地中海贫血治疗-2011

V01．3INo．IJan．20ll 上海交通大学学报(医学版) JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience) ·9· [文章编号]1674—8115(201I)01—0009—06 2型重组腺相关病毒介导的B一地中海贫血基因 田 晶1”。 王峰L2，薛金凤Ⅵ， 赵霏L2， (1．中南大学湘雅医学院生理学系血液生理研究室，长沙 科大学南方医院妇产科，广州510515) ·论 著· 3厶!冉 ，口7』实验 钟梅3，宋柳江k2，谭孟群1’2 410078；2．深圳湘雅生物医药研究院，深圳518057；3．广州南方医 [摘要]日的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染霞型p一地中海贫血患者造血细胞．通过体外途径基因治疗地中海 贫血。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 6只BALB／c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(，I=2)，经x射线照射后．分别移植入经rAAV2B一珠蛋白病毒转 染(MOI=50)或未转染的p4。。42／p“杂合子型重型p一地中海贫血流产胎儿造血细胞．转染后第28天和第70天分别处死rAAV2 转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT．PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人p～珠蛋白基因 在小鼠骨髓中的表达，并以高压液相色谱法量化 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 受体小鼠外周血中人B一珠蛋白肽链的水平。结景①RT—PCR于所有受体 小鼠样本中均可检测到人p—actin和人p一珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中，134。”突变基因稳定表达于所有受体小鼠．p⋯ 突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到；移植后第28天，rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于 B”4突变基因的正常p一珠蛋白基因表达；但至移植后第70天，仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍町检测到rAAV2一B-globin载体 介导的正常B一珠蛋白基冈表达。③移植后第70天处死的转染小鼠外周血中人B链／d链分别为0．328和0．325．相对未转染 组0．135的比值，两者的增加百分比高达144．78％和142．54％。结论经rAAV2介导基因修饰后的重型B一地中海贫血患者造 血细胞在体内町长期稳定表达正常人B一珠蛋白基因，而其分化产生的外周血人红系细胞内p一珠蛋白肽链的合成增加。 [关键词]莺组腺相关病毒；B一地中海贫血；人造血细胞；基冈治疗 [DOI]10．3969／j．issn．1674—8115．2011．0t．003[中图分类号]R556．61；Q78；R一332【文献标志码]A Recombinantadeno·associatedvirus2-mediatedgenetherapyfor13-thalassemia TIANJing。一，WANGFen91一，XUEJin．fen91一，ZHAOFeil一，ZHONGMei3，SONGLiu—jian91一，TANMeng-qun’·2 rJ．LaboratoryofBloodPhysiology，DepartmentofPhysiology,CentralSouthUniversityXiangyaSchoolofMedicine， Changsha410078，China；2．ShenzhenXiangyaInstituteofBiomedicine，Shenzhen518057，China；3．Departmentof ObstetricsandGynecology,NanfangHospital，SouthMedicalUniversity,Guangzhou510515，China) IAbstract]ObjectiveToinvestigatethetransfectionofrecombinantadeno-associatedvirus2(rAAV2)inhuman hematopoieticstemcellsofpatientswithp—thalassemia，andexplorethefeasibilityofexvivogenetherapyfor13-thalassemia． MethodsSixBALB／cnudemicepretreatedwithX-rayweredividedintorAAV2-transfeetedgroup(n=4)andmock— transfectedgroup(n=2)．