3倍稀释 的纯化后金标抗体．反应8min后．洗 涤液洗涤，观察显色情况。其中包被液 A在1：160稀释后．NC膜上点样着色 仍然很深．而其他包被液在l：160稀释 后．颜色很淡或不显色．故选择包被液 A作为实际用包被稀释液． 用包被液A将包被抗原作1： 20，l：40，1：80。1：160。1：320稀释。在 NC膜上点样后分别37℃(20min)烘 干和室温(20～250C)(30min)自然干 燥，其他条件不变．观察显色情况。 37℃(20min)烘干和室温(20。25℃) (30min)自然干燥的显色结果差异不 显著。为缩短试验过程．包被条件选 择37℃(20min)烘干。 包被抗原点样干燥后．分别用 A、B、C、D四种不同配方的封闭液进 行封闭。其他条件不变．观察点样点 和NC膜的显色情况。封闭液A封闭 后得到的斑点颜色很深．作为背景的 NC膜呈白色．同斑点颜色反差非常 大，即封闭液A封闭效果良好．能将 NC膜上的一些结合位点进行封闭． 使金标抗体不在NC膜上结合停留． 除抗原点样处为红色．NC膜其他位 置都为白色。封闭液B、C、D封闭后 得到的斑点颜色也很深．但NC膜上 呈深浅不一的粉红色．降低了斑点同 背景的反差。据此采用封闭液A用于 后续实验。 包被抗原点样后．用封闭液A以 不同的封闭时间10rain、20min、30 min、40min、50min分别在室温(20． 250C)、370C条件下进行封闭．其它条 件不变，观察显色情况。抗原点样后。 37℃条件下封闭10min显色较浅．2肌 50min均能得到着色较深、背景较浅 的斑点；(20～25℃)条件下封闭10min 显色较浅．20。50min均能得到着色较 深、背景较浅的斑点。为缩短试验时 间．简化操作流程．选择的封闭条件为 室温(20。25℃)封闭20min。 1．2．6金标抗体稀释液筛选20ml 标记好的金标抗体经超速离心纯化 后得到150Ixl浓缩金标抗体．分别用 金标抗体稀释液A、B、C、D、E作5倍 稀释后，滴加到经点样、封闭后的NC 膜上．观察显色情况。结果是经稀释 液B稀释后的金标抗体滴加到NC 膜上得到的斑点颜色最深．最清晰。 20ml标记好的金标抗体经超速 离心纯化后得到150¨l浓缩金标抗 体．用金标抗体稀释液B分别作3 倍、4倍、5倍、6倍、7倍稀释后，滴加 到经点样、封闭后的NC膜上．观察显 色情况。确定金标抗体作5倍稀释为 最佳稀释倍数。 1．2．7试纸条组装材料选择针对 NC膜．金标垫等选取不同型号材料 进行组合筛选．并最终选取Glass C600作为结合释放垫．CB—SB06作 为样品垫．CottonLintels300作为吸 收垫。 1．2．8金标抗体喷涂量选择按每 1cm2玻璃纤维素膜(GlassC600)喷 涂25“l、35仙l和50“l金标抗体，将 稀释后的金标抗体滴加到玻璃纤维 素膜上．干燥后分别组装试纸条。将 阴性蜂蜜样本40ng·ml一、60ng·ml一、 80ng．ml--的蜂蜜样本分别作4倍稀 释．用组装好的试纸条进行测试。结 果表明．金标抗体喷涂量为25td·cm-2 时，检测4倍稀释的40ng·ml一蜂蜜 样本结果为阳性灵敏度过高．出现了 假阳性现象．而金标抗体喷涂量为 50“卜cm-2时，检测4倍稀释的60ng· ml一的蜂蜜样本．结果为阴性，即试纸 条NC膜上能看到检测线．试纸条灵 敏度降低。多次重复试验后。确定采 用35斗卜cm-2作为GlassC600上金标 抗体的喷涂量。 1．2．9 NC膜上抗原包被浓度的选择 将包被抗原溶液稀释到0．03mg·ml一、 0．06mg·ml-I、0．09mg·ml-I、0．12mg·ml-1。 分别在NC膜上划线．干燥后分别滴 加100ld经4倍稀释后的阴性蜂蜜 样本和40ng·ml一、60rig·ml一、80ng· ml-l的蜂蜜样本。