五氯硝基苯残留酶联免疫吸附分析研究

中国农业大学 硕士学位论文 五氯硝基苯残留酶联免疫吸附分析研究 姓名：邵晓龙 申请学位级别：硕士 专业：生态学 指导教师：李季;王保民 20040601 摘要 本文通过合成具有五氯硝基苯分子结构特征的半抗原。采用活性酯法将半抗原与牛血清白蛋 白(BSA)或卵清蛋白(OVA)进行偶联，分别制各了免疫原和包被抗原。免疫原免疫新西兰大 耳白兔，获得五氯硝基苯的抗血清，ELISA法测的其效价为1：1．2×lO。，用多克隆抗体建立了 五氯硝基苯的间接ELISA法。间接ELISA法五氯硝基苯的抑制中浓度ICm为76．7ng／mU，五氯 硝基苯的检测限(IC。o)为4．7ng／mL。多克隆抗体与其结构类似物的交叉反应为五氯酚：3．23％， 六氯苯：12．22％，2，4-D：<2％， 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的线形范围为10—2000ng／mL。研究了间接ELISA法的 影响因素(pH值、离子强度、有机溶剂)：pH值为中性的情况对ELISA的影响很小，5％的乙腈 对ELISA基本上没有影响。初步建立了水样(井水、河水)和土壤样品中五氯硝基苯问接ELISA 法的提取方法，回收率分别是86．7％、81．3％和78．996。对实际样品进行了检测，并与气相色谱 进行比较，二者检测结果无显著性差异。如果进一步研究开发试剂盒，可适用于现场大量样品的 快速检测。 关键j司：五氯硝基苯，多克隆抗体，酶联免疫吸附分析 Abstract Thespecifcpolyclonalantibodias(PcAbs)forpentachlomnitrohenzenewereproducedinthisstudy． Thehaptenkeepingthemoleculestructureofpentachloronitrobenzenewassynthesizedandthe structurewasidentified．ThentheNHSesterificationwasemployedtoconjugatehaptentolargecarrier protein—BSAorovA．immunoganandcoatingconjugatehavebeensynthesized．Theimmunogenwas injectedintoNewZealandwhiterabbits．anti-∞rumhadbeenobtained．Thetiterofantiserawas1：1．2× 10。determinedbyindirectELISA．ForindirectELISA，thelC50ofpentachloronitrobenzeneis76．7 ng／mLandthedetectionlimit(1et0)is4．7ng／mL．ThecrossreaetivitiesofPcAbswith pentachlorophenol，hexaehlorobenzeneand2,4-Dare3．23％，12．22％and电％respectively．The influenceofionicstrength，pH，organicsolventonindirectELISAweretestedinthispaper．The extractionofwatersamples(well，lake)，soilsamplesonindirectELIsAforpentachloronitrobenzenewere established，therecoverieswere86．7％，81．3％and78．9％，respectively．Theresultfromtheanalysisof soiIsamplesbyELISAwassimilarwithbvGC．IftheELlSAtestkitforpentachloronitrobenzeneis developed．itwillbeusedtoscl℃enlargehumherofsamplesonthespot． Keywords：pentachloronitrobenzene，Polyelonalantibody,ELISA Il 独创性声明 矿 一659375 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： zo口4年占月2，J日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：舜i琉尤 时间：∥。了年卵2／日 导师签名：／旁务 时间：砸。严年钿垆 、也荔p abll 霹D 中国农业大学硕士学位论文 第一章弓I占 1．1研究意义 1．1．1农药施用状况 第一章 引言 我国是一个农业大国，同样也是农用化学品生产和使用大国。目前我国各种 常规农药制剂产量每年达80—100万吨，居世界第二位。我国与欧美等发达国家相 比，在农药的合理使用上存在较大的差距。使用的农药仍以杀虫剂为主，占总用 量的68％，其中有机磷杀虫剂占整个杀虫剂用量的70％以上；杀菌剂和除草剂占 总用量的18．7％和12．5％。 从自然农业到现代农业．农药发挥了巨大的作用。据权威人士估计，在世界范 围内，如不施用农药．由于病、虫、草害，粮食的总产量将减少l／3。使用农药所带 来的收益大体上为农药费用的4倍。由于使用农药，我国每年挽回的粮食损失占总 产量7％左右。以我国一年粮食总产量4500亿公斤算，其中15亿公斤的产量是使 用了农药挽回的损失⋯。