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载体

zjxiaolin08
2011-08-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《载体ppt》,可适用于自然科学领域

基因克隆的载体载体(vector)是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面而进行复制作为基因工程的载体必须具备以下几个性能:、分子较小可携带比较大的DNA片段。、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。、要有尽可能多种限制酶的切割位点但每一种限制酶又要最少的切割位点(多克隆位点multiplecloningsitesMCS)。、有适合的标记易于选择。、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达并且尽可能是高效的表达。、从安全角度考虑要求载体不能随便转移仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。载体功能克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中载体来源:质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞克隆载体载体的种类和特征第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA一般大小约~D可自身复制和表达有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的目前已有多种经改造的良好的质粒载体。 质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有~个抗药性基因以利于筛选。质粒载体克隆的质粒载体允许外源的DNA插入储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。一、质粒的生物学特性:、质粒DNA的构型:SC型共价闭合环形DNA(cccDNA)OC型开环DNA(ocDNA)L型线性DNA(cDNA)、不同质粒的分子量大小差异相当显著:~D、作为载体的质粒都含有三种共同的组分:复制基因(replicator)、选择性记号、克隆位点LOCSC、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等、质粒DNA的类型:接合型和非接合型含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌素抗性基因的R质粒F因子和F`因子等。、质粒DNA的复制类型:低拷贝的质粒(~):严紧型复制控制的质粒(接合型)高拷贝的质粒(~):松弛型复制控制的质粒(非接合型)、质粒的不亲合性在同一个大肠杆菌细胞一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。是指在没有选择压力的情况下两种亲源关系密切的不同质粒不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。(二)、质粒DNA的分离与纯化、氯化铯密度梯度离心法、碱变性法、微量碱变性法。氯化铯密度梯度离心法、质粒DNA占总DNA的~、在细胞裂解及DNA分离过程中大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断而质粒DNA分子量小结构紧密仍保持完整的状态、染色剂溴化乙锭(EB)能掺入到DNA链的碱基中导致链的解旋而且形成的EBDNA复合物中EB含量越高密度会越低。流程:首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠(SDS)来促进大肠杆菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中EB会嵌入到DNA链的碱基中去。在EB达到饱和时进行氯化铯密度梯度离心。碱变性法:根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间在拓扑学上的差异而发展出来的。在PH值~范围内时线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性PH值使之复性线性染色体形成网状结构而cccDNA可以准确迅速复性通过离心去除线性染色体获得含有cccDNA的上清液最后用乙醇沉淀获得质粒DNA碱变性法:、取毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中离心收集细胞沉淀、加入微升冰冷的液(mM葡萄糖mMTrisHClPH=,mMEDTA~mg溶菌酶)静置分钟、加入微升微冷的液(NaOHSDS)缓缓混匀置室温分钟。度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。、加入毫升冰冷的PH=的M醋酸钠振荡后冰浴分钟。、离心的上清液用苯酚抽提数次用乙醇沉淀收集质粒DNA。影响质粒DNA产量的因素:、寄主菌株的遗传背景使用endA基因发生突变的菌株编码核酸内切酶从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施:选择最适的培养条件以限制在细胞生长期间体内核酸内切酶的表达在纯化质粒DNA的过程中用加热法核酸内切酶使失活采用最佳的实验流程减少核酸内切酶的污染并在纯化了质粒DNA之后迅速除去污染的核酸酶。、质粒的拷贝数及分子的大小插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下降。(三)、质粒载体的构建与类型天然质粒:没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE、RSF和pSC等但存在一定的局限性。第一个用于基因克隆的天然质粒pSC它含有一个EcoR酶切位点一个四环素抗性选择记号(Tetr)插入外源片断后不影响其复制功能但该质粒分子量较大拷贝数低只具有抗菌素抗性基因无法使用插入失活技术选择重组分子。ColE质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片断后可根据对大肠杆菌素E的免疫性选择转化子不能合成大肠杆菌素E的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E的免疫筛选在化学上是相当麻烦的。质粒载体必须具备的基本条件()、具有复制起点自我增值的基本条件一般具一个复制子。()、具有抗菌素抗性理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。()、具有若干限制酶切单一位点(MCS)()、具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作克隆外源片断后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低较高的拷贝数可获得大量的克隆基因以Ampr和Tetr为选择性标记克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。(bp)质粒载体的选择记号新陈代谢特性对大肠杆菌素E的免疫性抗菌素抗性四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性大多数质粒本身带有抗菌素基因抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。不同类型的质粒载体高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体有些克隆的编码基因其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。()失控的质粒载体复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。Example:pBEU和pBEU质粒在度下每个寄主细胞只含有适量的拷贝数当培养温度超过度时质粒的复制将失去控制每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续~小时。