Isolatedhumanhematopoieticcellsfromfetuswith13-thalassemiamajorofB4。42／13“heterozygote wereinfectedormockinfectedwithrAAV2—13一globin(MOI=50)，andweretransplantedintoBALB／cnudemice．After transfectionfor28dand70d，miceweresacrificed，RT-PCRandallele·specificPCR(ASPCR)wereappliedtodetectthe expressionofrAAV2一mediated13-giobingeneinmousebonemarrowcells，andthelevelsof13一globinchainsinperipheral bloodofrecipientmicewerequantifiedbyHPLC．Results①Theexpressionofhuman13-actinandB-globingenewas detectedinallrecipientmicebyRT．PCR．②ByASPCR，theexpressionof134。”wasfoundinallrecipientmice，while13”4 inrecipientmiceonday70．Therewasexpressionofnormal13一globingenemainlyfrom13。’4geneinbothgroupsofmiceon day28．However，onday70，rAAV-2mediatednormal13一globingeneexpressionwasfoundonlyintransfectedmice．⑨The human13／ainperipheralbloodoftransfectedmicewere0．328and0．325on70d，144．78％and142．54％higherthan thatofmock—transfectedmice(0．135)．ConclusionrAAV2vectorsgeneticallymodifiedhematopoieticcellsofpatients with13．thalassemiamajorcouldmediatelong-termstableexpressionofnormal13一globingeneinvivo，withsignificantly elevatedexpressionof8一chainsinhumanerythroidcellsinperipheralblood． 【Keywords】recombinantadeno—associatedvirus；13．thalassemia；humanhematopoieticcells；genetherapy [基金项目】国家科学自然基金(30470743，30971299)；国家“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09503·019)；教育部高等学校博十点基金 (20040533031)(NationalNaturalScienceFoundationofChina，30470743，30971299；SpecialFoundationforStateMajorNewDrugResearchProgramof China．2009ZX09503．019：FoundationforUniversityDoctoratefromTheMinistryofEducationofChina，20040533031)。 [作者简介]田晶(1980一)，女．博上生；电子信箱：jingtianll7@yahoo．corn．cn。 【通信作者]谭孟群，电子信箱：mqtan26@hotmail．corn。 万方数据 上海交通大学学报(医学版) 成人血红蛋白是由两对仅肽链与两对B肽链组 成的四聚体分子，正常情况下机体中a链与B链合 成处于平衡状态；但当B一珠蛋白基因发生突变，B 链合成减少或缺失，仪链与B链之间平衡失调，则会 导致B一地中海贫血【“。基因治疗B一地中海贫血 基本策略为通过病毒载体向B一地中海贫血患者B 基因缺陷的造血干／祖细胞中导入正常的珠蛋白基 因，使得转基因在造血干／祖细胞分化的红系细胞中 获得持续的高水平表达，达到长期治疗效果。