无标
题
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http://sky.scnu.edu.cn/life/class/molecularbiology/1/1/2.htm[2010/10/19 16:42:14]
Ⅰ 分光光度法
一、目的
熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。
二、原理
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。波长为
260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异。
对
标准
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样品来说,浓度为1μg / ml时,DNA钠盐的OD260=0.02
当OD260=1时,dsDNA浓度约为50μg / ml
ssDNA浓度约为37μg / ml
RNA浓度约为40μg / ml
寡核苷酸浓度约为30μg / ml(youyu底物不同有差异)
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定。
一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230,计算其比值来衡量样品的纯
度。
经验值:
纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,
表
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明有RNA污染;<1。6,表明有蛋白质、酚等污
染)
纯RNA:1.7 <OD260/OD280<2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可
能有异硫氰酸残存)
若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量,可使用
方案
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二的方法或其他方法进行估算。
三、材料、试剂及器具
1、材料
提取的PUC19样品、PUC19标准样品
2、试剂
灭菌重蒸水,TE缓冲液
3、器皿
石英比色皿;UV-240紫外分光光度计
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四、操作步骤
1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.
2、用重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干,加入TE缓冲液后,放入样品室的S池架上,关
上盖板。
3、设定狭缝后校零。
4、将标准样品和待测样品适当稀释(DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl)
后,
记录
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编号和稀释度。
5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板。
6、设定紫外光波长,分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。
7、计算待测样品的浓度与纯度。
DNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×50/1000
RNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×40/1000
Ⅱ溴化乙锭法
一、目的
学习用溴化乙锭-标准DNA浓度比较法检测标准DNA的浓度。
二、原理
溴化乙锭(EB)是一种嵌入型染料,其上的一个扁平的基团可插入到DNA或RNA链的堆
积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫
外辐射并传递能量给EB,而EB本身在302nm和366nm处有光吸收。吸收的能量在590nm
处释放,并表现为橙红色荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结
合量的多少与DNA的大小和构型有关,而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单
一构型的同种DNA样品来说,溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比。
三、材料、试剂及器具
1、标准DNA样品:已知浓度的线型DNA,以TE稀释为梯度浓度的一系列标准样品。
2、质粒DNA的酶切样品(待测)
3、溴化乙锭(EB)5μg / ml:以PH8.0的TE稀释10mg/ml母液而的。
4、紫外透射仪。
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四、操作步骤
黑色塑料板(或其他替代物)
↓
在其上点上两排溴化乙锭2μl液滴,每排六点
↓
取标准样品2μl与第一排溴化乙锭混匀,则各点的DNA浓度分别为
(单位:ng/μl):20、15、10、5、2、1
↓
取待测样品经过梯度稀释后,各加2μl于第二排的溴化乙锭上混匀
梯度稀释(单位:μl)
↓
把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上
↓
关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察每一点的荧光强度或拍照。
比较上下两排得亮度,确定待测样品的浓度
五、注意事项
1、标准样品含单一种类的DNA,且大小与待测样品相近。
2、待测样品和标准样品使用同样的体积.
3、EB具有中度毒性、强致癌性,操作时切记戴手套,切勿沾染到衣物、皮肤、眼
晴、口鼻等。
4、沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中,经净化处理后方可弃。
六、实验报告
1、绘出所观察到的现象(以点的密度代表亮度)
2、请估算待测DNA原液的浓度。
要求记录测定原始数据,计算待测样品的浓度和纯度;并对你的实验结果作出评价,
提出下一步提纯工作的设想。
sky.scnu.edu.cn
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