卡氏肺孢子虫肺炎实验室诊断研究进展

文章编号 : 1671 - 4695 ( 2002) 03 - 0192 - 04 卡氏肺孢子虫肺炎实验室诊断研究进展 北京热带医学研究所 (100050) 　王建成 　郭增柱 　　卡氏肺孢子虫肺炎 (pneumocystis carinii pneumonia PCP) 是由卡氏肺孢子虫 ( Pneumocystis carinii , P1 c) 引起的一种呼吸系统机会性感染 , 多见于免疫功能低 下的患者。本文对有关卡氏肺孢子虫的病原学及实验 室诊断的研究进展综述如下。 1 　卡氏肺孢子虫病的病原学研究 1909 年 Chagas 在锥虫感染的豚鼠肺部首次发现 肺孢子虫 , 次年 , Carinii 在锥虫感染的大鼠体中亦找 到此微生物 , 但均认为它是一种变异的锥虫。1912 年 , DelanoÄ证实肺孢子虫为一种新的微生物 , 为纪 念 Carinii 而命名为卡氏肺孢子虫 ( Pneumocystis carinii DelanoÄ et DelanoÄ, 1912) 。1942 年 Van der Mer 和 Brug 发现 P1 c 可在营养不良的婴幼儿中引发间质性 肺炎〔1〕。此后 , 随着肿瘤化疗患者、器官移植、自身 免疫病等高危人群的扩大 , PCP 发病率逐渐上升。特 别自 1984 年发现首例艾滋病以来 , PCP 一直是艾滋 病患者首要的并发症和死因。据统计未经药物预防的 艾滋病患者约 80 %感染 PCP〔2〕, 被视为艾滋病的“标 志病”。P1 c 形态特征与原虫相象 , 在真菌培养基上 不能生长 , 细胞膜富含胆固醇而非普遍存在于真菌细 胞膜上的麦角固醇 , 对抗真菌药物耐受 , 而对抗原虫 药物敏感 ; 超微结构、染色特性等则与真菌相似 , 故 其生物学分类一直存在争议〔3〕, 曾被认为是一种原 虫。近年来经 16S rRNA 序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 , 人们将 P1 c 归类 为一种不典型真菌 , 在进化树上位于子囊菌和担子菌 之间 , 是一单独分支 〔4〕。分子生物学和免疫学证据证 实 P1 c 有不同菌株 , 各菌株的表现型及基因型存在 差异 , 并具有宿主特异性 , 例如 , P1 c f1 sp1 Huminis 菌株只感染人类〔4 , 5〕。 目前仍用寄生虫学术语对其进行描述 , 造成了一 些混乱。P1 c 不能在体外连续培养 , 阻碍了对其生 活周期的认识 , 一般认为 P1 c 生活史包括滋养体、 囊前期和包囊三个时期。滋养体形态多样 , 直径约 1 ～5μm , 形似静止的酵母菌。滋养体的外膜柔软 , 富 含β- 葡萄糖及糖蛋白 , 呈高度旋绕状 , 并形成管状 突起 , 在 P1 c 滋养体之间或与 Ⅰ型肺泡上皮细胞相 互黏附过程中起重要作用〔4〕; 囊前期为滋养体与包囊 期的中间阶段 , 大小约 4～6μm , 其形态特征难以确 定 ; P1 c 包 囊与子囊菌的子囊相象 , 直径约 6～ 7μm , 囊壁含有角素和葡聚糖 , 成熟包囊内含有数个 囊内小体 , 少数包囊囊内小体缺如。正常情况下 , P1 c 滋养体数目显著高于包囊 , 为多数抗 P1 c 药物 的作用部位 , 而包囊则是多数病原体染色的着色部 位〔4〕。P1 c 核分裂机制尚不明确 , 有报道认为是二 分裂方式 , 但细胞周期中尚存在减数分裂 (孢子发 生) 过程。成熟包囊破裂释放出的囊内小体 (子孢 子) 发育成滋养体 , 滋养体可经二分裂方式繁殖。部 分滋养体 (单倍体配子) 可接合产生二倍体子孢子 , 后者包含于子孢子囊内 , 其细胞核经有丝分裂及减数 分裂 , 并裹以部分胞质形成 4～8 个囊内小体 (单倍 体子孢子)〔4〕。 P1 c 通过呼吸道进入肺泡后 , 分泌几种表面蛋 白借以逃避宿主免疫系统攻击 , 并利于其定植在 Ⅰ型 肺泡上皮表面〔3〕, 引起隐性感染 , 当机体免疫功能下 降 , 特别是 CD4 + 细胞减少至一定数目后被激活 , 引 发 PCP。近年来的多数研究表明 PCP 发病是新发感 染所致 , 而非隐性感染激活〔4 , 6〕。 2 　卡氏肺孢子虫病的实验室诊断 211 病原学检测 病原学检测是诊断 PCP 最常用的方法 , 所检标 本为痰液、支气管肺泡灌洗液 (BALF) 、支气管刷检 物 (TBB) 及肺组织活检物等。①痰液检查简便、安 全、无损伤 , 但咳出的痰 P1 c 检出率很低 (6 % ～ 30 %) 。导痰 ( IS) 方法可使 P1 c 检出率达 60 % ～ 70 % , 导痰前夜禁食 , 操作前应清洁口腔 , 检出率可 提高到 90 %〔7〕。