目前， 重组腺相关病毒载体(recombinantadeno—associated virus，rAAV)以其理化性质稳定、宿主范围广、介导外 源基因表达稳定以及可同时感染分裂期与非分裂期 细胞等优点，越来越多地被应用于多种疾病的基因 治疗研究中口。。。 前期实验中，我们已证实携带人B一珠蛋白基因 及微小基因座控制区(minilocuscontrolregion， miniLCR)调控序列的2型重组腺相关病毒(recombi— nantadeno—associatedvirustype2，rAAV2)载体可有效 转染来源于B一地中海贫血患者的造血细胞H1。在 此基础上，本研究进一步观察了rAAV2介导的外源 性人B一珠蛋白基因在受体小鼠体内的长期表达情 况，并采用高压液相色谱(highperformanceliquid chromatography，HPLC)分析检测受体小鼠外周血中 人B一珠蛋白肽链水平，从蛋白质水平评价地中海贫 血的基因治疗效果，以深入探讨携带人8一珠蛋白基 因及miniLCR调控序列的rAAV2病毒载体对B一地 中海贫血患者造血细胞的转染效率及其应用于临床 试验研究的可行性。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1．1材料 1．1．1标本及实验动物B41。42／[3654杂合子型24周 龄重型B一地中海贫血流产胎儿标本来源于广州南 方医院，标本采集获得家属或孕妇知情同意。6只6 —8周龄BALB／c裸小鼠购自广州中医药大学实验 动物中心；实验动物生产许可证号为SCXK(粤)2008 —0020，使用许可证号为SYXK(粤)2008—0085。 1．1．2主要试剂及仪器TRIz01分离液、逆转录试剂 盒、Ficoll淋巴细胞分离液(Takara)；DNA抽提试剂盒、 PCR试剂盒(上海生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司)；三氟乙酸(tri— fluoroaceticacid，TFA)、HPLC级乙晴(Fisher)；HPLC 仪(Waters)；样品过滤器和溶剂过滤器(Millipore)。 1．2方法 1．2．1胎儿骨髓单个核细胞的转染及移植无菌 条件下，用1．077g／mL的淋巴细胞分离液分离出流 产地中海贫血胎儿的骨髓单个核细胞，以MOI=50 的rAAV2／[3一珠蛋白分别转染107个骨髓单个核细 胞，6只BALB／c裸小鼠经200cGyX射线照射预处 理后，4只转染组小鼠自尾静脉注射入转染的单个核 细胞，2只未转染组小鼠注射入数目相同的未转染骨 髓单个核细胞；分别于移植后第28天和第70天处死 转染和未转染组受体小鼠，每个时间点1只小鼠。 1．2．2RT．PCR检测人B一珠蛋白基因以RT— PCR检测受体小鼠骨髓样本mRNA，所用鼠B—actin、 鼠B一珠蛋白基因、人B—aetin、人B一珠蛋白基因特 异性引物和PCR条件参照我们的前期研究[41。PCR 产物以l％琼脂糖凝胶电泳分离后，Bio—Rad凝胶成 像系统拍照，Quantityone图像分析软件测定人B一 珠蛋白基因与人B-actin电泳条带的积分光密度值 (integralopticaldensity，IOD)，并以两者的IOD比值 表示B一珠蛋白基因表达强度。 1．2．3 等位基因特异性PCR(allele—specificPCR， ASPCR)检测人B一珠蛋白基因ASPCR方法可有 效区分胎儿红系细胞中内源性异常B一珠蛋白基因 表达和rAAV2载体介导的外源性正常B一珠蛋白基 因表达。已知胎儿基因类型为杂合子型B4。。42／[3654， 因此设计分别与正常B一珠蛋白基因和B4卜42突变 基因特异性互补的上游引物A和B，以及两者共同 的下游引物CHl。其中与正常B一珠蛋白基因互补 的引物对A+C可特异性扩增rAAV2介导的正常 p一珠蛋白基因与p”4突变基因表达，而与1341。42突 变基因互补的引物对B+C则特异于B41。42突变基因 的表达。以提取的受体小鼠骨髓细胞mRNA为模 板，特异性扩增人B一珠蛋白各等位基因片段，3％琼 脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。 1．2．4HPLC检测受体小鼠外周血中人B一珠蛋白 肽链 分别取EDTA抗凝的正常人和受体小鼠外周 血离心去血浆，加生理盐水洗涤细胞3次，按红细胞 体积加入1．4倍体积蒸馏水和0．4倍体积四氯化碳， 剧烈振荡5min，离心沉淀，吸取上清血红蛋白液经 0．45tun滤膜过滤。作HPLC分析时，吸取血红蛋白液 50pL，加流动相A液200IIL稀释至250IxL，充分摇匀， 进样5汕。色谱柱为VydacCA不锈钢柱(250mmx 4．6mmid，4斗m)，流动相A：V永：V乙-=60：40，B： V术：V乙腈=64：36，A和B分别加入0．