大黄中大黄酸提取新方法研究

http: / / x byz. chinajournal. net. cn 水平见表 1, 实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及结果分析见表 2。 极差分析表明, 各因素对沙棘果总酚酸提取效果 影响的程度从低到高依次为 B< A< C< D,可知料液 比对沙棘果中总酚酸的提取影响最大, 其次是提取次 数和乙醇体积分数, 提取时间影响最小。结合 K 值 可知最佳提取条件应为 D2 C3A 3B2 ,即料液比 1 � 20、 提取 4次、溶剂体积分数 80%乙醇,提取时间 2 h。 表 1� 正交实验因素水平表 水平 A,乙醇体积分数/ % B,时间/ h C,次数 D,料液比 1 60 1 2 1� 15 2 70 2 3 1� 20 3 80 3 4 1� 10 表 2 � 正交实验提取沙棘果中总酚酸结果与分析 实验号 A,乙醇体积分数/ % B,提取时间/ h C,次数 D,液料比 总酚酸含量/ % 1 1 1 1 1 11. 88 2 1 2 2 2 18. 42 3 1 3 3 3 16. 04 4 2 1 2 3 14. 85 5 2 2 3 1 21. 39 6 2 3 1 2 21. 45 7 3 1 3 2 27. 33 8 3 2 1 3 23. 76 9 3 3 2 1 12. 48 K 1 15. 447 18. 020 19. 030 15. 250 K 2 19. 230 21. 190 15. 250 22. 400 K 3 21. 190 16. 657 21. 587 18. 217 极差 5. 743 4. 533 6. 337 7. 150 3 � 结论 根据单因素实验和四因素三水平的正交实验,确 定了料液比是影响沙棘果中提取总酚酸的较主要因 素,其次是提取次数和乙醇体积分数, 提取时间的影 响相对较小。其最优化提取工艺: 1� 20的料液比,提 取4次,溶剂为体积分数 80%乙醇,提取时间 2 h。按 照该工艺,沙棘果中总酚酸粗提物的得率为 28. 42%。 参考文献: [ 1] � 金怡, 姚敏. 沙棘的研究概况[ J] . 中医药信息, 2003, 20 ( 3) : 21�22. [ 2] � 李丽芬, 杨立志,石扣兰, 等. 沙棘粉对小鼠耐寒冷耐缺 氧耐疲劳的影响[ J] . 西北药学杂志, 1992, 9( 3) : 18�19. [ 3] � 王秉文, 冯养正,张慧敏, 等. 沙棘叶乙酸乙酯提取物对 离体豚鼠心房肌的作用[ J] . 西北药学杂志, 1992, 7( 4) : 18�19. [ 4] � 田树革,魏玉龙 ,刘宏炳. 福林比色法测定石榴不同部位 总多酚的含量 [ J] .光谱实验室, 2009, 26( 2) : 341�343. (收稿日期: 2010�12�01) 大黄中大黄酸提取新方法研究 王义潮,朱婧怡, 崔延堂* , 黄琳娟,倪士峰(西北大学 生命科学学院, 陕西 西安 710069) 摘要: 目的 � 建立 1 种有效提取中药大黄中大黄酸的新方法。 方法 � 利用氨水作为提取液结合 H PLC 分析手段, 通过改变 酸的浓度和萃取溶剂的比例,研究其对大黄酸净收率的影响。 结果 � 药用大黄采用 1 mL � L - 1氨水于 40 � 提取 2 次,用 5 倍体积的乙醇将蛋白质和多糖等杂质沉淀除去; 上清浓缩, 用 2 mol � L- 1 HCl于 70 � 水解 3 h, 将结合态大黄酸水解为游 离态, 大黄酸粗品收率为 38. 0 mg � g- 1 ; 用乙酸乙酯与二氯 甲烷的混合溶液( 1� 2)对大黄酸进行初步纯化, 经 3 次萃取, 大黄酸净收率为 3. 0 mg � g- 1 ,质量分数达到 70%。结论 � 建立了提取大黄酸的新方法 ,首次采用氨水代替有机溶剂提 取, 与报道的方法相比净收率提高 40%。 关键词: 大黄;提取方法; 大黄酸 doi: 10. 3969/ j. issn. 1004�2407. 2011. 02. 004 中图分类号: R284. 2� � � 文献标志码: A � � � 文章编号: 1004�2407( 2011) 02�0084�03 基金项目 : 陕西省重点实验室重点科研 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目 (编号: 09JS081) *通信作者: 崔延堂,男, 高级工程师 � � 大黄酸( rhein)是药用大黄 ( Rheum of f i cinale Baill. )的主要活性成分之一, 有很强的抗菌、抗炎、抗 癌作用,还具解毒、抗衰老、免疫双向调节、降脂减肥、 抗动脉硬化等功能,被认为是具有多靶点多功能的药 物 [ 1]。