但是，在我国农药施用过程中普遍存在以下几个问题：(1) 高毒农药使用比重偏高：(2)同一剂型的农药，既用于粮食等大田作物，也用于 蔬菜、水果、中药材等经济作物：(3)农药施用技术落后，喷药机械还有相当部 分是老式的手动喷雾器，“跑、冒、漏”现象严重：(4)虽然制定了《农药安全合 理使用标准》等一系列技术 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 ，但贯彻执行不力，农户凭感觉随意加大使用量。 这些问题不同程度地导致了我国目前较为严重的农产品农药残留污染问题。 1．1．2农产品中的农药残留污染 九十年代以前我国农药残留污染主要为有机氯农药，1983年开始禁用六六六、 DDT以后，农产品中有机氯农药残留污染的情况得到了一定程度的控制。但是随着 有机氯农药的替代产品有机磷农药的广泛使用，农产品中的有机磷类农药残留问 题日益严重起来。我国每年发生农药中毒事故几万起，据卫生部劳动与卫生职业病 研究所1992—1996年对26个省、市、自治区的不完全统计，农药中毒243749例， 死亡24612倒，其中生产性中毒不足1／4。农业部2000年底对我国14个经济较发 达的省会城市21lO个样品检测，蔬菜中农药超标为31．1％，其中尤以有机磷农药 残留最为突出。在每年上报的食物中毒死亡者中有相当一部分是由于使用了国家 明令禁止生产和使用的甲胺磷、双氟磷、氟乙酰胺、毒鼠强等农药残留引起的。 2001年国家质量监督检验检疫总局公布第三季度蔬菜农药残留的抽样检查结果显 示．23个大中城市大型蔬菜批发市场的菜花、番茄等十余类181种蔬菜中，有86 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 种蔬菜农药残留量超过国家标准限量值，超标率为47．5％，其中的有机磷农药残留 量超标最为严重。前些年由于甲胺磷污染所致的“大陆输港毒菜”事件现在虽然 有所缓解，但有机磷农药污染蔬菜而造成大陆居民中毒事件仍不断发生；如2001 年6月13日发生在广东省中山市的78人食物中毒就是食用了含有大量有机磷农 药残留的通心菜引起的。每年我国因农药中毒的人数占世界同类事故中毒人数的 50％。 随着我国加入WTO以后．对农业的要求已从数量型向质量型转变，社会对农 产品和畜产品的安全生产和质量控制也提出了越来越高的要求。我国出口的农副 产品由于农药残留超标，屡屡发生被拒收、扣留、退货、索赔、撤消 合同 劳动合同范本免费下载装修合同范本免费下载租赁合同免费下载房屋买卖合同下载劳务合同范本下载 等事件。 如茶叶中菊酯类农药超标，蜂蜜中的氯霉素超标，人参中五氯硝基苯超标等等。 1999年8月至2000年1月，我国共有634批出口食品，因不符合美国政府的技术 法规，遭到美国食品和药物管理局(FAD)扣留，给我国造成了重大损失。 1．2农药残留的快速检测方法 人类食用被农药污染的农产品后，残留在其中的农药会储存在人体，而且排泄 缓慢，最终造成人类急性或慢性中毒。农药对人类的毒性危害除表现在影响人类 生理活性酶的功能外，还对其他系统构成潜在危害，甚至会减低机体的免疫功能， 表现有“三致”作用(致癌、致畸、致突变)。因此农药残留检测越来越受到世界 的重视。许多国家特别是发达国家在农药残留检测方面投入了大量资金和人力， 不断提高检测技术。并制定了严格的法规。例如美国，农药残留监控工作由环保 局(EPA)、食品与药品管理局(FDA)、农业部(USDA)三个部门负责，在长期的 实践和研究工作中，建立了一套完整的农药残留监控法律法规和监测体系，有效 的保证了农药检测的有效性和准确性”j。 传统的农药残留分析主要是气相色谱、高效液相色谱、质谱等理化分析方法”’ “。这些分析技术检测灵敏度高、操作标准、规范。但是，在应用这些方法进行农 药残留物分析时受到检测对象的影响。需要进行复杂的分离、提取、净化、衍生 化等前处理过程以消除样品中的干扰成分，使得分析速度慢、成本高，而且在前 处理过程中需要使用大量的有机溶剂又造成了对环境的污染。并且对实验仪器要 求很高，加上本身技术的缺陷，难以适应大量复杂样品和现场快速检测的要求。 随着科学技术发展和研究的深入，大量快速、现代化的农药残留检测方法不断出 现。这些新的快速方法一般都具备检测时间短、操作相对简单等特点，正好弥补 了传统检测方法的不足，起到了很好的补充作用。 农药残留现场测定法(简称速测法)于80年代发展起来，测定原理概括起来主 要是有化学法、生物法、酶抑制法和免疫分析法。80年代初美国Karanth等人利 用化学显色试纸测定蔬菜中有机氯、六六六和DDT农药残留．检测限分别是0．3ppm 和0．5ppm，其它有机氯农药的检测限大于05ppm”’。有机磷农药速测灵法(金 2 中周农业大学硕士学位论文 第一章 引言 属离子催化显色表面皿法)原理是利用具有催化作用的金属离子催化剂使各类有 机磷农药在催化作用下水解为磷酸与醇，水解产物与显色剂反应，从而使显色剂 褪色，主要针对的是有机磷农药。化学法虽然简便，但是它的局限性在丁．准确度 低，只能用于一类农药的定性检测，已经不适应农药残留检测的要求标准。 生物法主要是利用农药敏感生物(动物、植物、微生物)作为指示剂来对农药 进行检测的技术。袁东星等人建立了一种发光细菌快速检测蔬菜中有机磷农药的 方法，但在检测中农药浓度与细菌发光强度的相关性不呈严格的线性关系，只能 用来进行半定量检测“1。生物检测法由于测定时间长，测定结果的准确性受指示生 物和环境等影响很大，且该法只对少数农药有反应，无法分辨残留农药的种类，因 而在使用中受到限制。 近年来应用较为广泛的农药残留速测法是胆碱酯酶抑制法，主要用于有机磷和 氨基甲酸酯类农药的残留检测。1985年美国研制出一种酶片检测水中有机磷和氨 基甲酸酯农药，其灵敏度在0．