1％三氟乙酸。 流速lmL／min，用二元线性梯度洗脱，洗脱梯度见 表l。检测波长为220am，室温操作。同时以 200—400am紫外光谱图进行物质成分分析，以建立 万方数据 田 晶，等：2型重组腺相关病毒介导的13一地中海贫血基因治疗实验 HPLC检测受体鼠外周血中人血红蛋白的方法。 裹1 HPLC流动相洗脱梯度 TabI GradientsofmobilephasesusedinIlPLC 2结果 2．1人B一珠蛋白基因的表达 分别提取转染组和未转染组小鼠骨髓细胞 mRNA进行RT—PCR扩增，所检测到的鼠13一actin(380bp) 和B一珠蛋白基因(252bp)表达提示mRNA样本质 量完好。移植后第28天和第70天分别处死的6只 受体鼠样本中均可检测到人8一actin(538bp)和人 B一珠蛋白基因(272bp)表达的特异性片段，表明成 功移植入裸鼠体内的胎儿造血细胞具有转录活性， 可表达人B一珠蛋白，其中包括rAAV2介导的正常 B一珠蛋白基因。移植后第28天处死的1只转染小 鼠样本中扩增产生的特异性条带相对较弱，提示该 受体鼠中胎儿细胞植入率相对较低(图1)。灰度扫 描结果显示，在移植后早期，转染组小鼠与未转染组 小鼠体内人B一珠蛋白基因的表达水平无明显区别； 至移植后第70天，随着rAAV2介导的B一珠蛋白转 基因表达量逐步增加，转染组小鼠体内人p一珠蛋白 基因的表达较未转染小鼠明显提高(图2)。 A．鼠B—aetln13一珠蛋白基因；B．人13-actin和B一珠蛋白基因。M．100bpDNAladdermarker；1，2．rAAV2转染小鼠(第28天)；3．未转染小鼠 (第28天)；4，5．rAAV2转染小鼠(第70天)；6．未转染小鼠(第70天)；7．阳性对照；8．阴性对照。 圈l RT-PCR检测鼠与人pactin和13一珠蛋白基因在受体小鼠骨髓中表达 Fig1 RT-PCRanalysisofmousearhamanpactinandlt-globingeneinbonemarrowofrecipientmice 窭 龆 瓣 日转巍枣簸 舀转瓤夺鼠 圈未转巍小鼠 第28天 第70天 圈2人13一珠蛋白基因在移植后第28天、第70天受体小曩骨■中 的表达水平(n=3) Fig2 Relativelevelsofhaman争globingeneexpressioninbone marrowofrecipientmiceaRday23and70aftertramfectton (n=3) 2．2正常人B一珠蛋白基因的表达 ASPCR检测中，突变基因B41—2的表达可为引物 对B+C扩增产生的282bp特异性片段所证实，而 引物对A+C可同时扩增B”4(355bp)突变基因片 段与rAAV2载体转导入的正常B一珠蛋白基因 (282bp)片段。结果显示B41。42突变基因稳定表达 于所有受体小鼠，8”4突变基因仅在移植后第70天处 死的1只转染小鼠与1只未转染小鼠样本中被检测 到；移植后第28天，rAAV2转染小鼠及未转染小鼠骨 髓样本中均可检测到正常B一珠蛋白基因的表达；至 移植后第70天，未转染小鼠样本中引物对A+C所特 异性扩增的282bp条带消失，而2只rAAV2转染小鼠 体内仍可检测到正常B一珠蛋白基因的表达(图3)。 2．3受体小鼠外周血中人B一珠蛋白肽链的表达 HPLC检测受体小鼠外周血血红蛋白，观察到在 确立的实验条件下小鼠各血红蛋白肽链无法分离； 而人的各血红蛋白肽链(特别是d链和B链)则被完 们”始巧加”如必。 万方数据 上海交通大学学报(医学版) 全解离开，峰形较为对称，且保留时间长于鼠血红蛋 白，出峰在其后(图4)。随后采用二极管阵列检测器 对200～400Ilm范围内的正常人及受体小鼠外周血 中各珠蛋白肽链的紫外吸收光谱进行比对分析，结 果显示受体小鼠样本中人B和a肽链的光谱最大吸 收峰位置和峰形分别与正常人样本中的B和仅肽链 相近，证实两样本间各自相近的吸收峰代表着同一 种物质(图5)，说明所建立的HPLC检测方法可有效 区分受体小鼠外周血中鼠与人的血红蛋白，并通过 人Ot链与13链峰面积的计算量化分析人13一珠蛋白 肽链表达水平的变化。移植后第28天处死的3只受 体鼠血红蛋白样本HPLC中未能检测到明显的人血 红蛋白表达，提示分化成熟释放入外周血中的人红 系细胞数量有限；随着造血干细胞的进一步分化成 熟，外周血中红系细胞逐渐累积增加，使得移植后第 70天处死的3只受体鼠体内成功检测到人血红蛋白 表达，其中2只转染小鼠外周血中人B链／a链分别 为0．328和0．325，相对未转染小鼠0．135的比值， 两者的增加百分比高达144．78％和142．54％，与 RT-PCR灰度扫描结果一致。 注：引物对A+C和引物对B+C分别特异于正常及134。42突变珠蛋白基因。M．100bpDNAladdermarker；1，2．