最后得到超量的基因编码产物细胞生长受抑制失去存活能力积累的质粒DNA占细胞总DNA的。()插入失活型质粒载体将外源DNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点就有可能通过抗菌素抗性的筛选大幅度的提高获得阳性克隆的机会。Example:在pBR质粒载体的EcoR位点插入外源片断会使氯霉素抗性基因失活在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。()正选择的质粒载体正向选择:应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型。Example:质粒pKN有来自Mu噬菌体DNA的EcoRC的片断编码一种致死功能的kil基因。该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制在非溶源菌株中是致死的。在Hind或Hpa位点插入外源DNA片断后会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株。正向选择质粒载体的条件限制:、需要特殊的寄主菌株或选择培养基、可使用的克隆位点少、假阳性水平高、不能够调节插入序列表达活性()表达型的质粒载体表达载体:按特殊设计构建的能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。主要包括:大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入才能在启动子控制下进行有效的转录。四、重要的大肠杆菌质粒载体、pSC质粒载体、ColE质粒载体、pBR质粒载体、pUC质粒载体其它的重要的质粒载体pSC质粒载体一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有~个拷贝分子量kb编码有一个四环素抗性基因(tetr)。有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma种核酸内切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma个位点克隆外源DNA都会导致tetr基因失活。是第一个真核生物的克隆载体。()应用pSC质粒作基因克隆载体葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达金黄色葡萄球菌的质粒p,编码若干种能在大肠杆菌检测的结构基因能被核酸限制酶EcoR切割成段。()应用pSC质粒作基因克隆载体在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA用核酸内切酶EcoR消化非洲爪蟾的核糖体DNA(rDNA)与EcoR消化的pSC质粒进行重组。在挑取的个转化子中经EcoR酶切电泳后个转化子含有外源片断。转化率%ColE质粒载体松弛型复制控制的多拷贝的质粒能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用(复制、转录、转译能量代谢等)。但含有对细菌素的免疫基因。用ColE质粒特征为基础建立的转化细胞系存在一定的缺陷性:、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便、在细菌群体中能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。pBR质粒载体“P”表示是一种质粒“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“FBilivar和RLRodriguez”“”表示实验编号。pBR的构建:为改进转化子筛选技术并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点(多种限制酶的单一切割位点)、质粒的稳定性(克服质粒的结合转移能力)pBR的结构来源pBR质粒载体的优点:、具有较小的分子量它的分子量为bp。克隆载体的分子量大小不要超过kb。、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBRDNA分子中总共有种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部种识别位点在于这个基因的启动区内所以个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活另外有种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点Example:a在pBR质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断切断了tetr基因编码序列的连续性使之失去活性产生出AmprTets表型的重组pBR质粒转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上筛选出具Ampr菌落再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。BXBBBXAmproriAmpsTetroriABBTetsXb在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成β–内酰胺酶它能使青霉素转变成青霉酮酸而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子经度培养过夜后在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素β–内酰胺酶Ampr的菌落其周围的碘指示剂溶液变得明亮而Amps菌落无此反应。、具有较高的拷贝数而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累~个拷贝。pBR质粒载体的改良为了更加实用人们对pBR质粒进行了改良得到许多pBR质粒衍生质粒它们各自具有不同的特点。应用pBR质粒作为基因克隆载体水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析基因psbA编码的蛋白质与光合作用系统相关并且它能与除草剂阿特拉津结合它的第位氨基酸发生取代反应由丝氨酸变为甘氨酸可导致其失去与除草剂阿特拉津结合的能力推测是三维结构发生了改变在原生生物衣藻、蓝色细菌中此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应会使他们获得对除草剂的抗性功能。而且非竞争条件下对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属干物质产量比敏感植物下降了和。通过对基因psbA的体外操作有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR质粒作为载体成功的克隆了水稻的psbA基因。首先将水稻叶绿体DNA用EcoR内切酶消化经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳回收分子大小为~kb之间的DNA片断。再与经过EcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR质粒DNA连接。然后转化给大肠杆菌在氨苄青霉素的选择培养基上形成Ampr转化子菌落群体。用经p标记的玉米psdADNA探针作菌落杂交从多个菌落中筛选出个阳性克隆。对这个阳性克隆进行进一步的Southern分析表明个片断带有长度为kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明与高等植物的同原性在与蓝色细菌同源性pUC质粒载体人们应用多克隆位点技术在pBR的基础上组入了一个在其’端带有一段多克隆位点的lacZ’基因而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。一种典型的pUC系列的质粒载体包括以下四个部分:、来自pBR质粒的复制起点(ori)、氨苄青霉素抗性基因(ampr),但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。、大肠杆菌β半乳糖基因(lacZ)的启动子及编码α肽链的DNA序列此结构称之为lacZ’基因、位于lacZ’基因中的靠近’端的一段多克隆位点(MCS)区段。