环境荷尔蒙类物质2，4-二氯酚人工抗原的合成与表征

第28卷第 9期 余宇燕等：环境荷尔蒙类物质 2，4．二氯酚人工抗原的合成与表征 535 l试剂介绍} “ ⋯ ～ ， 1 { t'‘，⋯ ，⋯ -．口·， 化学试剂，2006，28(9)，535～537 环境荷尔蒙类物质2。4．二氯酚人工抗原的 合成与表征 余宇燕，唐舒雅，庄惠生 (东华大学 环境科学与工程学院，上海 200051) 摘要：以环境荷尔蒙类物质 2，4．二氯酚、对氨基苯甲酸等为起始原料，经重氮化反应合成了2，4．二氯酚半抗原。再经过 混合酸酐法与载体蛋白 BSA，成功合成了 2，4．二氯酚人工抗原，为其免疫分析方法的建立提供了条件。产物经红外光 谱、紫外光谱和核磁共振鉴定分析确定。 关键词 ：2，4-二氯苯酚；半抗原；人工抗原 ；合成；鉴定 中图分类号：0629．7 文献标识码：A 文章编号：0258．3283(2006)09．0535．03 2，4．二氯酚(2，4．DCP)是水生生态系统中大 量存在的氯代苯酚类化合物，属于环境激素类物 质⋯。2，4-二氯酚的重要用途是通过有机合成生 产二氯苯氧酸及其酯类除草剂，如农药除草醚 2， 4．二氯苯氧乙酸(2，4．D)和 2，4．二氯苯氧乙酸丁 酯；还用于生产杀虫剂如酚线磷等；在医药上用于 生产硫双二氯苯酚；此外还用于生产防霉剂 TCS。 2，4-二氯酚主要通过农业生产活动进入环境水生 生态系统。研究表明，它是一种具有雌性激素活 性的物质 ，能干扰生物体正常的激素分泌，从而影 响生殖功能，故属于环境荷尔蒙物质及优先污染 控制物质。 目前，对 2，4．二氯酚的研究报道多关于生物 或化学降解 ]，其主要分析方法为分光光度法、 流动注射法、电泳法和色谱法等 ]。免疫分析 方法具有特异性强、灵敏度高、经济简便及适于现 场快速检测的特点，已广泛应用于对环境中微量 物质的检测分析 J，但对 2，4-二氯酚的免疫分析 方法国内外少有报道。本研究以2，4．二氯酚为起 始原料，经过重氮化反应，合成了2，4-二氯酚半抗 原；然后经与 Ⅳ．羟基二环己基碳二亚胺反应后再 与牛血清白蛋白偶联 ，成功合成 2，4-二氯酚人工 抗原，为建立免疫分析法检测环境中 2，4-二氯酚 的残留提供了可靠的免疫原。 1 实验部分 1．1 主要仪器与试剂 TU．1900双光束紫外可见分光光度计 (北京 普析通用仪器有限责任公司)；Nexus．670傅里叶 红外．拉曼光谱仪(美国 Nicolet公司)；AV 400核 磁共振仪(德国 Bruker公司)；TGL．16G型高速台 式离心机(上海安亭科学仪器厂)；PHS．3C型精密 pH计(上海精密科学仪器有限公司)。 2，4-二氯酚(AR，盐城汇龙化工有限公司)；对 氨基苯甲酸(AR，上海化学试剂公司)；N，N ．二 甲基甲酰胺(DMF；CP，浙江平湖化工试剂厂)；N． 羟基琥珀酰亚胺(NHS；AR，上海化学试剂公司)； 二环己基碳二亚胺(DCC；AR，Chemika公司)；牛血 清白蛋 白(BSA；华美生物制品公司)；亚硝酸钠 (CP，上海化学试剂公司)；浓盐酸(CP，上海化学 试剂公司)。 1．2 合成路线 由于2，4-二氯酚是小分子物质，只具有免疫 反应性而不具有免疫原性，不能直接刺激动物产 生特异性的抗体，必须偶联一个相对分子质量大 的载体，使之具有良好的免疫原性。欲与蛋白质 偶联，要求分子中必需含有氨基或羧基，才能与蛋 白质中的含羧基或氨基的肽键结合，形成氯酚．蛋 白质偶联物。所以合成人工抗原的第一步需先改 造小分子氯苯酚的结构，使其成为含有能与蛋白 质偶联的基团的半抗原。为了合成免疫分析中的 人工抗原，首先采用重氮化反应在 2，4-二氯酚分 子中引入羧基，再采用活化酯法与载体蛋白质偶 收稿日期：2006．02．14 基金项目：国家自然科学基金(20277005)资助项 目。 作者简介：余宇燕(1973．)，女，博士生，讲师，主要研究方向 为环境监测及环境化学。 维普资讯 http://www.cqvip.com 536 化 学 试 剂 2OO6正 联合成人工抗原，具体路线如下： HOOC— N +NaNo2+HCI = HOOC— N+cr C1 ⋯ o ～ 4℃ ⋯ ＼ ： 一 一 c· 咖 H ⋯ 0 一 cl 0H + Ho一 ． N— N c00H a 0 旦 c1．--~ N O — H N 0 A I．3 实验方法 I．3．I 重氮化反应合成2，4-二氯酚半抗原 0．75 g(5．5 mmo1)对氨基苯甲酸溶于 5 mL 5％氢氧化钠，冷却后冰浴下滴入 0．4 g亚硝酸钠 (溶于 3 mL水)，磁力搅拌下加入 I．5 mL浓 HC1 (溶 于 5 mL水)，保持反应温度 0～4℃反应 30 min(至KI．淀粉试纸变蓝，加尿素少许中止反 应)。 将 1 g(6 mmo1)2，4．