rAAV2转染小鼠(第28天)； 3．末转染小鼠(第28天)；4，5．rAAV2转染小鼠(第70天)；6．未转染小鼠(第70天)；7．正常人样本。 国3 ASPCR法分析人B一珠蛋白各等位基因在小鼠体内的表达 Fig3 ASPCRanalysisofhamanpglobinallellegenesinmice 之 、 型 兴 馨 时间／tn面 23 l9 1．5 1．1 O7 O3 l l 式； 篓t，s 螫O3 01 R2 l ^3 l f砒人。——k、-一 0 4 8 12 16 20 24 2832 O 2 4 6 8 10 1214161820 ．时蝴，m缸 时间／I曲 A，B．转染小鼠；C．未转染小鼠。1．溶剂峰；2．血红素峰；3．鼠血红蛋白；4．人B一珠蛋白肽链；5．人n一珠蛋白肽链。 图4受体裸鼠外周血血红蛋白肽链分离色谱图 Fig4 Chromatographyofhemoglobinsisolatedfromredbloodcellsfromrecipientmice 《 越 娄限5 O 毫 越1o 巢 整0 2fX) 220 24(J 260 280 300 320 波长／m l 5 墓 l o、 越 芸05 整 O 乏1．0 、 越 巢 餐0 2(KJ 220 240 2“J 2掰) 3(XJ 320 波长／nm 200 220 240 260 280 300 320 200 220240 260 280 300 320 波长，nnl 波长，nln Al，A2．正常人外周血中a一珠蛋白肽链和B一珠蛋白肽链；BI，B2．受体小鼠外周血中人a一珠蛋白肽链和13一珠蛋白肽链。 田s HPLC紫外光谱分析正常人和受体小■的血红蛋白 FigS HPLCultravialet叩雠tmmanalysisofhemoglobinsfromnormalhumanandrecipientmice 万方数据 田 晶，等：2型重组腺相关病毒介导的B一地中海贫血基因治疗实验 3讨论 B一地中海贫血基因的治疗目的是要重建人a 与B一珠蛋白肽链之间的平衡，本实验拟通过rAAV2 载体介导外源性正常人B一珠蛋白基因转移入地中 海贫血胎儿造血细胞内，以替代其病变的B一珠蛋白 基因，合成正常的B一珠蛋白肽链，从而减少Ot肽链 的相对过剩，减轻相应临床症状。 实验中首先采用常规RT—PCR证明：rAAV2转染 或未转染的胎儿造血细胞成功移植入小鼠骨髓中， 且该细胞具有转录活性表达人13一珠蛋白基因；而灰 度扫描结果显示：移植后第70天转染组受体小鼠体 内人B一珠蛋白基因表达水平相较于未转染组小鼠 均明显增加。本研究结果发现：B一地中海贫血患者 突变的8一珠蛋白基因可表达异常mRNA，并且因基 因缺失片段较短，通过常规RT—PCR无法将该突变基 因与rAAV2介导的正常珠蛋白基因表达相区分。因 此，我们引入了ASPCR法，基本原理为将突变与正 常基因间的碱基差异设计在引物的3’末端，当模板 与引物完全互补时，引物从3’端开始链的特异性延 伸，反之则PCR无法扩增，最后结合高浓度琼脂糖凝 胶电泳区分正常基因与突变基因的表达口q1。本实 验中，胎儿基因突变类型为B4“42／136“杂合子型，即 地中海贫血患者一条染色体上B一珠蛋白编码基因 中CD41．42位点发生四核苷酸的缺失(TCTT)，B链 第58位转变为终止密码子，无法继续B链的合成， 而另一条染色体上B一珠蛋白编码基因中第二内含 子654位点处发生单个碱基突变(C—T)，造成剪接 位点改变，一段长73bp的序列以外显子形式插入 8一珠蛋白基因mRNA中¨q’。相应地，ASPCR扩增 引物设计为分别特异于正常13一珠蛋白基因和 B”“2突变基因的上游引物A和B，以及两者共同的 下游引物C，两条上游引物仅最后几位碱基存在 差异。 腺相关病毒(adeno—associatedvirus，AAV)属细 小病毒科，基因组为正链或负链单链线性DNA，全长 约4．7kb。AAV具有无致病性和弱免疫原性，能同 时感染分裂期与静止期细胞，特别是可通过整合至 宿主细胞染色体上介导转基因的长期稳定表达。研 究旧。结果表明：AAV单链基因组在靶细胞内需首先 通过合成第二条互补链转变成具有转录活性的双链 DNA才能免于被胞内蛋白酶降解，导致AAV介导的 外源性基因表达具有～定的滞后性，往往转基因表 达起始时间可被延长几周至几个月；因此，本实验在 移植后早期，胎儿造血细胞8一珠蛋白表达主要来源 于自身突变的B654和B4卜42基因，使得转染组与未转 染组小鼠之间的基因表达类型和水平相近。已知 13”4型突变基因可表达少量的正常B一珠蛋白，而在 重型地中海贫血患者骨髓早期有核红系细胞中B一 珠蛋白基因表达具有代偿特点，即非突变基因的合 成被极大加强¨⋯。由此推测移植后第28天，转染组 与未转染组受体鼠体内所检测到的正常B一珠蛋白 基因表达均主要来自于B654突变基因，而B654基因的 异常表达受到竞争性抑制而减少，甚至难以被检测 到，具体原因仍有待于进一步研究。