1一lOmg／L⋯：李治祥等人在80年代末对酶抑制法进 行了研究，并研制出农药残留速测箱．可以检测8种以上的有机磷和氨基甲酸酯 类农药”1。此外，酶抑制法还有酶试纸速测卡，农药残毒快速检测仪，胆碱酯酶生 物传感器等。近年来还发展了植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分析方法，钟树明 等人应用植物水解酶抑制技术快速检测水样中有机磷和氨基甲酸酯类农药，对常 用的几种有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测限在0．015-0．33mg／L”’。酶抑制法的 缺点是酶大多来源于动物或植物。材料昂贵，从不同材料中获取的酶的敏感程度 和稳定程度不一样．且保存困难：检测极限低。一般只能达到ppm级，只能检测 一类农药，无法具体分析特定一种农药。 从上世纪八十年代免疫学检测农药残留方法取得了长足的发展，是目前国际 上最有应用前景的速测法。其中，酶联免疫吸附分析法(Enzyme—linked Immunoadsorbentassay。ELISA)是晟常用的一种。它应用免疫化学中抗原与抗体 之间高度特异性的配合反应，使不同的农药残留物及其代谢产物与相应的抗体进 行特异性反应，反应的结果通过标记酶显色反映出来。由于每种抗体都高度专一 和敏感于特定的农药．因此这种反应具有很高的特异性、灵敏度和准确度。目 前，ELISA技术在医学、兽医学、畜牧学、植物学和环境等领域内已得到应用。 1．3农药残留免疫分析技术的研究 1．3．1农药残留免疫分析的研究意义 免疫分析方法样品准备简便，水样可直接测定，检测时间短，检测极限一般在 ppb级，与常规仪器方法相比快捷、方便，而且更重要的是与气相液相色谱法测定 结果具有显著的相关性。与其它的快速检测方法相比，它准确度高，稳定性强， 能够定性定量，而且能够具体到单一的农药检测，因此它已成为目前农药残留快 速检测的最好方法。它的推广应用．可以从根本上解决农药残留分析在室外大批 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 IIIIII 量快速、准确、连续测定的实际问题。该研究对促进我国农业可持续发展、保护 生态环境、保障人们身心健康、扩大农产品出口等具有重大而深远的意义。 1。3．2免疫分析检测技术 免疫分析检测技术是二十世纪六十年代发展起来的新技术。它主要包括放射免 疫技术、酶免疫分析技术、荧光免疫分析技术等，现己广泛地应用于各个领域中。 在这些检测技术中其核心反应都是抗原抗体反应。机体抵制外源性物质的侵入和 自我修复机制存在与无脊椎动物门的各种生物上，这些机制都属于天然免疫。只 有在脊椎动物身上才能找到能区分外源性抗原并具有特异性防御的机制””。脊椎 动物在受到进入体内异源大分子物质刺激的时候能产生保护性应答反应(即免疫 反应)，生成特异性的保护物质(免疫球蛋白一一即抗体)来识别该异源物质(即 抗原或免疫原)并与之结合。从而“钝化”该物质以排除其干扰乱。抗原与抗体 的结合反应是高度特异性的，主要由于抗原与抗体分子主体构型相互吻合且所带 电荷相对，立即发生相互吸引和结合，这种互相吸引和结合是依靠下列各种分子 间作用力所促成：静电作用力、范德华力、氢键和疏水作用等。抗体一一抗原结 合反应不仅可以在体内进行，也可在体外进行，符合质量作用定律，这就是免疫 分析的原理。所谓抗原是指一切具有抗原性的物质；抗体(又称免疫球蛋白)是 指抗原刺激机体而产生的特异性球蛋白。抗原(完全抗原)具有两个方面的特性： 免疫原性和反应原性。免疫原性是指能够刺激机体产生抗体或诱导机体产生免疫 应答反应的特性，反应原性是指能够与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生反 应的特性。完全抗原是分子量大于IOKD的大分子物质，如蛋白质等。只有反应原 性而没有免疫原性的抗原则称为半抗原，它通常是小分子物质，分子量通常小于 4KD，必须与其它大分子物质结合后才具有免疫原性。大多数农药属于这类物质， 具有反应原性不具有免疫原性，因此农药残留的免疫分析方法的建立：首先要把 农药与载体蛋白连接，形成农药一载体蛋白偶联物，再免疫动物制备抗体。 1．3．3农药抗体的制备 农药是小分子物质，不具有免疫原性。因此在制备抗体前首先要合成农药一载 体蛋白偶联物作为免疫原。由于各种农药的分子结构不一样，所采用的偶联方法 也不一样。一些农药可作为半抗原直接与载体蛋白偶联，但大多数农药不宜作为 免疫半抗原，如结构中不具有可直接与载体蛋白共价连接的基团，或这些基团对 维系农药分子的免疫特性和特征结构很重要，或直接与载体蛋白偶联后半抗原的 特征结构易受载体局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别 等。所以经常要根据分析目的和免疫学理论 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 农药分子的半抗原。农药免疫半 抗原的设计与合成是建立小分子免疫分析法的关键步骤。 农药免疫半抗原设计的基本原则是免疫半抗原与载体蛋白偶联后，在能最大程 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章 引言 度保持和突出待测物的结构特征，特别是立体构型。农药半抗原一般由以下几部 分组成：目标农药分子的特征结构、用于连接特征结构和载体蛋白的间接分子和 末端的活性基团(间接臂)。 间接臂应远离目标农药分子的特征结构部分和功能团，它一般应为非极性分 子，除活性基团外不含有其它高免活性的结构，如苯环、杂环、杂原子、羟基等， 以降低抗体对间接臂的识别，所以问接臂一般为饱和链烃。