大黄酸经乙酰化生成的二乙酰大黄酸(又名双 醋瑞因)是目前治疗关节炎的特效药, 价格昂贵。我 国有丰富的大黄资源, 从中提取大黄酸, 进一步开发 新药研究具有重要意义。大黄中大黄酸以游离态和 糖苷化合物存在,目前提取大黄酸的主要方法是先用 硫酸水解糖苷键后, 用氯仿提取,或用甲醇提取 [ 2�4] , 或用氯仿�丙三醇提取[ 5]。用以上方法提取大黄酸净 收率低, 且质量分数不高(常混入质量分数 30% ~ 50%的大黄素)。原因是大黄酸含 1个羧基, 微溶于 乙醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚等有机溶剂。用上述溶 剂提取时, 大黄酸溶解性很差, 而大黄素和大黄酚极 性小于大黄酸,在上述溶剂中溶解性好, 导致大黄酸 的净收率低,杂质较多。大黄酸的羧基能与弱碱成盐 而易溶于水,利用这一性质我们建立了 1种新的大黄 酸提取方法,取得了较好效果。 1 � 仪器与试药 1. 1 � 仪器 � Water s 2695�2996 型高效液相色谱仪, 色谱柱( ZY1104型 Micro PAK�C18柱, 250 mm � 4. 6 mm, 5 �m,北京分析仪器厂制造) ; Lambda 25紫外� 可见分光光度计( Per kin Elmer 公司) ; M illi�Q 超纯 水制备仪(美国 M illipor e公司)。 1. 2 � 试药 � 大黄,购于西安市太白北路怡康药店, 为 药用大黄 ( Rheum of f icinale Baill )的干燥根及根 84 西北药学杂志 � 2011 年 4 月 � 第 26 卷 � 第 2 期 http: / / x byz. chinajournal. net. cn 茎;大黄酸对照品,购自江西草本天工科技有限公司, 由中药固体制剂制造技术国家工程研究中心生产,质 量分数�98%;主要试剂:磷酸、乙腈(色谱纯) ;硫酸、 盐酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、丙三醇(大达无机化 工厂,分析纯) ;乙醇、氨水(西安化学试剂厂,分析纯) ; 碳酸氢钠、甲醇等(天津市化学试剂六厂,分析纯)。 2 � 方法 2. 1 � 色谱条件 � 流动相 A: 1 g � L - 1 H 3 PO 4 水溶 液,流动相 B:乙腈。梯度洗脱: 0~ 20 min 60% A ~ 40% A, 20~ 30 min 40% A。流速: 0. 8 mL � min- 1 ; 检测波长: 430 nm;进样量: 10 �L;柱温:室温。 2. 2 � 大黄酸 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液的配制和标准曲线的绘制 � 精 密称取大黄酸对照品 2. 0 mg, 置于 100 mL 量瓶中, 用甲醇溶解并定容, 作为储备液; 分别吸取此储备液 2. 0, 4. 0, 8. 0和 20. 0 mL,置于 50 mL 量瓶中,用甲醇 定容、混匀。在选定的色谱条件下分别进样,以样品质 量浓度 C ( mg �mL- 1 )对峰面积 A 进行线性回归。 2. 3 � 氨水提取法 2. 3. 1 � 粗大黄酸的提取 � 将药用大黄的干燥根及根茎 粉碎,过 20目筛,准确称取 5. 0 g,用50 mL 1 mL � L- 1 氨水溶液( pH 8)于40 � 搅拌提取12 h, 每30 min检 测提取液的 pH 值使其保持在 8; 离心, 再以相同条 件提取 8 h;加入约 150 mL 乙醇于提取液中, 放入冰 箱冷藏过夜; 离心并浓缩上清液, 加入 2 mol � L- 1 HCl溶液调 pH 2~ 3,于 70 � 酸水解 3 h, 过滤并回 收沉淀;将沉淀置于烘箱内40 � 烘干; 干燥后的沉淀 置于 100 mL 量瓶中, 用甲醇定容; 取 1 mL 该溶液, 离心,进行 HPLC分析。 2. 3. 2 � 不同纯化方法对大黄酸提取的影响 � 准确称 取大黄粉末 25. 0 g, 按 2. 3. 1方法提取, 将干燥后的 沉淀称质量, 并等分为 A, B, C, D 和 E 5 份。