随着观察时间 延长至移植后第70天，受体鼠骨髓中有核红细胞逐 渐分化成熟，代偿作用减弱，来自于13654等位基因的 正常珠蛋白mRNA水平显著下降，最终无法在未转 染组小鼠体内被检测到。相反，由于AAV双链DNA 合成增加，其携带的转基因在转染组小鼠骨髓内获 得逐渐升高的稳定表达，使得rAAV2转染的受体小 鼠体内仍可检测到正常基因的表达，同时表现出对 B654基因异常表达的部分或全部抑制。与上述不断 变化的B654等位基因表达不同，突变的B4卜42基因稳 定表达于各受体小鼠体内，只是由于这种终点变异 的基因型合成的变异B一珠蛋白基因量较少，使得其 表达水平低于其他等位基因。尽管本实验中人B一 珠蛋白各等位基因表达存在着差异，但移植后第70 天转染组小鼠体内正常珠蛋白基因的表达仍然证明 携带人B一珠蛋白基因的AAV载体成功转染了地中 海贫血患者的造血细胞，且其介导的B一珠蛋白基因 表达至少可持续至移植后第70天。以往地中海贫 血基因治疗研究多局限于纯合子型地中海贫血小鼠 或正常人的造血细胞，关于B一珠蛋白等位基因表达 间的相互作用尚未见相关报道。本实验中ASPCR的 检测结果首次提示人B一珠蛋白等位基因间的表达 水平存在明显差异，且倾向于正常B一珠蛋白基因的 合成，而地中海贫血患者病变基因类型的变化也使 得地中海贫血临床基因治疗中的转基因表达远较我 们想象的复杂，仍有待于进一步研究。 地中海贫血基因治疗的最终目的是要有效提高 红系细胞中正常B一珠蛋白肽链的合成，实验中应用 定量RT—PCR方法虽然可通过检测有核红细胞内珠 蛋白基因mRNA含量在一定程度上反映合成的珠蛋 万方数据 上海交通大学学报(医学版) 白肽链量，但B基因突变所产生的异常mRNA和不 稳定珠蛋白的影响使得二者往往不能等同⋯1。同 时，由于鼠与人血红蛋白间存在着高度的同源性，常 见的Westernblotting与血红蛋白电泳法并不适合于 移植小鼠外周血中人珠蛋白的检测。我们尝试以 HPLC方法对以小鼠为模型的地中海贫血基因治疗 实验中受体鼠外周血人B一珠蛋白肽链的水平进行 量化分析，从蛋白水平探讨基因治疗地中海贫血的 可行性。现阶段HPLC主要运用于临床上各型地中 海贫血的诊断，该方法操作简单，灵敏度高，较常规 电泳具有更高的分辨率，而且重现性好，采用面积归 一法计算也降低了对进样量准确性的要求¨2。1引。 此外，HPLC的运用使整个分析过程自动化和 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化，各珠蛋白肽链能快速彻底地分离，取得的数据可 信度较高。实验中对移植胎儿造血细胞的受体小鼠 外周血血红蛋白进行HPLC分析，结果在同等条件下 相较于鼠血红蛋白肽链的无法分离，人的各类血红 蛋白肽链被彻底分离，且在保留时间上长于鼠血红 蛋白，可与鼠血红蛋白进行区分，同时人B与仅肽链 吸收峰的正确性通过与正常人血红蛋白样本中B与 d肽链紫外吸收光谱对比分析得到证明。已知 HPLC中每一吸收峰的峰面积大小与其所代表的物 质浓度成比例，因此，通过计算机对峰值的自动整合 运算可得出该物质的浓度大小。本实验中我们采用 外标法以人13／a珠蛋白肽链比值反映人13一珠蛋白 肽链的合成情况，观察到移植后第70天转染组小鼠 13／a比值相较于未转染小鼠均明显上升，增加的百分 比高达140％左右，表明rAAV2病毒载体转染可有 效提高人造血细胞中B一珠蛋白基因的表达水平，并 增加外周血人红细胞中6一珠蛋白肽链的含量。 综上所述，rAAV2一B—globin病毒可有效转染杂合 子型地中海贫血患者的造血细胞，介导人B一珠蛋白 基因的体内长期表达，增加人红系细胞内B一珠蛋白 肽链的合成，为AAV载体通过体外一体内途径基因 治疗B一地中海贫血的临床试验提供了更为深入的 实验依据。 【参考文献】 [1]SchechterAN．Hemoglobinresearchand’theoriginsofmolecular medicine[J]．Blood，2008，112(10)：3927—3938． [2]PersonsDA．Thechallengeofobtainingtherapeuticlevelsofgeneti— cailymodifiedhematopoieticstemcellsin13-thalassemiapatients [J]．AnnNYAcadSci，2010，1202：69—74． [3]MuellerC，FlotteTR．Clinicalgenetherapyusingrecombinant adeno．associatedvirusvectors[J]．GeneTher，2008，15(1I)： 858—863． [4]田晶，王峰，薛金风，等．