间接臂上的活性基团 一般是氨基或羧基，这样可以用稳定的酰胺键将半抗原和载体蛋白偶联，常见的 间接臂是一(CH：)。一CooH、一(CHz)．。一NH2等，n一般是3～6。 使用载体蛋白不仅仅是简单地增加半抗原的分子量，更重要的是利用其强的免 疫原性诱导免疫应答和将半抗原通过载体蛋白的作用包被到固相载体上。可用作 载体的蛋白有各种动物的血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、纤 维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白等。比较常用的如牛血清白蛋白(BSA，分子量67， 000)、鸡卵清蛋白(OVA，分子量45，000)、人血清白蛋白(HAS，分子量60，000)、 钥孔喊血蓝蛋白(KLH，分子量360，000)。其中BSA免疫原性高、溶解性好、价 廉易得，易于合成各种结合抗原，因此使用比较多：KLH对大多数动物是一种强免 疫原，但是它的溶解性差，通常仅用于制各免疫原；OVA大多用来作为包被原使用。 对免疫动物的要求必须保证与免疫原不同源。许多动物．如家兔、豚鼠、山羊 和小鼠等均能产生高亲和力的抗体。由于免疫测定只需要很少的抗体(1ml抗血清 足以供数千次免疫测定使用)，因此从抗血清量、饲养和操作等方面考虑，家兔是 较合适的选择，一只家兔可采集大约lOOml全皿，能分离30～40ml血清。 使用适当的佐剂可以提高动物机体对免疫刺激的应答能力。种类很多，作用机 制十分复杂，最常用的是弗氏佐剂。弗氏佐剂是一种含有稳定剂(包括乳化剂) 的矿物油，能与免疫原形成稳定的油包水乳剂起到增强免疫原性、延长抗原作用 时间和保护抗原不被破坏的作用。弗氏佐剂分为完全佐剂和不完全佐剂两种，分 别用于不同的免疫阶段。 免疫原、免疫动物和佐剂等准备好后便可进行免疫。动物免疫的部位包括背部 皮下、脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉及耳静脉等，多点注射、多部位配合免疫 所得抗体效价高。第一次免疫使用完全佐剂，此后每隔两周要进行加强免疫，佐 剂换用不完全佐剂。在加强免疫10天左右于兔耳缘静脉采少量血，分离血清检查 抗体效价，待达到要求后兔颈动脉采全血，收集抗血清一20oC保存备用。 1．3．4多克隆抗体和单克隆抗体 通过直接免疫动物，然后从血清中分离得到的抗体称为多克隆抗体 (polyclonalantibody)。多克隆抗体是动物血液中多个B淋巴细胞增殖分化形 成浆细胞并持续分泌的具有不同选择性和亲和力抗体，它针对各种不同的抗原决 定簇。 由一个B淋巴细胞分化形成的浆细胞通过克隆选择只分泌针对抗原的某一决 5 中圉农业大学硕士学位论文 第一章引言 定簇有特异性免疫反应的抗体，称为单克隆抗体。1975年Kohler和Milstein最 先利用、淋巴细胞杂交瘤技术获得了单克隆抗体⋯1，后在各国研究者的共同努力r， 已发展成了一套完善的技术，可以连续不断地生产特异性和亲和力均保持恒定的 单克隆抗体。与制备多克隆抗体相比．制各单克隆抗体时对免疫原的纯度要求没 有那么严格，而且免疫原的用量也很少，但对免疫动物的选择要求比较严格。 从被免疫的动物血清中获得的多克隆抗体虽然用于免疫分析提高了特异性，但 缺点是抗体不均一，来源是间断的，有较大的批间差异。单克隆抗体克服了多克 隆抗体的这些缺点，具有很多优点。如高度特异性强，均一性，产量高，可连续 大量生产，有利于实现标准化等，但是制各单克隆抗体需要昂贵的仪器设备，操 作技术比较复杂。生产成本较高。现将单克隆抗体与多克隆抗体的比较结果列于 表1—1。 表1—1单克隆抗体与多克隆抗体的特性比较 1．3．5农药残留免疫检测技术的应用 1960年，Yalow和Berson第一次应用免疫分析技术检测血清中的胰岛素“⋯。 随后，免疫分析技术迅速发展起来．但主要集中在生物化学、临床医学等领域。 1967年，Centeno和Johnson首次报道制备出兔抗DDT和马拉硫磷抗体⋯’。它的 报道标志着免疫检测技术开始应用于农药分析中。最初，大多数学者研究农药免 6 中同农业大学硕士学位论文 第一章引苦 疫分析技术的目的只是用于临床医学检测农药中毒病人血清、尿祥和组织中的农 药残留水平。 1971年．Ercegovich首先提出了将免疫化学方法应用到环境领域，他建议用 免疫学方法快速筛选农药残留”“。在初始阶段，研究者将注意力集中在了农药的 放射免疫法(RIA)中，他们做了大量的工作。Rinder和Fleeker应用竞争性RIA 检测水中的2，4一D和2．4，5一T的含量，两者的检测限分别是0．1ng／mL和1ng／mL， 回收率分别是90％和94％““。Ereegovich等用RIA法检测血清和蔬菜提取物中的对 硫磷，检测晟低浓度为0．1～0．2ppm⋯1。在七十年代，免疫学技术取得了快速的发 展。1972年。VanWeemen和Engavall等人建立了酶免疫测定方法(enzyme immunoassay，EIA)““。1975年，Kohler和Milstein利用杂交瘤技术制备出单克 隆抗体(McAB)”“。但是由于各方面条件的限制，这两项技术在农药残留检测领 域中的研究应用未引起足够的重视。进入80年代，EIA开始应用到农药的检测中， 1982年Huner“”和Wie“”分别报道了对硫磷和除虫脲的EIA法检测。 1989年，美国环境保护局(EPA)、农业部食品安全检验司(FSIS—USDA)和AOAC 共同制定了农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则。