但它并不破坏该基因的功能。AmproripUC(kb)MCS(Multiplecloningsites,多科隆位点)LacpromoterlacZ’pUC质粒载体的形体图pUC质粒载体的优点第一具有较小的分子量和更高的拷贝数仅保留了pBR的氨苄青霉素抗性基因和复制起点在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失它是控制质粒的特殊因子从而使拷贝数增加平均每个细胞~个拷贝。第二适用于组织化学检测重组体具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因所编码的α肽链可参与α互补作用用Xgal显色对重组子进行鉴定而pBR质粒的重组子要进行两步的选择。第三具有多克隆位点MCS区段.方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。其它的重要的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体()丧失迁移功能的质粒载体  第一:拥有较高水平的拷贝数,平均每个大肠杆菌寄主细胞可达~份第二:失去了bom位点即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下也不可能发生迁移作用。()能在体外转录克隆基因的质粒载体pGEMZ是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体总长度bp编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ’基因。pGEMZ与pUC质粒之间的主要区别是它具有两个来自噬菌体的启动子即T启动子和SP启动子它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异的识别位点。pGEM现在以发展出了一大批在多克隆位点区附近参入噬菌体RNA聚合酶启动子的简单的质粒载体它们都是由pUC系列载体派生而来的。噬菌体的RNA聚合酶所合成的RNA转录本除了可作为杂交探针之外在兔网织红细胞裂解物转译体系或在麦胚无细胞转移体系中进行体外蛋白质的合成。在反应混合物中加入mGpppG能形成’的帽子结构进行有效的蛋白质合成。()穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。早期发现的大肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌植物细胞穿梭载体。五、质粒载体的稳定性问题、质粒载体不稳定性的类型结构的不稳定性:主要指由转位和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。分离的不稳定性:在细胞分裂过程中有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝并最终增值成为无质粒的优势群体。结构的不稳定性DNA的缺失、插入和重排是造成质粒载体结构不稳定性的原因。、质粒的自发缺失:同向重复短序列之间的同源重组。、寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子也会引起结构的不稳定性。分离的不稳定性细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配也是导致质粒不稳定性的重要原因将这种起因于质粒的缺陷性分配所造成的质粒的丢失现象叫作质粒分离的不稳定性。要使质粒能够稳定的遗传必须保证平均每个世代质粒最少复制一次并且细胞分裂过程中质粒复制的拷贝必须分配到两个子细胞中去。主动分配:a平均分配机理:使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝b配对位点分配机理:只有一半数目的质粒呈主动分配其余是随机分配的。随机分配:细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。影响质粒载体稳定性的主要因素:、新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应。质粒载体会加重寄主细胞的代谢负荷外源克隆基因的产物对寄主细胞的毒害作用。、拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响。差度:不同细胞个体之间的质粒载体的拷贝数的差异程度可影响质粒载体丢失的速率。差度越大稳定性越差差度越小稳定性越高。、寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应在野生型的大肠杆菌细胞中质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体它也是造成质粒载体不稳定的原因之一。质粒DNA分子之间的重组频率含质粒寡聚体细胞的生长速率。影响质粒重组的突变也会影响质粒的稳定性。第二节噬菌体载体(Bacteriophage简称phage)一、噬菌体的一般生物特性可脱离寄主细胞生存但不能进行复制。除了对寄主的依赖性还具备其它的功能:、保护自己的核苷酸分子(DNA、RNA)免遭环境化学物质的破坏、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系从而长生出大量的子代噬菌体颗粒、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒噬菌体的结构和其核酸类型:结构:无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、线状体型核酸类型:最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂对寄主的依赖性较低。有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的ATCG组成的。Example:T噬菌体DNA没有C碱基取代的是羟甲基胞嘧啶(HMC)SP噬菌体DNA中没有T碱基取代的是羟甲基尿嘧啶(HMU)。噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程:、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒、释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来噬菌体的溶源生命周期溶源生长周期:是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上成为它的一个组成部分。现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期温和噬菌体:既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。溶源性细菌:具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化:用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合:噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中原噬菌体:在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体超感染免疫性:溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源周期的主要特征:λ噬菌体和P噬菌体λ噬菌体的特征:、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞、经过短暂的转录之后需要合成一种整合酶于是转录活性便被一种阻遏物所关闭、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上变成原噬菌体、细菌继续生长、增值噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。噬菌体P基本特征:不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。