2型腺相荚病毒载体介导正常人p珠蛋 白基因在霞璎地贫流产胎儿造咀细胞中的表达[J】．现代生物 医学进展，2010，10(1i)：2028—2033． [5]NuntakarnL，FucharoenS，FueharoenG，eta1．Molecular，hema— tologicalandclinicalaspeetgofthalassemiamajorandthalassemia intermediaassociatedwithHbE·p-thalassemiain Northeast Thailand[J]．BloodCellMolDis，2009，42(1)：32—35． [6]QuekDL，NgYY，WangW，eta1．Rapidcarrierscreeningfor 8一thalassemiabysingle—stepallele—specificPCRanddetection[J]． ClinBiochem，2007．40(5)：427—430． [7]ZhangW，Caiww，ZhouWP，eta1．Evidenceofgeneconversion intheevolutionaryprocessofthecodon41／42(一Cr丌)mutation causingB—thalassemiainsouthernChina[J]．JMolEvol，2008，66 (5)：436—445． [8】XiesY，BenZR，ZhangJZ，eta1．Restorationofthebalanced alpha／beta-globingeneexpressionin beta654··thalassemiamice usingcombinedBNAiandantisenseRNAapproach[J]．HumMol Genet，2007，16(21)：2616—2625． [9]BrianRS，JeffreySC．Recombinantadeno—associatedvirustransduc— tionandintegration[J]．MolTher，2008，16(7)：1189一1199． [10]SfinounK，SvastiS。ChumworathayeeW，eta1．1mbalancedglobin chainsynthesisdetermineserythroidcellpathologyinthalassemic mice[J]．Haematologlca，2009，94(9)：121I一1219． [11]EfrcmovGD．Dominantlyinherited13-thalassemia[J]．Hemoglobin， 2007，31(2)：193—207． [12]DasguptaT，FabryME，KanlDK。eta1．Antisicklingpropertyof fetalhemoglobinenhancesnitricoxidebioavailabilityandamelio— ratesorganoxidativestressintransgenic·knockoutsicklemice[J]． AmJPhysiolRegulIntegrCampPhysiol，2010，298(2)：Ib94一 R402． [13]WilliamsJP，ScrivensJH，GreenBN，eta1．HbLeedsf beta56 (D7)Gly一>Cys]：anewhemoglobinthataggravatesanemiaina childwithbeta(0)·thalassemiatrait[J]．Hemoglobin，2007，31 (3)：367—373． [收稿日期]2010—10·09 [本文编辑]周珠风 万方数据 2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验 作者： 田晶， 王峰， 薛金凤， 赵霏， 钟梅， 宋柳江， 谭孟群， TIAN Jing， WANG Feng， XUE Jin-feng， ZHAO Fei， ZHONG Mei， SONG Liu-jiang， TAN Meng-qun 作者单位： 田晶,王峰,薛金凤,赵霏,宋柳江,谭孟群,TIAN Jing,WANG Feng,XUE Jin-feng,ZHAO Fei,SONG Liu-jiang,TAN Meng-qun(中南大学,湘雅医学院生理学系血液生理研究室,长沙 ,410078;深圳湘雅生物医药研究院,深圳,518057)， 钟梅,ZHONG Mei(广州南方医科大学南 方医院妇产科,广州,510515) 刊名： 上海交通大学学报（医学版） 英文刊名： JOURNAL OF SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE) 年，卷(期)： 2011,31(1) 