免疫分析得 到了大多数科学团体和执法机构的认可。相继有数十种农药残留的免疫分析技术 建立起来，杀虫剂类有DOT、硫丹、对硫磷、杀螟松、毒死埤、西维因、呋喃丹、 毗虫啉等”。”1，杀菌剂类有苯菌灵、多菌灵、百菌清、异菌脲、甲霜灵、三唑酮、 克菌丹等[as-as]，除草剂类有甲草胺、敌草隆、灭草隆、利谷隆、氯黄隆、2，4一D、 2，4，5-T、杀革强、百草枯、毒草定、阿特拉津、西玛津、扑灭津等””“1。在1990 年之前，仅有少量的农药免疫分析商业试剂盒问世。目前，国外至少有几十种农 药商业免疫试剂盒问世，包括有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、硫代氨基甲 酸酯类、拟除虫菊类等”“”1。 我国从九十年代初开始进行农药免疫检测分析的研究，大多集中于ELISA。 1992年，农业部环保科研所刘长武等人首先报道研究了对硫磷的抗体““，近十年 来陆续有农药残留检测的文献报道出来。中国农业大学单国民、钱传范等人根据 三氮苯类除草剂的结构特征，合成了三种不同的抗原，制备了三种高效价抗体， 建立了检测莠去津、西玛津、扑草净残留的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法““。 邓安平、Franekgilan应用阿特拉津半抗原衍生物共价交联于载体蛋白上，免疫 得到高质量的阿特拉律抗体，建立了阿特拉滓竞争酶联免疫吸附法，测定线性范 围为0．05～5ug／L““。中国预防医学科学院王刚垛制备了对氧磷单克隆抗体““1。华 西医科大学余万俊等人制备出杀虫脒单克隆抗体，建立了间接竞争、直接竞争和 标记抗原竞争3种ELISA法，样品加标回收率为90％4116％，检测限为0．5ng／g”“。 2001年南京农业大学董健、刘贤进、韩召军建立了氟虫腈(锐劲特)间接ELISA法， 检测限为0．2ug／L”“。扬州大学刘曙照、冯人剃等人采用固相抗体直接竞争ELISA 法测定小白菜和苹果中的甲萘威残留量，测定结果与高效液相色谱法测定结果基 本一致”“。浙江大学朱国念、程敬丽等在多克隆抗体的基础上研制了一种适用于 检测水样、土样和蔬菜样品中克百威残留的直接竞争酶联免疫吸附测定法(ELTSA) 7 中圃农业大学硕士学位论文 第一章亏f言 试剂盒””。 1．4免疫测定新技术 1．4．1流动注射免疫分析 自上个世纪90年代中期出现了一种新的免疫分析法一流动注射免疫分析法 (flowinjectionimmunoassay，F11A)。FIIA可以看作是流动注射分析(FIA)””与免 疫分析的联用技术用免疫反应替代了传统流动注射分析中的化学反应体系，属非 平衡态分析方式。能进行均相或非均相测定。均相FIIA不涉及分离步骤．虽然操 作简单但由于样品中杂质对测定的干扰较严重，故均相FIIA的应用受到一定限制。 非均相FIIA的操作过程为：待测试剂、标记抗原(抗体)及其它反应试剂注入到 由蠕动泵驱动的免疫反应缓冲液中并被带进免疫反应池中，来结合的标记物及其 它杂质随流动缓冲液流出反应池。根据示踪标记物的不同再加入相应的反应试剂， 发出的信号再由对应的检测器检出。非均相FIIA中．能作为固相载体的物质很多， 如葡聚糖、琼脂糖、可控多孔玻璃微球等。制备固相抗原(抗体)的方法是先用 活化剂使载体表面带上活性集团，然后以共价键方式与抗原(抗体)结合。将固 相抗原(抗体)装填于一个体积很小的流通池内，免疫反应在池内进行。FIIA综 合了两者的特点且可以计算机控制缓冲液的流速、自动进样、检测器的检测及数 据处理，大大缩短了测定时间，节约免疫试剂，并且方便自动化。在农药及其代 谢产物含量的测定方面有良好的发展前景“⋯。 1。4．2免疫传感器 免疫传感器(immunscnsors)是生物传感器的一种，它的出现不仅缩小了分析时 阅，提高了灵敏度，降低了检测下限，雨且简化了分析过程，易于实现自动化和 设备小型化提高了便携性“”。免疫传感器的原理是利用抗体对相应的抗原有识别 和结台双重功能将抗体或抗原固定化制成识别元件，然后与适当的信号转换器相 结合而成的装置。由于蛋白质分子(抗原和抗体)携带有大量电荷、发色基因等。 当抗体和抗原结合时会产生电学、化学、光学等变化，通过适当的传感器可检测 这些参数，从而构成不同的免疫传感器””。 1．4．3脂质体免疫分析 脂质体免疫分析法(1iposomeimmnoassay．LIA)是一种较新的免疫测定技术。 脂质体是一种生物模拟膜，它是由磷脂分子或其他类脂分子在水相中自发形成的 一种密闭的双分子单层或多层囊泡。这种生物模拟膜在形成过程中能包裹水及其 8 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 中的溶质(染料或酶)，具有很高的信号放大作用，且脂质体表面还可以连接抗原 或抗体分子，膜表面抗原．抗体复合物可激活补体，从而导致脂质体的溶解，释放 出的标记物量与膜表面的抗原抗体复合物的量成正比，据此建立了脂质体免疫分 析法【5⋯。 1．4．4克隆酶供体免疫分析 克隆酶供体免疫分析(clonedenzymedonorimmunossay，CEDIA)是一种新型 均相免疫测定技术。CEDIA中使用由重组DNA技术获得的B一半乳糖苷酶两个独立的 蛋白质片段，这两个片段独立存在时无酶活性，但两个片段结合时则显示催化活 性，以此作为分析方法的基础。较小的一个片段被称为酶供体片段(enzymedonor， ED)，另一个片段约占酶氨基酸序列的97％，称为酶受体片段(enzymeacceptor。 EA)。