取 A, 加入 50 mL 乙酸乙酯�二氯甲烷( 4︰1)溶液,常温下 搅拌提取 3 次, 每次 30 min; 合并提取液并浓缩至 干,置于 100 mL 量瓶中,用甲醇定容; 取 1 mL 该溶 液,离心, 进行 HPLC 分析。 B, C, D和 E 分别加入 50 mL 比例为 2� 1, 1 � 1, 1� 2和 1 � 4 的乙酸乙酯�二氯甲烷溶液,依照 A 方法提取检测。 2. 4 � 氯仿�丙三醇提取法 � 准确称取干燥的大黄粉 末 5. 0 g, 按文献方法[ 9] 提取。提取后产物置于 100 mL 量瓶中,用甲醇定容; 取 1 mL 该溶液,离心,进行 HPLC分析。 2. 5 � 氯仿�硫酸提取法[ 8] � 准确称取干燥的大黄粉 末 5. 0 g , 加入 100 mL 氯仿�体积分数 20% H 2 SO4 水溶液( 1 �1) , 70 � 搅拌提取 3 h;收集氯仿层,加入 25 g � L - 1 NaHCO3 水溶液 50 mL, 常温下萃取 3 次,每次 30 min;合并萃取液, H Cl调 pH 至 2~ 3, 酸 沉 2~ 3 h,离心,将沉淀置于 100 mL 量瓶中,用甲醇 定容; 取 1 mL 该溶液,离心,进行 HPLC分析。 3 � 结果与讨论 3. 1 � 色谱图 � 在 2. 1色谱条件下分离样品,见图 1。 图 1� 样品 HPLC图 1. 大黄酸; 2.大黄素 3. 2 � 大黄酸、大黄素标准曲线及回归方程 � 精密量 取大黄酸对照品储备液,制得不同质量浓度的对照品 溶液,各取 10 �L 依次进样。以峰面积 A 对样品质量 浓度 C进行线性回归, 回归方程为 C = - 0. 644 9 + 394. 216 2A , r = 0. 998 96。大黄酸质量浓度在 4~ 80 �g �mL - 1范围内线性关系良好, r 值在 0. 990~ 0. 999之间。 3. 3 � 氨水提取法提取大黄酸 � 目前大黄酸的提取主 要采用先硫酸水解再用氯仿、苯、乙醚等有机溶剂提 取 [ 5, 7�8]。由于大黄酸在 7( 3)位是羧基(�COOH ) , 极 性比大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚都强。 因此, 它在氯仿、乙醚中的溶解性小, 导致提取效率 低,大黄素等杂质的含量高。我们采用弱碱提取, 大 黄酸与碱形成盐,其水溶性可以提高收率。但不宜使 用强碱,若用 NaOH 则会增加大黄素等杂质的溶出。 我们采用 1 mL � L - 1的氨水 40 � 提取, 游离和结合 态的大黄酸均可被完全提取。用 5倍体积的乙醇将 蛋白质、多糖等杂质沉淀除去。采用 2 mol � L - 1 HCl将结合态大黄酸水解为游离态, 收集沉淀, 烘 干,称质量,干燥大黄酸粗品收率为 38. 0 mg � g - 1。 HPLC分析结果如图 2所示。在提取过程中,氨水体 积分数不宜过大,否则大黄素等杂质溶出量会增加。 由于大黄在煎煮过程中会产生酸性物质, 使提取液 pH 值降低,提取时须补加氨水保持提取液 pH 为 8。 图 2 � 采用氨水法提取的大黄酸粗产物色谱图 1. 大黄酸; 2. 大黄素 85西北药学杂志 � 2011 年 4 月 � 第 26 卷 � 第 2 期 http: / / x byz. chinajournal. net. cn 3. 4 � 不同溶剂对大黄酸纯化效果的影响 � 大黄酸 7 ( 3)为羧基,分子极性强, 在二氯甲烷中微溶, 尽管二 氯甲烷能去除多数极性杂质, 但纯化后大黄酸净收率 也低。乙酸乙酯对大黄酸溶解性好,而粗提取物中的 杂质也易溶于其中。综合上述因素,我们采用二氯甲 烷与乙酸乙酯混合液对大黄酸粗提取物进行纯化,取 得很好的效果,考察不同比例乙酸乙酯�二氯甲烷对 大黄酸粗产物的纯化效果,结果如图 3所示。随着二 氯甲烷含量的增加, 杂质含量减小, 同时大黄酸的提 取率降低。比较图 3可知, 乙酸乙酯�二氯甲烷为 1� 2时,纯化效果较好。在此条件下, 大黄酸不仅提取 率高,且杂质少(主要以大黄素为衡量依据)。 图 3� 不同溶剂对大黄酸纯化效果色谱图 A. 乙酸乙酯�二氯甲烷( 4� 1) ; B.乙酸乙酯�二氯甲烷( 2� 1) ; C. 乙酸乙酯�二氯甲烷( 1� 1) ; D. 乙酸乙酯�二氯甲烷( 1� 2) ; E. 乙酸乙酯�二氯甲烷( 1� 4) ; 1. 大黄酸; 2. 大黄素 3. 5 � 不同提取方法大黄酸净收率的比较 � 按 2. 3, 2. 4和 2. 5所述方法, 称取等量干燥大黄粉末, 进行 平行提取实验。结果见表 1。 