果实病原真菌拮抗菌株有效活性保藏试验研究

西 南 园 艺 SouthwestHorticulture 2006年1月 第34卷第1期:8～10,13 果实病原真菌拮抗菌株有效活性保藏试验研究 张迎君 曾顺德 武 峥 漆巨容 黄 健 (重庆市果树研究所,江津402260) 摘 要:运用 4种方法和 4个时间比较果实病原真菌拮抗菌株 B-298的保藏效果,研究保藏方法和保藏时间对该菌株 代谢产物活性的影响,寻求可随时提供具有原始特性的菌种用于生产交换使用或长期保藏菌株活性的保藏方法。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,转接法 70d保藏菌株存活能力最高;转接法、冻结法 110d生物活性最好;载体法 180d代谢产物比色透光度最 强,但拮抗性最差。 关键词:果实;病原真菌;拮抗菌株;代谢产物;保藏;活性 中图分类号:S476.1+S432.44 文献标识码:A 文章编号:1008-1488(2006)01-008-04 收稿日期:2005-10-09 StudyontheActivityofPreservedAntagonistofPathogensonFruits ZhangYingjun,ZengShunde,WuZheng,QiJurong,andHuangJian (ChongqingFruitReserchInstitute,Jiangjin,Chongqing402260China) Abstract:ThepreservationeffectsofantagonistB-298werecomparedbyfourmethodsatfourdifferentintervals.Itwas investigatedtheinfluenceofconversationmethodsandtimeonmetaboliteactivityofantagonistforfindingoutappropriateways ofstrainspreservationtokeeptheiroriginalcharacters.TheresultsshowedthesurvivalrateofstrainB-298wasthehighestafter 70dwhenpreservedwithslant-inoculation.Whenstrainspreservedintheformerwayordeepfrozenat-80℃after110d, antagonisticactivityexcelledtheother.However,thestrainmetabolitevolumeandantagonisticactivityofB-298preservedin sandmediumwasthelowestafter180d. Keywords:Fruit;Pathogen;Antagonist;Metabolite;Preservation;Activity 微生物菌种保藏是将菌株保藏在不利于微生物 活跃生长和代谢的不良环境中(干燥、低温、缺氧、黑 暗、营养饥饿等),使微生物代谢速率极为缓慢,处于 休眠状态,以达到保藏菌种不死亡、活性不衰老、特性 不变异、分类不紊乱等。当恢复所保藏菌种生长的正 常环境和营养条件,即可获得高生理活性菌株和优良 性状的培养代谢产物。要保持菌种生理特点和遗传 性能相对稳定,而不随继代发生改变,关键在于对菌 株的保藏手段。目前保藏菌株的方法比较多,并且不 同菌株有一定的保藏特性。低温、干燥和隔绝空气是 使微生物生命活动处于相对静止的休眠状态的 3个 重要因素。 本所在完成重庆市科委重点攻关项目 FABP中 新开发出拮抗菌株 B-298。我们采用相关技术对 FABP拮抗菌株进行各保藏方法的综合试验比较,通 过摇瓶连续培养,果实病原指示菌的CG生物检测, 初步确定适应该菌株的保藏方法。 1 材料与方法 1.1试材 拮抗菌株:B-298第21代18号诱变菌株。 