结果表明．当包被抗 原包被浓度为0．03mg·ml-I时．检测 线中包被的抗原量过少．滴加4倍稀 释的阴性样本后．随样本溶液迁移到 检测线位置的金标抗体同包被抗原 结合后．滞留在检测线位置的胶体金 颗粒数量过少．不足以达到肉眼可见 程度．即检测线位置没有肉眼可见的 红色线条出现．因而出现假阳性现 象。同理．当包被抗原浓度为0．09mg· ml一．和0．12mg·ml。1时．检测灵敏度降 低．无法满足检测需求。故包被抗原 的包被浓度选择为0．06mg·ml一。 1．2．10试纸条的组装试纸条组装 按照常规检测试纸条组装模式进161。 1．2．1l结果判定每次用试纸条进 行测试均需设对照试纸条。用移液枪 在普通酶标板小孔中滴加1013l山水 或100lxl处理后的ELISA检测为阴 性的蜂蜜组织样本．插入试纸条．使 样品垫一侧浸入样本溶液中。 将待测蜂蜜样本处理后．取 100山加入酶标板小孔，插入试纸条。 通过样本试纸条和对照试纸条检测 线的显色情况比较来判断待测样本 的阴阳性。如样本试纸条的检测线和 对照试纸条的检测线颜色深浅基本 一致或略浅．结果判断为阴性：如果 样本试纸条检测线没有出现或检测 线颜色明显浅于对照试纸条检测线． 结果判断为阳性． 1．3试纸条检测指标的确定 1．3．1试纸条检测限的确定本实 验中试纸条检测限的确定是采用测 定Strep标准品和添加了Strep的蜂 蜜样本。蜂蜜样本须做如下处理：称 取19阴性蜂蜜于离心管中，加蒸馏 水4ml充分溶解．取上清检测。 将Strep工作液作系列稀释： 1000ng·m14。500ng·ml-'。100ng·mP。50 ng·ml一1，lOng·ml一1，5ng·ml一1，lng·ml一1， 同时设阴性对照．分别用试纸条进行 测试．3个批次．两个重复试验。 将Strep工作液作系列稀释： 17ng·ml一，16ng·ml一，15ng‘ml一，14ng。 ml～，13ng·ml～，12ng·ml-1，1lng·ml～， 万方数据 一31一 @钧礤曲 中国动物检疫2008年第25卷第5期 lOng·ml一．9ng·ml一。8ng·ml～。同时设 阴性对照．分别用试纸条进行测试。3 个批次．两个重复试验。 不同批次．不同重复试验的结果 基本一致(如表1和2)。由表可知。该 试纸条检测含量在lOng·mlq以上的 Strep标准品时．结果都为阳性，检测 9ng·ml-1的Strep标准品时．无法明 确判断检测结果阴阳性．只能观测到 样本试纸条检测线比对照试纸条检 测线颜色浅。但差异不十分明显。固 多次重复后，将试纸条检测S讹p标 准品的检测限定为lOng·ml。1 (10ppb)。 素膜上金标抗体的释放程度。4℃和 室温条件下的保存试验持续3个月． 37℃条件下保存试验持续7天。最后 确定试纸条的保存条件是两条一组 置于铝箔袋中抽真空、加干燥剂室温 密闭保存。 1．3．5实际样本检测从市场采集 300份蜂蜜样本，每种称取19于离心 管中．加蒸馏水4mL充分溶解，取上 清液检测。先用本实验自制试纸条进 行初筛．然后用ELISA检测试剂盒进 行复核。试纸条检测结果表明300份 蜂蜜样本中262份为阴性．其余38 份为阳性：试纸条检测结果和ELISA 表1试纸条检测限的确定：测Strep标准品(1000～1 STREP(ng·m11)阴性样本 1000 500 100 50 10 5 1 结果翔定 表2试纸条检测限的确定：测Strep标准品(10～1ng·ml41) STKEP(ng-ml一1)阴性样本17 i6 15 14 13 12 11 10 9 8 结果判定 一 + + + + + + + + +／一 一 1．3．2交叉反应实验在空白蜂蜜 中分别添加2000ng·ml～．