②BALF 通过双侧肺或多肺叶直接定 位支气管灌洗法 (BAL) 获得 , P1 c 检出率可达 98 % ～100 % , 操作时应将纤维支气管镜的顶端楔入 4 级 ·391· 第 1 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　临床和实验医学杂志 　　　　　　　 　　　　　　Vol11 , No13 　2002 年 9 月 　　　　　　　Journal of Clinical and Experimental Medicine 　　　　　　 　 　Sep1 ,2002 以下支气管 , 以保证灌洗到下呼吸道和肺泡成分。此 法对病人损伤小 , 检出率较高 , 若病人一般状况可耐 受纤维支气管镜检查时 , 宜首先选用。③TBB 检查可 和 BALF 检查结合使用 , 能使 P1 c 检出率达 94 %以 上。④肺组织活检包括开胸肺活检、针吸肺活检和穿 刺肺活检。开胸肺活检可获得足够的检查标本 , 故检 出率高 (约 95 %) , 但创伤大 , 可导致呼吸功能衰 竭 , 手术死亡率较高 , 一般只在临床高度怀疑为 PCP 而 TBB、BALF 及 IS 检查多次阴性的情况下才考虑采 用 ; 经皮针刺吸引肺活检适合儿童患者 , 优点是快 速、安全、不需气管内麻醉 , 因吸取的肺组织标本量 少 , 检出率较低 (约 60 %) ; 穿刺肺活检能获得较多 的肺组织 , 检出率较经皮肺针刺吸引术高 , 但并发气 胸、咯血的机会亦相应增多。此外 , P1 c 虫体可扩 散至全身多个脏器如肝、脾、骨髓及淋巴结等 , 一般 在病变部位穿刺获得的标本 , 如肝脏、甲状腺等穿刺 物、胸水、腹水、关节腔积液等涂片中可检出 P1 c 病原体。骨髓穿刺涂片检查是诊断早期播散性 P1 c 肺外感染较可靠的方法〔8〕。 常用的 P1 c 染色方法包括六甲基四胺银 ( GMS) 染色、甲苯胺蓝 ( TBO) 染色和吉姆萨 ( Giemsa) 染 色、瑞氏 (Wrights) 染色等。其中 GMS 和 TBO 染色 使 P1 c 包囊着色 , 部分囊壁可见括号状结构 , 菌体 容易辨认 , 因而应用最广。Giemsa 及 Wrights 方法主 要染色滋养体和包囊囊内小体 , 易与其它真菌鉴别 , 但均使菌体周围背景着色 , 对比度差 , 容易漏检 , 且 常需在油镜下辨认。近年来应用了一些新的染色法 , 如 Diff - Quik (DQ) 染色可将 P1 c 包囊染为紫红或 淡蓝色药棉状不规则体 , 囊内小体清晰可辨 , 阅片时 应注意与胞浆内含有含铁血黄素颗粒或碳微粒的巨噬 细胞及脱落的肺泡细胞相鉴别〔9〕; Calcofluor White (CFW) 染色能使支气管肺泡液及分泌物中的 P1 c 包 囊着色 , 该染色方法简便易行 , 适用于 ICU 病人 PCP 的快速诊断 ; 荧光染色法则是利用荧光素 Cellufun 迅 速与囊壁中多糖结合 , 在一定波长激发光照射下发出 蓝绿色荧光 , 使包囊呈现明亮蓝绿色光环 , 囊壁中括 弧状结构清晰可见 , 该方法只需 20～30 分钟 , 是一 种很有价值的 P1 c 检测法 ; 此外 , Gram - Weigert、 May - Grunwald - Giemsa (MGG) 及 Papanicolaou 染色 等均可检出 P1 c。 P1 c 在不同的发育阶段及生存环境下其形态均 会发生较大的变化 , 并且滋养体与包囊的比例约为 10∶1 , 而目前常用的病原学染色方法多使包囊着 色〔4〕。因此 , 传统染色方法检测 P1 c 的漏检率较高。 212 　免疫学诊断 免疫学方法近年来已开始用于检测痰液、BALF 等标本中的 P1 c 滋养体、包囊及血清中的 P1 c 特异 性抗体。常用方法有 : ①间接免疫荧光试验 ( IIF) : IIF 对痰液和 BALF 标本中 P1 c 检出率高于 DQ 及快 速银染色法。Hassan 等认为 IIF 检测 P1 c 抗原的敏感 性达 100 %。②酶联免疫吸附试验 ( ELISA) : ELISA 可检测 PCP 患者及动物模型血液中 P1 c IgG 抗体 , 对 PCP 的诊断有参考价值。国内外均有报道认为 , 正常人血清抗 P1 c 抗体阳性率高达 50 %～60 % , 故 血清 P1 c 抗体检测对 PCP 的诊断价值不大 , 但在血 清流行病学调查方面则有重要意义。此外 , ELISA 能 定量检测 P1 c , 可为感染度分级及药物疗效评估提 供依据〔10〕。③碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶 (APAAP) 桥联酶标法 : APAAP 检测 HIV 阳性患者 BALF 标本 中 P1 c 时 , 敏感性优于 IIF 及 Grocott 染色 , 但特异 性稍差。