指示菌:意大利青霉(Penicilliumitalicum,简称 PI),扩展青霉(Penicilliumexpensam,简称 PE),灰葡 萄孢 (Botrytiscinerea,简称 BC),根霉(Rhizopus stolonifer,简称RS)。 保藏介质:PDA斜面培养基;沙土(过 80目筛, 用吸铁吸去铁质,10%盐酸浸泡24h,自来水下冲洗 至pH中性,烘干,按每管 1.5g分装16支试管,湿热 灭菌,50℃下烘干);液体石蜡油(50mL装入 150mL 三角瓶,湿热灭菌,110℃下除去水分);甘油(50mL 分装150mL三角瓶,灭菌50min)。 1.2仪器 NUAIR超低温冰箱,LRH-250-A生化培养箱, HZQ-Q振荡器,721型分光光度仪,TGL-16G高速离 心机,高压灭菌锅等。 1.3 试验方法 1.3.1菌株保藏 (1)移植转代法:转接待藏菌株于34支新鲜斜 面,27℃培养箱中培养 3d,16支斜面菌株于 10℃ 保藏。 (2)沙土载体法:取4支培养好的斜面菌株,用每 支6mL无菌水分3次洗菌株细胞于小三角瓶,玻珠 8 振荡分散菌株细胞,用脱脂棉过滤于另一小三角瓶 中,备用。 按每支 1mL取高密度菌株细胞悬液分别于 16 支沙土管中,混匀,25℃下真空抽提干透,10℃保藏。 (3)液体石蜡法:将培养好的新鲜斜面菌株16支 分别加入液体石蜡油12mL,液面高出斜面培养基顶 部约1.5cm,用橡皮塞和固体石蜡封口,10℃保藏。 (4)超低冻结法:取斜面菌株4支,用24mL甘油 洗斜面上细胞于小三角瓶,混匀后用移液器按每支 1mL分别吸于16支冷冻指管,-85℃保藏。 每个处理4个重复。保藏时间分为 70d、110d、 180d、260d。 1.3.2存活能力测定 检测液制备:按保藏时间要求取出各处理,方法 (1)按保前制取菌悬液方法制取细胞悬液后取1mL 于 4mL无菌水中;方法(2)按每支 5mL加无菌水振 荡洗涤沙土;方法(3)用石蜡油洗匀菌细胞后取2mL 于 5mL无菌水中,混合均匀静止 1h后吸去上油层 2mL;方法(4)按每支4mL无菌水洗涤混匀甘油于小 三角瓶,备用。 细胞浓度测定:用无菌水逐步稀释为 10-4,显微 镜血球记数测定各处理菌液的细胞个数(b0～b4)。计 算菌液浓度(C0～C4)。 活菌数测定:按500～3000个/mL细胞数菌液进 行第二次稀释,取 0.1～0.2mL稀释液涂 PDA平板 3 个,27℃下培养,测定3个平板上的活菌落总数。 菌株存活率计算公式: 存活率=s÷g×x C 100%= s÷g×x b÷80×400×1000×10 4100% x=a÷12。 式中s———二次稀释倍数,g———涂平板取悬菌 液量(mL),x———平板上平均活菌数(个),C———镜 检菌细胞浓度 (个/mL),b———显微镜菌细胞记数 (个),a———12个平板总菌数(个)。 1.3.3生物活力检测 发酵培养:用刻度吸管按每瓶2mL吸取检测液 接种于装有CSSU发酵培养基(自制,主要含淀粉、黄 豆饼粉、硫酸铵、尿素)的三角瓶,28℃下185r/min常 规发酵培养7d。 待 测 液 制 备 :发 酵 液 以 10000r/min离 心 20min,取上清液备用。 指示菌悬液制备:4个(PI、PE、BC、RS)供试指示 斜面菌,分别用 50mL无菌水洗涤于无菌玻珠三角 瓶,振荡分离菌孢子,备用。 青霉素液配制:用 5mL无菌水稀释 80万单位 (0.48g)青霉素钠粉剂1瓶。 检测平板制备:用吸液器分别吸取0.1mL青霉 素液于4个指示菌悬液三角瓶中,混合后取1mL分 别加入无菌平皿,用15～20mLPDA培养基制成病原 指示检测平板。 菌株活性检测:采用 PCG法(纸片常规法)测定 菌株发酵代谢检测液的生物活性。 1.3.4产物特性测定 波长确定:代谢液体为橙褐色,波长选择范围在 520～780nm。用721分光光度计测定代谢物质的透光 度。随机取处理试液颜色深、中、浅各 3个于比色杯 中,平行测定各试液的透光度,以代谢物质最大透光 度来确定待测液的最佳波长。 