目标分析物的ED标记物与抗体结合后不再与EA形成酶，所以当样品中待测 物增加时则游离ED标记物增多，使反应液中酶产生增加，经底物显色后测定“⋯。 1．4．5免疫亲和层析 免疫亲和层(immunoaffinitychromatography)【60t6。1的基本原理是：将抗体固 定于合适的基质上．利用抗体与抗原反应的可逆性、抗体的特异性来达到分离和 纯化抗原的目的。免疫亲和层析可用于从样品中提取目标分析物，然后与色谱相 连进行分析，这样使得仪器分析的前处理简单，便于从复杂样品中提取、净化和 富集目标分析物，提高检测灵敏度。 1．5研究对象及主要工作 五氯硝基苯(PCNB)是取代苯类杀菌剂性质与六六六(HCH)、滴滴涕(DDT) 相似，无内吸性，具有性质稳定、毒性大、致癌和高残留等特点，对丝核菌有特 效，当土壤中含10ug／mg浓度时，丝核菌即被一直，对甘蓝根肿病菌、白绢病菌、 放线菌也有效。1930年五氯硝基苯被用来代替水银杀虫剂的农药引入到农业生产 中。现主要用作拌种剂和土壤消毒剂，用于防治棉花苗期病害、麦类黑穗病以及 蔬菜和果木的多种病害。在中草药的栽培过程中使用量很大，尤其是作为防治人 参病害的药剂在国内外广泛使用。 五氯硝基苯在土壤中的残留量很大，在植物体内也可以发现残留1621。五氯硝 基苯的急性毒性很轻微[63,641，但有国外有研究表明五氯硝基苯有潜在致癌性[651。 五氯硝基苯主要损害心血管系统、中枢神经系统、肝、肾和造血系统[661。小tq鼠 急性中毒时，出现呼吸加快、发烧、颤抖、痉挛性抽搐、供给运动失调，甚至死 亡。慢性作用下，初期红细胞数和血红蛋白含量增加，随后抑制造血功能．衰竭、 抽搐，部分动物可致死。我国强制性国家标准规定在蔬菜和原粮中五氯硝基苯的 9 中国农业大学硕士学位论文 第一章引言 最高残留限量分别是0．2和0．1mg／kgl6”，欧盟于2001年1月开始禁用五氯硝基苯。 CI 2 CI 图卜1五氯硝基苯化学结构式(pentachIoronitrobenzene) 五氯硝基苯的化学结构式如图卜1，它的常规检测方法包括气相色谱、高效液 相色谱等。蔡文贵、孙成贺等人利用气相色谱法测定土壤中五氯硝基苯的残留量， 此法的平均回收率为98．6％，最低检测浓度为0．25ug／Kg”“。袁兰、陈秋丽等人建 立了毛细管气相色谱法同时测定人参中五氯硝基苯及四种六六六异构体的方法 ⋯1。王多加、周向阳采用HPLC法同时测定五氯硝基苯·多苗灵可湿性粉剂中2种 有效成分的含量⋯1。五氯硝基苯的ELISA检测方法国内外没有发现相关报道。 五氯硝基苯的危害己引起人们的重视，对它的残留检测已经提上了日程。但是， 常规检测方法需要昂贵的仪器、操作程序复杂、分析费用高，很难满足大批量样品的快 速检测。免疫检测技术很好的弥补了仪器检测方法的不足，适宜于作为大批量样品检测的初 筛工具。基于此．进行了五氯硝基苯多克隆抗体的制备及其免疫分析的研究，期待 建立五氯硝基苯的快速、灵敏、可靠的免疫检测方法。主要工作如F： 1．合成五氯硝基苯的半抗原，将它与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原； 2．制备五氯硝基苯的兔多克隆抗体： 3．建立五氯硝基苯的间接竞争ELISA法： 4．研究五氯硝基苯ELISA法的干扰因素； 5．应用已建立的ELISA法对水样和土壤样品进行五氯硝基苯添加回收实验，对实 际样品进行检测并与气相色谱法进行了比较。 10 中国农业入学硕士学位论文 第二章剌料与方法 2．1材料与试剂 第二章材料与方法 牛血清白蛋白(BSA) 卵清蛋白(0vA) 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 ． HRP标记羊抗兔酶标二抗 五氯硝基苯 五氯苯酚 3一溴丙酸 N一羟基琥珀酰亚胺(Nl{S) N，N‘_二环己基碳二亚胺(Dcc) 二甲基甲酰胺(DMF) 磷酸氢二钠(Na：HP仉) 磷酸二氢钠(Na也Pm) 丙三醇 无水硫酸钠 碳酸钾 碳酸钠 碳酸氢钠 Tween一20 邻苯二胺(OPD) 30％Hzoz 乙腈 丙酮 无水乙醇 氢氧化钾 六氯苯农药标样 新西兰大耳白兔 透析袋(最大允许透过分子最<6000) 96孔酶标扳 SIGMA公司(美国) SIGMA公司(美国) GIBC旷BRL公司(美国) GIBCO—BRL公司(美国) 军事医学科学院(1：i000) Aldrich公司(美国) 北京市昌平石鹰化工厂 上海化学试剂公司 SIGIlA公司(美国) SIGMA公司(美国) 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 广州天马精细化工厂 北京金龙化学试剂有限公司 北京化工厂 北京化学试剂公司 北京化工厂 北京化工厂 北京化学试剂公司 农业部环境保护科研所 北京海淀兴隆实验动物养殖厂 欣经科生物技术公司 天津有机玻璃厂 中国农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 ELISA测定所用试液： 包被缓冲液(0．85M、pH9．6的碳酸缓冲液)：Na2COaI．599，NaHCO。2．939，加蒸馏水至1000ml； 封闭液：1％明胶(用包被液配制)； 洗涤液(PBST)：含0．05％Tween一20的0．01MpH7．4的PBS(V／V)； 0．OIM磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCL8．Og，KH2PO·0．29，NazHPOt-12Hz02．969，加蒸馏水至1000ml 调节DH至7．4； 稀释液：含0．05％Tween-20，0．1％明胶的0．01}4pH7．4的PBS(V／V)； 底物缓冲液(pH5．