二氯酚溶于 2 mL 10％ NaOH，逐滴加入上述重氮化溶液，反应 20 min。 静置过夜，得黄褐色块状固体。用 1：1水及乙醇 重结晶，干燥得棕红色粉末状物质 2，4-二氯酚．半 抗原即2，4-二氯．6．(4．羧基苯基偶氮)苯酚，产率 84％。经测定，其相对分子质量为 311，熔点为 128℃。 1．3．2 活化酯法合成 2，4-二氯酚人工抗原 称取 62．2 mg(0．2 mmo1)半抗原 2，4．二氯．6． (4．羧基苯基偶氮)苯酚，置于洁净干燥的小锥形 瓶中，加入 200血 DMF使之溶解。称取 34．2 mg DCC与 19．4 mg NHS溶于 300 DMF，在磁力搅 拌下逐滴加到小锥形瓶中，室温搅拌反应 8 h， 4℃过夜。将反应后产物置于低温高速离心机 9 000 r／min，经 15 min分离出上清液。称取 80 mg BSA溶于6 mL 0．05 mol／L pH 9．6碳酸盐缓冲溶 液中，逐滴加入 300血 上述清液，于4℃反应4 h。 反应毕，将溶液装入透析袋，用蒸馏水透析2 d， 0．9％生理盐水透析3 d，离心分出上清液，即得2， 4．二氯酚．BSA。偶联物经紫外可见分光光度计扫 描鉴定后加等量甘油分装于 1 mL离心管中4℃ 下保存。 2 结果与分析 2．1 2，4-二氯酚半抗原的结构分析 取上述通过重氮化法合成的具有 2，4-二氯酚 全部化学结构且具有间隔臂和活性基团的半抗原 与 2，4-二氯酚少许，用溴化钾压片红外光谱扫描 (如 图 1)。半 抗原 的 IR(KBr)，v，cm～：3 430 (O—H)；2 660～2 530(O—H)；1 693(C— O)； 1 603(N— N)；1 499(C—N)；1 417(cn2)；1 223 (c—O)；865(C=CH)。经过与 2，4．二氯酚的红 外谱图比较，半抗原的红外光谱图中有明显的羰 基(C—O)吸收峰，并且有 c—N和 N—N键的吸 收峰。 渡效／era- 图 1 2，4一二氯酚与半抗原的红外光谱图 Cl Cl ／ ／ 1． cl 一0H ．2． cl OCH2c00H 将半抗原用氚代吡啶溶解，用核磁共振仪测 定样 品的核磁共振谱 (如 图 2)。 HNMR(400 MHz，Pyr)， ：8．71(d，1H，Pyr)；8．39～8．41(s，2H， A广 H)；7．83～7．85(s，2H，A广 H)；7．80(s，H， A广 H)；7．68(s，H，Ar H)；7．19(d，1H，Pyr)。与 半抗原的结构相符合。 ppm 9 8．5 8 |．5 | 图 2 2，4一二氯酚半抗原的核磁共振谱图 光谱鉴定的结果显示在 2，4-二氯酚的分子结 构中引入了羧基，可与蛋白质偶联合成人工抗原。 2．2 2，4-二氯酚人工抗原的鉴定 采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体 蛋白及偶联物进行扫描，根据吸收峰确定偶联是 否成功。结果见图3。 由紫外光谱图可知，半抗原 2，4-二氯．6．(4．羧 基苯基偶氮)苯酚在248和348 nm处有特征吸收 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 28卷第 9期 余宇燕等：环境荷尔蒙类物质 2，4．二氯酚人工抗原的合成与表征 537 图 3 半抗原 、人 工抗 原和 BSA的紫外光 谱图 1．Hapten；2．DCP—BSA；3．BSA 峰，蛋白质 BSA在 280 am处有最大吸收峰，而偶 联物 DCP．BSA特征吸收峰为 338 am。偶联物的 吸收峰与蛋白质、半抗原比较都发生了位移，偶联 物具备有半抗原和蛋白质的吸收特征，说明人工 抗原的合成是成功的。 常用的鉴定人工抗原结合比的方法是紫外光 谱法l9j。按常规来说，只要人工抗原的紫外光谱 图与原蛋白载体和半抗原的紫外光谱相比发生了 变化，即可间接说明人工抗原合成成功。根据朗 伯．比尔定律，波长一定时混合物的紫外吸收具有 加合性。采用全波长紫外分光光度计对半抗原、 载体蛋白及偶联物进行扫描，根据 280 am吸收峰 可确定偶联是否成功。结合比 计算公式 六西格玛计算公式下载结构力学静力计算公式下载重复性计算公式下载六西格玛计算公式下载年假计算公式 如下[1。。： 结合比 ： ： ￡半 抗原 (DD偶联物一DD蛋白质)× 半抗原×肼置白质， 、 DD半抗原 × 朋 半抗原 × 蛋白质 8o“ ， 其中：DD为吸光值；M为相对分子质量；C为浓度(mg／mL) 通过计算得合成的人工抗原结合比为 19：1， 适宜进行动物的免疫。 参考文献： l1jHOUSE W A，LEACH D，LONG J L A，et a1．Micro-organic 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