测定:待测液的波长确定后,用该波长测定各处 理菌株发酵液的上清液,分别与其抑菌面积比较,确 定发酵液色泽与菌株活性的关系。 2 结果与分析 2.1 保藏方法和保藏时间对菌株存活率的影响 实测数据列于表1。计算出各处理的菌株存活率 (见图 1)。可见,转代法平均结果 86.73%,保藏 70d 最高,为 98.48%;平均结果冻结法最高,达 91.34%; 石蜡法平均结果82%;载体法平均结果68.08%,保藏 260d最差,为39.25%。 菌株存活率随保藏时间的延长而降低,保藏70d 的菌株存活率高达97.36%,260d仅为56.67%。移植 转代法适合在短时期保藏菌株,转代法保藏70d的 菌株存活率高达98.48%,而较长时期保存菌株适合 采用超低冻结法,冻结法保藏 260d的菌株存活率达 到73.4%。 移植 沙土 液体 冻结 0 70 110 180 260 存 活 率 % 图1 B-298菌株不同保藏方法和时间的存活率 120 100 80 60 40 20 0 转接 石蜡载体 冻结 时间/d 西 南 园 艺 张迎君,曾顺德,武 峥,漆巨容,黄 健:果实病原真菌拮抗菌株有效活性保藏试验研究 9 表1 B-298菌株不同保藏处理显微镜细胞数与平板活菌落数的测定 时间 /d S /倍 g /mL 转接 载体 石蜡 冻结 x /个 a /个 b /个 C /(个/mL) x /个 a /个 b /个 C /(个/mL) x /个 a /个 b /个 C /(个/mL) x /个 a /个 b /个 C /(个/mL) 0 107 0.10 266.8 3201 53.50 267.5×107 150.1 1801 30.20 151.0×107 239.3 2872 48.00 240.0×107 240.3 2883 48.10 240.5×107 70 107 0.20 47.4 569 48.13 240.7×107 28.8 346 29.88 149.4×107 35.8 430 37.00 185.0×107 46.6 559 47.63 238.2×107 110 107 0.10 17.6 211 37.63 188.2×107 7.1 85 24.00 120.0×107 15.2 182 39.00 195.0×107 20.5 246 43.88 219.4×107 180 106 0.10 167.2 2006 41.88 209.4×107 32.0 380 13.88 69.4×107 96.5 1158 21.88 109.4×107 57.0 684 12.38 61.9×107 260 107 0.15 166.0 1992 35.60 178.0×107 36.5 438 12.40 62×107 183.0 2196 47.00 23.5×107 144.5 1734 26.25 131.3×107 2.2 保藏方法和时间对菌株代谢产物活性的影响 2.2.1拮抗菌株对不同病原真菌的抑制效应 由图2可以看出,拮抗菌株对病原真菌抑制效果 最 好 的 是 BC,抑 菌 圈 透 明 度 为 7级 ,直 径 达 43.92mm,面积达1515mm2;其次是PI,透明度为 6.3 级,直径为23.7mm2,面积为441.15mm2;抑菌效果最 差的是 RS,透明度为 4.9级,直径为 18.1mm、面积 为257mm2。 2.2.2菌株不同保藏方法对病原菌抑菌效应的影响 试验表明,各种保藏方法菌株对病原真菌的抑制 作用平均表现为:抑菌圈透明度4.9～7.8级,效果最好 的是转接移植法、最差的是沙土载体法;抑菌圈直径 21.96～29.55mm,最大的是超低冻结法、最小的是沙 土载体法。单项值表现为:抑菌透明度最好的有11个 处理达到 8级,最差的 3个处理只为 3级;冻结法 110d的处理抑菌直径最大 55.56mm,载体法 180d 处理抑菌直径最小11.0mm(表2)。 