0的磷酸一柠檬酸缓冲液)：0．2MNa：HP吼·12Hz0(28．49／L)25．7ml，0．1M柠檬酸 (19．29／L)24．3ml，加蒸馏水50ml： OPD底物使用液(0D*一)：OPD40mg，底物缓冲液lOOm]，30％的Hzoz20ul； 终止液：4衄zSO“ 2．2主要仪器设备 微量加样器 磁力搅拌器 DG3022A酶联免疫检测仪 紫外可见分光光度计4060 分光光度计722型 电热恒温水浴}I}I一8 Brukerdpx300型核磁共振仪 高速冷冻离心机Mikr022R 旋转蒸发仪ZQF85A 自动纯水蒸馏器SZ一93 FD一1冷冻干燥机 LD4—2A低速离心机 低温冰箱 医用三通管 HP5890气相色谱仪 分析天平(十万分之一) 旋涡混合器GL一88B 有机合成玻璃仪器标准磨口 玻璃注射器lml，2ml，5ml 12 Thermolabsystems芬兰 上海沪系分析仪器厂 华东电子管厂 PharmaciaLKBBiochrom瑞典 上海分析仪器厂 常州国华仪器厂 芬兰 德国 上海医械专机厂 上海亚荣生化仪器厂 北京博医康技术公司 北京医用离心机厂 日本Sanyo 欣经科生物技术公司 美国 湘仪天平仪器厂 江苏海门麒麟医用仪器厂 天津玻璃仪器厂 金坛市注射器厂 中国农业大学硕上学位论文 第二章材料与方法 2．3实验方法 2．3．1半抗原的合成 (1)合成路线 Cl C +Br-C14z-CH2-C(X)H C -CH2-CO：)H 图2-1半抗原合成的反应设计 (2)实验步骤 称取29五氯酚(pentachlorophen01，PCP)和19K2COa溶于30mL丙酮中，加入到 反应器中．在氮气的保护下，加入1．149溴丙酸，加温回流反应2个小时，再加入0．59 溴丙酸，保持以上条件不变反应过夜(反应生成的气体通入Na01t吸收瓶吸收)。减雎 蒸除有机溶剂，剩余物质用浓盐酸和二氯甲烷分开，弃掉无机相，有机相用无水Na。sO· 干燥，减压蒸除有机溶剂后，用硅胶柱层析净化即得到所需半抗原粗产品⋯1。收率50％。 2．3．2半抗原与载体蛋白的偶联 2．3．2．1活性酯法偶联半抗原与BSA (1)反应式 -CH2-COOH + !坠。 O． II -CH2-C—O— o 。臼骘 。臼。|l 卜 中国农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 (2)实验操作 称取18mg半抗原溶解到0．355ml的DMF中，使浓度达到150mM，在其中加入 7．315mgDCC和4．08mgNHS，使DCC和NHS的浓度达到lOOmM，在室温下搅拌反应5个 小时，反应液离心(5000rpm，lOmin)，弃取沉淀，上清液为活性酯。 称取IOmgBSA溶解到lⅢ1碳酸钠缓冲液中(0．05lll01·L，pit9．6)中，在4℃条 件搅拌下逐滴加入0．2ml活性酯液，滴加时缓慢，约2个小时加完。然后继续搅拌反 应过夜。反应液装入透析袋用PBS(0．01mol·L～，pH7．4)透析，每4小时换液一次， 共换液8次。透析后离心．弃取沉淀．上清液冷冻干燥，4℃保存。 2．3．2．2混合酸酐法偶联半抗原与OVA (1)反应式 O +c．30c 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 如下表： 表2—1免疫方案 2．3．5抗血清效价测定 从第3次免疫开始，每次免疫后lOd左右，兔耳边缘静脉采血。血液在422放置 4h后离心取血清，间接ELISA法测定血清效价。当抗血清达到所需的效价时，兔颈动 脉采全血，于室温静置2h，再置4"C冰箱过夜，次日以4000rpm离心10分钟，收集 血清。以半抗原-OVA作包被抗原间接ELISA法测定血清效价，步骤如下： (1)包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释至浓度为199／ml，在96孔酶标板中每孔 加入100ul／m1，37℃包被3h。 (2)洗板：每孔加入1509l洗液，放置lmin，再甩掉洗涤液，重复3次，将板内残留 洗涤液在吸水纸上甩干。 (3)封闭：加入封闭掖150ul，孔，在37℃条件下封闭l-5h，弃封闭掖，洗板。 (4)加抗血清：将抗血清用稀释液倍比稀释成不同的浓度，按浓度顺序加入酶标板 中，每孔1009l，同时以阴性血清作对照，每个浓度重复三次，在37℃温育0．5h，洗 板。 (5)加酶标二抗：将羊抗兔酶标二抗用稀释液配成1：1000的浓度，每孔加入1001d， 在37℃温育0．5h，洗板。 (6)显色：将新鲜配置的OPD底物使用液加入酶标板(每孔100u1)，37℃避光显色 中国农业大学硕士学位论文 第二章材科与方法 5mill。 (7)终止及测定：每孔加入501zl终止液，以对照孔调零，用酶标仪于492nm处波长 测定各孔的OD值。 效价定义为抗血清0D值等于对照孔OD值2倍时的稀释倍数。 2．3．6血液收集 五免后血清效价达到要求，在五免10d后采血。无菌状态下颈动脉采全血(采血 前一天动物禁食，只喂清水)。将血液在室温下静置2h，然后在4"C冰箱中过夜使之 充分收凝。次日以5000rpm冷冻离心10min，收集血清，零下20℃保存。 抗体的纯化 采用50％饱和硫酸铵沉淀法： 用生理盐水将血清稀释一倍，然后在搅拌条件下缓缓加入等量饱和硫酸铵(即50％ 饱和度)。此时，溶液中出现白色沉淀，于4℃冰箱中放置0．5—1h或过夜，以3000rpm 离心沉淀30min，上清液为清蛋白部分。弃去不要，沉淀物中加入原血清量2倍的生 理盐水．待充分溶解后，再加入半量的饱和硫酸铵(即33％饱和度)，进行第二次沉 淀，如此再重复二次。