表 1� 不同提取方法大黄酸的净收率 提取方法 大黄酸含量 /% 大黄素含量 / % 杂质 / % 大黄酸净收率 / mg � g- 1 氯仿�丙三醇法 69. 5 21. 7 8. 7 1. 2 氯仿�硫酸法 54. 0 19. 8 26. 2 1. 8 氨水提取法 70. 0 19. 0 11. 2 3. 0 � � 氯仿�硫酸提取法提取效率不高且杂质含量高。 氯仿�丙三醇提取法虽杂质含量低, 但提取效率也低。 比较 3种方法, 氨水提取法在提高提取效率的同时 (大黄酸收率约为氯仿�丙三醇法的 3倍)杂质的含量 也很低。此方法操作简便,直接用氨水提取使总大黄 酸以盐的形式进入水相,再酸水解使结合态大黄酸变 为游离态, 避免了先酸解再提取造成大黄酸的损失, 同时, 氨水易挥发,可烘干除去,不会引入杂质。 4 � 结论 药用大黄中大黄酸约有 50 %为结合态, 为提高 大黄酸的提取效率,采用 1 mL � L- 1氨水溶液 40 � 回流提取 2次(共 20 h) , 使结合态大黄酸变成游离 态。乙醇沉淀除去蛋白质、多糖等杂质。浓缩得到浸 膏,经酸水解得大黄酸粗品, 收率为 38. 0 mg � g - 1。 目前报道的酸水解法多采用体积分数 20% H 2SO 4 水溶液 70 � 水解 3 h [ 5]。我们采用 2 mol � L- 1 HCl 水溶液酸水解, 主要有以下优点: 1) HCl易挥发, 水 解后无需将沉淀水洗至中性, 烘干便可除去残留的 酸,不会影响后续实验。2)我们分别考察了采用体积 分数 20% H 2SO4 水溶液、1 mol � L- 1 HCl水溶液、2 mol � L- 1 HCl水溶液于 70 � 水解等量的大黄酸粗 产物 3 h, 发现用 2 mol � L- 1 HCl水解大黄酸含量 高,且杂质含量低。纯化粗大黄酸采用乙酸乙酯�二 氯甲烷 1 � 2 混合试剂常温搅拌纯化 3 次, 每次 30 m in,大黄酸净收率最大(达到 3. 0 mg � g- 1 ) , 质量分 数达到了 70%。 参考文献: [ 1] � 康廷国 . 中药鉴定学[ M ] . 北京: 中国中医药出版社, 2009: 72�76. [ 2] � 刘庆增. 大黄的化学成分及药理作用[ J] .中草药, 1987, 18( 1) : 41�42. [ 3] � Rintelen B, Neumann K , Burkhard F . A Meta�analysis of cont rolled clinical studies w ith diacerein in the tr eat� ment of o steoart hr itis[ J] . Arch Intern Med, 2006, 166: 1899�1906. [ 4] � Tamura T , Shirai T , Kosaka N, et a l. Pha rmacolog ical studies of diacerein in animal models o f inf lammation ar� t hr itis and bone r eso rption[ J] . Eur J Pharmaco l, 2002, 448: 81�87. [ 5] � 袁吕江,李学刚, 赵海伶, 等. 大黄中蒽醌衍生物水解和 提取工艺改进研究 [ J] . 中华中医药学刊, 2004, 22 ( 10) : 1880�1882. [ 6] � Wei Y , Zhang T , Ito Y . Pr epar ative separat ion o f rhein from Chinese t raditional herb by r epeated high�speed counter�cur rent chromatog raphy [ J] . J Chromato gr A , 2003, 1017( 1/ 2) : 125�130. [ 7] � 肖艳, 杜智敏. 大黄中有效成分提取分离条件的优化 [ J] . 中国临床药理学与治疗学, 2003, 8( 1) : 98�100. [ 8] � 徐友锋,李灵芝, 陈虹.大黄中提取游离蒽醌的工艺改进 [ J] . 武警医学院学报, 2002, 11( 2) : 76�77. [ 9] � 袁吕江,李学刚, 赵海伶, 等. 大黄酸提取工艺的改革探 析[ J] . 中华中医药学刊, 2004, 22( 7) : 1359�1361. (收稿日期: 2011�01�13) 86 西北药学杂志 � 2011 年 4 月 � 第 26 卷 � 第 2 期