溶源噬菌体的诱发:依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割失活使噬菌体转录。需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来使之形成环形的DNA分子恢复溶源周期开始时的状态。二、λ噬菌体载体λphagekbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)溶菌阶段(复制和释放)溶源阶段(整合到寄主染色体上)AWBCDEFZUVGHMLKIJbcIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因尾部基因功能不明区溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因:溶源过程控制基因。λ噬菌体的基因组结构DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~kb)λphagebp‘CGGGGCGGCGACCTCG’’GCCCCGCCGCTGGAGC’CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG’’CGGC’’GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearformVirusesthatcaninfectbacteriakbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)λ噬菌体载体的主要类型插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。替换型载体(取代型载体)具有成对的克隆位点在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。凯伦噬菌体载体插入式载体:λ噬菌体载体相对于质粒载体来说克隆片段较大所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cI基因插入失活:如λgt、λNM等载体在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化产生清晰的噬菌斑。相反产生混浊的噬菌斑。LacZ基因插入失活:如charonA载体在非必须区段引入lacZ基因在lacZ基因上有EcoRI位点插入失活后利用Xgal法筛选(兰白筛选)。cIEcoRILARAλgtlacZLARAEcoRICharonAλ替换型载体(取代型载体)外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(~kb)高感染效率(转化株ug载体DNA,比质粒高倍)egEMBL,DASH替换式载体野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的外源DNA可以取代这一片段例如CharonA、λEMBL、Charon等载体这些载体是用Lac(乳糖操纵子的大部分系列包括完整的LacZ)替换入噬菌体的中间区段同时将Lac作为选择标记使用时用EcoRI水解去掉中间的片段再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后感染Ecoli使之在Ecoli内繁殖并裂解Ecoli形成空斑。换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。LacEcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharonAEMBLCharon替换型载体克隆外源DNA的步骤应用适当的核酸内切酶消化λ载体除去可取代的DNA片段将上述所得的λDNA载体臂同外源DNA片段的连接对重组体的λDNA分子进行包装和增殖以得到有感染性的λ重组噬菌体λ取代载体组装连接侵染体外包装λ噬菌体DNA体外重组后一般必须经过体外包装然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入Ecoli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达~μgDNA而以转染(translation)的方式导入的频率仅为~μgDNA。λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA(约kb)的~。凯伦噬菌体载体既有插入型又有替换型在基因工程实验中的用途十分广泛承受外源DNA的能力:几个kb到kb(左右臂连接)(三段自身连接)(插入片段)根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选三、单链DNA噬菌体载体(M)单链DNA噬菌体载体M、f、fd。优越性:单链DNA噬菌体的复制是以双链环形的DNA为媒介的这种复制形式的DNA简称RFDNA不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌单链DNA噬菌体颗粒的大小是受其DNA的多制约的不存在包装限制问题容易测定外源DNA片断的插入取向可产生含外源片断的单链DNA分子。M噬菌体载体M是一种含单键()DNA(ssDNA)的丝状大肠杆菌噬菌体其基因组大小为kb。这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段这种单链DNA片段在遗传学研究中主要用来测定DNA序列(sanger双脱氧法)、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。M噬菌体的特点感染Ecoli后在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA(replicationformDNA,RFDNA)。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染Ecoli的F细胞这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RFDNA或ssDNA都能转染Ecoli的F或F细胞。噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的这一点正好与λ噬菌体相反。所以M噬菌体并不存在包装限制的问题。M单链DNA噬菌体的生命周期RFDNAPhageMreplicationinthehostcell:NickedbygeneproteinssRollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgeneproteinGeneproteinisreplacedbygeneproteinectLinearMphagereleasedfromthecellM载体具有多克隆位点(MCS)方便克隆。许多M载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的在克隆位点选择上更为方便。可以定向地克隆DNA片段克隆在MRFDNA分子上的双链DNA片段到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离DNA分子中的双链则需要两种独立的克隆。根据M的生物学特性知道M子代噬菌体中总是只含有(+)链所以M载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链则完全取决于外源DNA克隆时的取向。这样一来为分别分离外源DNA分子的两条链带来一定的麻烦解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。BluewhiteselectionM载体系列的优点在这类载体的基因组中有一条饰变的β半乳糖苷酶基因片段(Hind片段)其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列M载体系列是应用基因工程技术成对地构建的可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。