200ng·ml～． 40ng·ml-t的链霉素类药物如链霉素、 硫酸链霉素和双氢链霉素．其他药物 如庆大霉素、卡那霉素、新霉素、紫苏 霉素、妥部布霉素和丁胺卡那霉素 等，同时设阴性对照。将所有的样本 用水作4倍稀释后．用试纸条进行检 测。每个浓度，每份样本作2次重复。 结果表明。添加浓度为2000ng．ml～、 200ng·ml一、40ng·ml_时．4倍稀释后 试纸条对链霉素类药物的检测结果 都为阳性．其它药物添加检测呈阴 性．表明本实验研制的链霉素试纸条 对链霉素的交叉反应率为100％。 1．3．3重复性实验从3个批次的 试纸条中分别随机抽取6条试纸条． 用于测4倍稀释的阴性蜂蜜样本． 10ng·ml。1的Strep标准品．40ng·mlo 添加浓度的蜂蜜样本．每个样本作2 次重复。结果表明。从3个批次的试 纸条中随机抽取的试纸条对4倍稀 释阴性蜂蜜样本、lOng·ml—Strep标 准品、40ng／g添加浓度蜂蜜样本检测 结果一致．说明不同批次间试纸条重 复性较好。 1．3．4保存试验将制作好的试纸 条两条一组置于铝箔袋中．加干燥剂 密闭包装，分别置于4℃、37℃、室温 (20—25℃)条件下，其中置于4℃和室 温条件的试纸条每隔7天取出两组． 置于37℃每天取出两组．分别检测阴 性样本和40ng·ml一1阳性样本。观察 检测线的有无．颜色深浅及玻璃纤维 检测结果阳性样本符合率为100％。 阴性样本符合率约为93％以上。 2结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2．1方法建立过程分析本检测方 法及检测产品建立的基础是链霉素 特异性单克隆抗体．该抗体对链霉 素、双氢链霉素和硫酸链霉素有较大 交叉反应．而对于其他抗生素类药物 如庆大霉素．卡那霉素、新霉素等没 有明显交叉反应．检测范围覆盖了目 前市场上常见链霉素应用形式。具有 较高的应用价值。 在检测方法建立过程中．采用多 种包被原、包被液、封闭液和金标抗 体稀释液通过组合筛选．建立了最佳 组合．提高了检测的灵敏度和确证程 度。同时胶体金试纸条的各组分均经 不同型号的材料进行筛选组合．从实 用易用的角度出发．做出最佳优化。 2．2检测指标的评定本实验所制 备的胶体金快速检测试纸条经添加 Strep标准品测定，蜂蜜样本的检测 限定为40ng．ml一(40ppb)：同时交叉 反应实验显示．本试纸条产品对于链 霉素类药物交叉反应率为100％．而 对于其他抗生素类药物如庆大霉素． 卡那霉素、新霉素等没有明显交叉反 应：重复性实验表明不同批次间样本 检测结果一致．重复性良好；保存试 验通过不同温度不同保存条件最终 确定合适的保存条件为置于铝箔袋 中抽真空、加干燥剂室温密闭保存。 2．3实际样本检测结果通过对 300份蜂蜜样本进行检测．并用 ELISA试剂盒进行复核．试纸条检测 结果和ELISA检测结果阳性样本符 合率为100％．阴性样本符合率约为 93％以上。 3结语链霉素作为抗生素．其残 留通过食物链严重危害人体健康．各 国都对其残留做出限量要求。本研究 所研制的基于链霉素特异性单克隆 抗体的免疫胶体金试纸条作为一种 新型检测产品．不需任何复杂设备和 样本前处理．蜂蜜样本经过简单倍比 稀释后就可以进行检测。单个样本检 测仅需5～10min分钟．提高了检测效 率．适合于大规模的现场筛查。 参考文献 『11左晓磊，赵志辉，付旭东，等．牛奶 中链霉素的竞争酶标检测方法fJl，中 国乳业．2006，(2)：56。57． f21杨智洪，杜根成，乔宏兴，等．链霉 素残留检测方法的研究进展『J1，上海 畜牧兽医通讯，2005。(5)：2～4． 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