④单克隆抗体 (McAbs) 染色 : McAbs 检测 P1 c 滋养体或包囊特异性高 , 敏感性好〔11〕。有研究 表明因宿主、地区的不同及化学药物预防的影响 , P1 c 表面抗原可发生变异从而影响单抗与抗原的结 合 , 降低 McAbs 的敏感性〔12〕。此外 , 免疫印渍法、 对流免疫电泳、胶乳凝集试验对 P1 c 检测亦有一定 价值。 213 　分子生物学诊断 1990 年 Wakefield 首先采用 PCR 方法检测 P1 c , 目前 PCR 已成为研究得最多的 P1 c 检测方法 , 研究 重点为 P1 c DNA 提取、引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 及 PCR 操作方法改 良。此外 , 尚有用 DNA 探针检测肺及肺外标本 P1 c 的报告。 PCR 检测的标本主要为痰液及 BALF , 亦有人报 道从鼻咽吸取物、血清、外周血单核细胞及多形核细 胞中检测到 P1 c DNA。SDS - 酚氯仿抽提法可从多种 标本中如痰液、BALF、肺匀浆及血液等得到高纯度 的 P1 c DNA , 但操作复杂 , 不适用于大批量标本的检 测 , 且所获标本量很小时 , 该制备方法亦不适用。基 因释放剂 (gene releaser) 制备 P1 c DNA 速度快、费 用低、可减少 DNA 污染及丢失 , 但 P1 c DNA 未经提 纯 , 其内可能含有抑制 Taq 酶活性的物质 , 使 PCR 产物量减少〔13〕。 常用的引物主要来自 P1 c 的内转录间隙 rRNA 基因、18S rRNA 基因、5S rRNA 基因、线粒体大亚基 rRNA 基因、二氢叶酸合成酶基因、主要表面糖蛋白 ·491· 第 1 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　临床和实验医学杂志 　　　　　　　 　　　　　　Vol11 , No13 　2002 年 9 月 　　　　　　　Journal of Clinical and Experimental Medicine 　　　　　　 　 　Sep1 ,2002 (MSG)基因、胸苷酸合成酶基因等。Khan 等 (1999)〔12〕 和 Fischer 等 (2001)〔14〕的研究表明采用线粒体大亚基 rRNA 基因引物的 PCR 敏感性和特异性明显高于传统 细胞化学染色方法 ; Ortana 等〔15〕采用 DHFR 引物扩 增痰液和 BALF 中的 P1 c DNA 时 , 其敏感性低于细 胞化学染色 , 且有 5415 %的假阳性 ; Lipschik 等〔16〕认 为单一引物对及套式 PCR 检测痰液中 P1 c DNA 的敏 感性较传统染色法高 , 而用于 BALF 标本则敏感性无 差异。还有学者报道在鼻咽吸取物 , 内转录间隙套式 PCR 敏感性达 7816 % , 明显优于细胞化学染色。 近年来发展了一些新的 PCR 操作方法如毛细管 PCR 及单管套式 PCR (Single - Tube Nested PCR) 等。 毛细管 PCR 只需 1μl DNA 模板 , 由于反应混合物少 , 毛细管 PCR 的扩增时间明显缩短。在降低费用和节 省时间的同时 , 其敏感性大幅度提高 , 约为传统 PCR 的 100 倍〔17〕。单管套式 PCR 将外引物及内引物同时 加入 PCR 反应体系 , 通过引物设计及循环条件的控 制 , 使第一次 PCR 扩增时内引物对不与 DNA 模板结 合 , 第二次 PCR 扩增时外引物对不引导 DNA 扩增。 单管套式 PCR 简化了操作过程 , 并可消除将第一次 PCR 产物转移到第二次 PCR 反应体系过程中的污染 机会 , 其敏感性和特异性与普通套式 PCR 相同〔18〕。 实时 PCR ( Real - time PCR) 及 LightCycler 系统能将 检测时间缩短至 2 小时而敏感性、特异性保持不 变〔19〕。 PCR 对 PCP 早期诊断、药物疗效和预后的评估 有一定帮助 , 但其临床价值一直存在争议〔20～22〕, 取 代传统检测方法尚需时日。如何改良 PCR 方法以提 高其敏感性、特异性及稳定性 , 降低费用、简化操作 还有待进一步的研究。 214 　辅助诊断 血液 CD4 + 细胞数目反映病人的免疫状态 , CD +4 细胞总数 ≤200 个/ L 或百分率 ≤15 % 时 , 并发 PCP 的几率明显增加。血 HIV - 1 RNA 水平与 PCP 关 系密切 , 其与 CD4 + 细胞计数相结合对 PCP 诊断有 较高价值。