MmpMCSMmpMCSEcoRIBamHIHindIIIPstIBglIBglIPstIHindIIIBamHIEcoRIBPPBBPBPBPBamHIPstIM克隆载体分子结构图四、噬菌粒载体噬菌粒载体由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等方便DNA的操作可在细胞内稳定存在又具有单链噬菌体的复制起点在辅助噬菌体的存在下可进行噬菌体的繁殖产生单链的子代噬菌体。常用的噬菌粒载体pUC和pUC具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA可克隆kb的外源DNA片段并易于进行分离与操作编码一个ampr基因作为选择记号因此只有携带pUC或pUC噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长便于转化子的选择拷贝数含量高每个寄主可高达个所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物便可制备出大量的载体DNA存在着一个多克隆位点区因此许多种不同类型的外源DNA片段不经修饰便可直接插入到载体分子上由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的’端编码区可按照IPTG组织化学显色反应试验筛选重组子lacZ基因是置于lac启动子的控制之下这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达含有质粒的复制起点在没有辅助噬菌体的情况下克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式复制形成大量的双链DNA分子带有一个M噬菌体的复制起点在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中可以合成出单DNA拷贝并包装成噬菌体颗分泌到培养基中在pUC和pUC这两个载体中多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA另一个则可转录出负链DNA可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。pBluescript噬菌粒载体基本结构:在多克隆位点的两侧有一对T和T噬菌体的启动子可以定向指导外源基因的转录活动同时具有一个单链噬菌体M或f的复制起点和一个来自ColE质粒的复制起点在不同的情况下可以采取不同的复制形式分别合成单链或双链的DNA编码有一个胺苄青霉素抗性基因供作转化子记号含有lacZ基因可用XgalIPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。TT用于体外转录五、柯斯质粒载体柯斯质粒载体cosmid载体:也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体它是由λ噬菌体的cos(cohesive)末端及质粒(plasmid)重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等因此该载体在体外重组后可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。柯斯质粒载体的特点具有λ噬菌体的特性具有质粒载体的特性具有较高容量的克隆能力具有与同源性序列的质粒进行重组的能力C)PackagingandinfectFormationofacosmidcloneLigationtocleavedcosmidvectormoleculescanproducevectortargetconcatemers,resultinginalargeexogenousDNAfragmentflankedbycossequences②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段会影响实验结果的分析后来专门选出~kb的外源DNA插入载体DNA此时每个载体只可能插入一个外源片段因为如果二个片段则将超过包装成噬菌体颗粒的限度③细菌的菌落体积远大于噬菌斑因此如用柯斯质粒制备基因文库则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等所以最常使用的还是噬菌体载体。六、其他载体  酵母人工染色体载体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体(如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒)人基因组十分庞大约含×bp建立和筛选人的基因组文库要求有容量更大的载体酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒(telesome)、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列可插入长度达kb的外源DNA导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆成为人基因组研究计划的重要CEN,centromeresequenceTEL,telomeresequencesARS,autonomousreplicatingsequenceAmp,geneconferringampicillinresistanceori,originofreplicationforpropagationinanEcolihostThevectorisusedwithaspecializedyeasthostcell,AB,whichisredcoloredbecauseitcarriesanochremutationinagene,ade,involvedinadeninemetabolism,resultinginaccumulationofaredpigmentHowever,thevectorcarriestheSUPgene,asuppressortRNAgenewhichovercomestheeffectoftheadeochremutationandrestoreswildtypeactivity,resultingincolorlesscoloniesThehostcellsarealsodesignedtohaverecessivetrpanduraalleleswhichcanbecomplementedbythecorrespondingTRPandURAallelesinthevector,providingaselectionsystemforidentifyingcellscontainingtheYACvectorCloningofaforeignDNAfragmentintotheSUPgenecausesinsertionalinactivationofthesuppressorgenefunction,restoringthemutant(bluecolor)phenotypethecapacitytoclonelargeexogenousDNAfragments(uptoMb)hasmadeYACsavitaltoolinphysicalmappingThefunctionalelementsofayeastchromosome正常酵母人工染色体含有:*四膜虫端粒(tel)*酵母自主复制序列(ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP、URA)YAC载体BAC载体Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNACMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistanceoriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumbercosNisthecossitefromlphageHindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinsertedThetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragmentTheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragmentPAC载体n

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