使沉淀物达到完全自色为止。沉淀物以原血清量1／5—1／10的生 理盐水溶解，置透析袋中透析去盐。 2．3．7间接竞争ELISA工作条件的筛选 间接竞争ELISA法操作步骤与间接非竞争ELISA法测定抗血清效价类似，只是加 入了不同浓度梯度的五氯硝基苯标准品或待测样品与等体积的抗体参与竞争反应。 最大浓度标准品孔调零，测定其它浓度孔的OD值定为B(0ng·mLl标准晶孔除 外)，将0ng·mL。标准品孔的0D值定为B0，以109it(B／Bo)值为纵坐标，相应的标 准品浓度的log值为横坐标，绘制logit—log标准曲线。根据标准曲线的回归方程求 五氯硝基苯抑制中浓度ICs。(B／Bo=50％)及最小检测限ICzo(B／Bo=80％)。 2．3．7．i包被抗原与抗体浓度的工作浓度的筛选 以半抗原一OVA偶联物作为包被抗原，固定酶标二抗的浓度，按方阵法筛选包被抗 原与抗体的晟佳工作浓度。包被抗原的浓度设置为1：1000、1：2000、1：3000、1： 4000、1：5000、1：6000、l：7000：抗体的浓度设置为1：1000、I：2000、1：3000、 1：4000、1：5000、1：60001：8000、1：10000；五氯硝基苯的浓度设置为2000ng·mL1。 2．3．7．2标准曲线的建立 根据上述实验确立的包被抗原、抗体的浓度和竞争时间。五氯硝基苯标准品的浓 度设置为：2000ng·mL一、500ng·mL1、100ng·mL、50ng·mL～、】0ng‘mL1、 0ng·mL～，以B／B。一109作图法绘制标准抑制曲线，并求曲线的ICso和Icto值。 2．3．7．3抗体的特异性 按优化的五氯硝基苯检测条件分别对五氯硝基苯的结构类似物五氯酚、六氯苯、 16 中国农业人学硕_上学位论文 第二章材料与方法 2，4-D、五氯酚乙酯、PCB、半抗原、甲酯化半抗原进行交叉反应实验。将上述标准 品按一定的浓度梯度稀释，建立它们的抑制标准曲线，并计算各自的Icso．按F列公 式计算交叉反应： 交叉反应(％)=ICs。(五氯硝基苯)／Ics。(类似物)×100％ 甲酯化半抗原的制备 (1)重氮甲烷的制备 在通风橱中放A、B两支试管，于A管中加入2m140％(w／v)氢氧化钾和5ml 乙醚，并置于水浴中，然后加入500mg亚硝基甲基脲(有毒，南京农业大学周老 师提供)，待上层乙醚相呈黄色，将含有重氯甲烷的乙醚转到试管B中，并在B中 放几粒氢氧化钾。吸水20分钟。 (2)半抗原的甲酯化 称适量的半抗原溶于甲醇中，加适量的重氮甲烷，见到气泡冒出，黄色消失， 再加入过量的重氮甲烷，黄色不消失，用0．2m01／L的乙酸中和过量的重氮甲烷。 氮气吹干有机溶剂，再用蒸馏水定容。 五氯酚乙酯的制各 称取29五氯酚溶解于40mlO．2m01／LKzCOa中，在加入4ml乙酸酐和lOml正己烷 进行反应，振荡3次(每次振荡2分钟，注意放气)后静置30分钟。有机相经无水 Na：S0。脱水后，旋转蒸发器蒸除有机溶剂即的粗产品。 2．3．7．4影响五氯硝基苯间接ELISA的因素 2．3．7，4．1离子强度的影响 离子强度对ELISA的影响通过不同稀释倍数的PBS(0．01M磷酸缓冲液，137mMNaCl) 来研究”“”1。配置10倍浓度的PBS，依次稀释为0、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、 6倍、7倍、8倍的PBS．制成稀释缓冲液．五氯硝基苯的浓度设置为2000ng·mL、 500ng·mL、100ng·mL1、50ng·mL、10ng·mL一、0ng·mL，间接竞争ELISA 法测定离子强度对标准曲线的影响。 2．3．7．4．2pit的影响 分别配制pH值为3、4、5、6、7、8、9的抗体稀释缓冲液，五氯硝基苯的浓度设 置同上，间接竞争ELISA测定不同的PH值对标准曲线的影响。 2．3．7．4．3有机溶剂的影响 在抗体稀释缓冲液中添加不同浓度的乙腈、丙酮，使这两种有机溶剂的浓度分别 是O％、5％、10％、15％、20％：五氯硝基苯的浓度设置同上。间接竞争ELISA测定不同 浓度的有机溶剂对标准曲线的影响。 2．3．8样品添加回收实验 (1)取井水、运河水，调节pH值，按500ng·mL1、100ng·mL、10ng·mL 1 添加五氯硝基苯，用建立的间接竞争ELISA法测定，同时设置未添加五氯硝基苯的样 品作为空白。 (2)采集没有污染的土壤，按200ng·mL“添加五氯硝基苯，用下面的方法进行 提取： 17 中国农业大学硕_L学位论文 第二章材料与方法 1．称取lOg土壤于三角瓶中．加入20ml蒸馏水，混匀。 2．加入20ml乙腈，超声5分钟。 3．在离心管中加入1角匙氯化钠，将液体倒入离心管中振荡。 4．取离心管中上清夜lOml于试管中，水浴氮吹干。 5．乙腈冲洗试管，定容0．25ml，再加入稀释缓冲液定容至5ml，待测定。 同时处理未添加五氯硝基苯的样品作为空白进行测定。 (3)取没有污染的人参样品，磨碎过80目筛，按200ng·mLl添加五氯硝基苯， 用下面的方法进行提取”“： 1．取4．Og人参样品于三角瓶中，用正己烷振荡提取三次，每次lOml，合并提取 液。 2．转入50m1分液漏斗中，用浓硫酸磺化净化提取液三次(每次硫酸用量为10ral)。 3．用水洗正己烷层两次，然后将正己烷层过无水硫酸钠脱水。 4．取lOml正己烷氨气吹千，乙腈定容0．25ml，再加入稀释缓冲液定容至5ml， 待测定。 同时处理未添加五氯硝基苯的样品作为空白进行测定。 2．3．9土壤样品的测定及ELIs^方法的验证 取施用过五氯硝基苯的土壤样品，分别用建立的ELISA方法和气相色谱