2.2.3菌株不同保藏时间对病原菌抑菌效应的影响 表2可见,保藏 110d的菌株拮抗效应最好,抑 菌圈平均透明度7.0级、直径 30.02mm;180d的拮抗 效应最差,平均透明度 5.5级、直径 24.05mm。保藏 110d中以方法(1)的透明度最高(7.8级)、直径较大 (33.3mm);保藏 180d中以方法(2)透明度最低(4.4 图2 B-298菌株不同保藏处理对植物病原真菌的抑制效果 级)、直径最小(16.03mm)。 2.3菌株保藏方法和时间对其代谢产物色泽的影响 2.3.1菌株发酵代谢物质比色与波长的关系 B-298菌株发酵代谢物质为褐色,在波长 520～ 780nm所测定的平均值为1.0%～58.2%,最大58.2% 所对应的波长为755nm(表3)。 指示菌 时间 /d 70 110 180 260 平均 110 180 260 平均 110 180 260 平均 110 180 260 平均 PI 透度/*级 6.6 8.0 7.0 7.8 7.4 7.0 3.0 5.0 5.4 7.0 6.0 6.6 5.8 6.8 6.0 8.0 6.6 直径/mm 18.9330.5627.1329.8126.61 27.8813.3117.7519.20 26.6928.4428.5024.01 28.8124.4426.9424.91 PE 透度/*级 5.2 8.0 6.6 7.0 6.7 7.0 3.0 3.8 4.1 7.0 6.6 6.0 6.53 6.3 5.6 5.6 5.8 直径/mm 17.6725.8123.7521.2522.12 22.1911.7914.1914.29 22.1924.6318.8121.88 21.3820.8119.6320.61 BC 透度/*级 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 7.0 3.8 5.0 6.0 7.8 7.2 8.0 7.7 8.0 6.8 5.6 7.1 直径/mm 43.0752.8837.0052.6946.41 40.8128.0036.7537.17 44.50 3655.1343.64 55.5637.8155.3848.45 RS 透度/*级 3.6 7.2 6.6 5.8 5.8 5.2 2.6 3.8 3.9 5.8 5.8 5.6 5.7 3.6 3.0 6.0 4.2 直径/mm 12.7523.9420.7520.5619.50 20.1911.0014.0615.08 20.3121.6320.0620.67 16.6918.3118.0617.69 平均 透度/*级 5.9 7.8 7.1 7.2 7.0 6.6 3.1 4.4 4.9 6.9 6.4 6.6 6.4 6.2 5.4 6.3 6.1 直径/mm 23.1133.3027.1631.0828.66 27.7716.0320.6921.96 28.4227.6830.6328.10 30.6125.3430.0029.55 转接 载体 70 6.6 17.93 2.4 9.00 8.0 43.13 5.7 23.35 石蜡 70 3.6 12.39 7.8 38.94 5.7 25.67 冻结 70 5.4 19.42 8.0 45.06 6.7 32.24 表2 B-298菌株不同保藏处理对植物病原真菌的抑制效应测定 (下转第13页) PI:意大利青霉;PE:扩展青霉;BC:灰葡萄孢;RS:根霉。 西 南 园 艺 张迎君,曾顺德,武 峥,漆巨容,黄 健:果实病原真菌拮抗菌株有效活性保藏试验研究 10 多倍体是高等植物染色体进化的显著特征。许 多研究表明,多倍体表现出比二倍体营养体增大、营 养成分增加的趋势。此外,植物多倍化还能使植株基 因活性和酶的差异性增强,增强植株的生态适应性、 对逆境的抗耐性及降低蒸腾作用,提高光合效率等 等[14～17]。随着对多倍体产生途径、特征、特性及鉴定方 法等方面更为深入的研究,多倍体诱导育种在育种领 域显示出日益广阔的应用和发展前景,特别是在蔬菜 和果树上的应用[18～19]。