艾滋病患者出现肺部感染症状时 , 如血乳 酸脱氢酶 (LDH) 含量 > 450 U 时 , 应高度怀疑 PCP , LDH 正常者可排除 PCP , 但该指标缺乏特异性 ; 血 C 反应蛋白水平 < 30mg/ L 时 , PCP 可能性最大 , 在 30 ～80 mg/ L 之间则提示分枝杆菌感染 , 若 > 80 mg/ L 提示细菌性肺炎〔23〕。 此外 , 动脉血气分析、肺功能测定等亦有一定辅 助诊断价值。 参考文献 : 〔1〕 　Armengol CE1 A historical review of Pneumocystis carinii1 JAMA , 1995 , 273 : 747 - 7511 〔2〕　Phair JP , Munoz A , Detels R , et al1 The risk of Pneumocystis carinii pneumonia among men infected with human immunodeficiency virus type Ⅰ1N Engl J Med , 1990 , 332 : 161 - 1651 〔3〕　Santamauro JT , Stover DE1 Pneumocystis carinii Pneumonia1 Med Clin North Am , 1997 , 81 : 299 - 3181 〔4〕　Looney WJ , Windsor JJ1 Pneumocystis carinii infection in human im2 munodeficiency virus - positive patients1 Br J Biomed Sci , 1999 , 56 : 39 - 481 〔5〕　Stringer JR1 Pneumocystis carinii : what is it , exactly ? 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②无法根本解决连续切片间的精确对位 ; ③生物 组织结构的复杂多样性更增加了三维重建的难度〔1〕。 这使得应用计算机产生的三维图像质量受主观因素的 影响 , 而降低了图像的可信性与说服力〔2〕。20 世纪 80 年代早期 , 共聚焦激光扫描显微镜 (confocal laser scanning microscopy , CLSM) 开始应用于生物医学领 域〔3〕, 尤其是其光学切片〔4〕特性为病理组织水平的三 维重建拓宽了思路 , 使得保持组织结构完整性前提下 的三维重建成为可能。 1 　共聚焦激光扫描显微镜 工作原理 数字放映机工作原理变压器基本工作原理叉车的结构和工作原理袋收尘器工作原理主动脉球囊反搏护理 〔3 ,4〕 在荧光显微镜的基础上 , 利用光学原理 , 将激光 器产生的入射激光束经过分色反射镜 (dichroic) 使光 束偏转 90°, 经过物镜 (objective) 汇聚于样品中的某 一点 , 标本中产生的反射光或由激光激发的荧光 , 其 中一部分可逆向沿同一光学通路通过物镜和穿过分色 反射镜 , 经聚焦透镜 (focusing lens) 汇聚于聚焦透镜 的焦点处 , 经过滤光器 —通常为针孔 (pinhole) , 收 集于探测器 (detector) , 直接成像于计算机系统。散 焦光线、衍射光线不能通过检测器针孔 , 从而提高了 图像的清晰度。针孔在成像过程中起关键作用。激光 点光源与检测器针孔位置共轭 , 因此称为“共聚焦”。 共聚焦显微镜可在 X 轴、Y 轴、Z 轴扫描。CLSM 的 工作方式有两种 , 一种是动样式 (移动样品) 扫描、 另一种是移动光束式 (移动激光束) 扫描 , 目前大多 显微镜都采用移动光束扫描。其特殊之处在于 Z轴方 向上 , 它以一个微动步进马达控制载物台升降 , 最小 步距可达 011μm , 可获得高分辨率二维光学横断面 图像 , 实现对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的 系列“光学切片” (optical sectioning) , 被形象地称为 “显微 CT”, 在此基础上计算机系统自动进行三维重 建。 2 　共聚焦激光扫描显微镜三维重建的应用与发展方 向 　　共聚焦激光显微镜的成像模式包括两种 : 反射模 ·691· 第 1 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　临床和实验医学杂志 　　　　　　　 　　　　　　Vol11 , No13 　2002 年 9 月 　　　　　　　Journal of Clinical and Experimental Medicine 　　　　　　 　 　Sep1 ,2002