本试验检测出的七倍体品种对 于黄秋葵和红秋葵的育种和品种改良将起到十分重 要的作用。此外,本次试验中对气孔的观察进一步提 供了多倍体研究的细胞学资料,表明在倍性相同时黄 秋葵和红秋葵不同品种间的气孔差异不大。 参考文献 [1]李建华,陈珊.黄秋葵水提液抗疲劳的药效学观察[J].中国运动医 学杂志,2004,23(4):196～197. [2]张怀礼,曹玉彬,耿振云.稀特蔬菜———黄秋葵[J].现代农业,2004 (10):13. [3]卢隆杰,苏浓,岳森.菜药花兼用型植物———黄秋葵[J].蔬菜,2004 (10):36. [4]陈碧林.可赏可食可药的黄秋葵[J].花卉,2004(8):38. [5]赵文弱,王守富.红秋葵的特性及栽培技术[J].吉林蔬菜,2004(3): 18～19. [6]彭智群.黄秋葵的保健价值[J].吉林蔬菜,2004(3):30. [7]王君耀,周俊,汤谷平.黄秋葵抗疲劳的研究[J].中国现代应用药 学,2003,20(4):316～317. [8] Skovsfed.ChromosomenumbersintheMalvaceae[J].J.Genentics, 1935,31(2):263～296. [9]Kuwada.Studiesontheinterspecificreciprocalhybridsbetwee HibiscuscoccineusandH.moqcheufos[J].Kagawadaigakunogakubu gakuzyuefsu,1960,12:1～8. [10]陈禅友,童莉.黄秋葵种子萌发生理特性分析[J].种子,2004(11): 14～17. 2.3.2发酵液透光度测定 测定发酵液透光度所选定的波长为755nm。平均 结果:保藏方法以方法(2)透光度最大,为 63.13%;方 法(1)最小,为44.52%。保藏时间以70d透光度最大, 为61.75%;110d最小,为 43.12%。单项结果:载体法 180d的透光度最大,为72.54%;转接法110d的透光 度最小,为37.43%(见图3)。 3 结论 (1)保藏方法:果实病原真菌拮抗菌株 B-298的 保藏存活率以超低冻结法最高,沙土载体法最低;抑 菌透明度以移植转接法最好,沙土载体法最差;抑菌 直径以超低冻结法最大,沙土载体法最小;透光度以 沙土载体法最高,移植转接法最低。 (2)保藏时间:B-298菌株的4个保藏时间中,存 活率以70d最高、260d最低,抑菌透明度以 110d最 试液颜色 520nm 600nm 660nm 680nm 700nm 720nm 740nm 750nm 755nm 760nm 770nm 780nm 浅 0.9 16.5 29.6 42.7 57.3 63.3 62.4 66.1 68.0 63.8 60.3 51.8 中 1.1 17.1 26.3 44.8 47.1 48.7 50.9 53.2 55.7 51.8 51.1 41.8 深 0.9 17.1 25.5 38.8 45.5 49.3 46.1 52.9 51.0 50.1 50.3 43.3 平均 1.0 16.9 27.1 42.1 50.0 53.8 53.1 57.4 58.2 55.2 53.9 45.6 表3 B-298菌株发酵液比色的波长确定 好、70d最差,抑菌直径以110d最大、180d最小,透 光度以180d最高、110d最低。 综上所述:B-298菌株的存活率在70d以转接法 最高,在110d抑菌透明度以转接法最高,抑菌直径以 冻结法最大。 (上接第10页) !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 西 南 园 艺 冯 焱,汪卫星,刘 利,李晓林,梁国鲁:黄秋葵和红秋葵的细胞学研究 图3 拮抗菌株B-298发酵液透光度 20 30 50 0 10 40 60 70 80 转接 载体 石蜡 冻结 平均 70 110 180 260 平均 时间/d 透 光 度 /% 13