参考文献(26条) 1.Brian RS;Jeffrey SC Recombinant adeno-associated virus transduction and integration[外文期刊] 2008(07) 2.Schechter AN Hemoglobin research and the origins of molecular medicine 2008(10) 3.Xie SY;Ren ZR;Zhang JZ Restoration of the balanced alpha/beta-globin gene expression in beta654- thalassemia mice using combined RNAi and antisense RNA approach[外文期刊] 2007(21) 4.Persons DA The challenge of obtaining therapeutic levels of genetically modified hematopoietic stem cells in β-thalassemia patients 2010 5.Zhang W;Cai WW;Zhou WP Evidence of gene conversion in the evolutionary process of the codon 41/42 (-CTTT) mutation causing β-thalassemia in southern China[外文期刊] 2008(05) 6.Mueller C.Flotte TR Clinical gene therapy using recombinant adeno-associated virus vectors 2008(11) 7.Williams JP;Scriveas JH;Green BN Hb Leeds[beta56 (DT)Gly-》Cys]:a new hemoglobin that aggravates anemia in a child with beta (0)-thalassemia trait[外文期刊] 2007(03) 8.田晶.王峰.薛金凤.赵霏.宋柳江.谭孟群 2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血 细胞中的表达 2010(11) 9.Dasgupta T;Fabry ME;Kaul DK Antisickling property of fetal hemoglobin enhances nitric oxide bioavailability and ameliorates organ oxidative stress in transgenic-knockout sickle mice 2010(02) 10.Nuntakam L.Fucharoen S.Fucharoen G Molecular,hematological and clinical aspects of thalassemia major and thalassemia intermedia associated with Hb E-β-thalassemia in Northeast Thailand 2009(1) 11.Efremov GD Dominantly inherited β-thalassemia[外文期刊] 2007(02) 12.Quek DL.Ng YY.Wang W Rapid carrier screening for β-thalassemia by single-step allele-specific PCR and detection 2007(5) 13.Srinoun K;Svasti S;Chumworathayee W Imbalanced globin chain synthesis determines erythroid cell pathology in thalassemic mice[外文期刊] 2009(09) 14.Zhang W.Cai WW.Zhou WP Evidence of gene conversion in the evolutionary process of the codon 41/42 (-CTTT) mutation causing β-thalassemia in southern China 2008(5) 15.Quek DL;Ng YY;Wang W Rapid carrier screening for β-thalassemia by single-step allele-specific PCR and detection[外文期刊] 2007(05) 16.Xie SY.Ren ZR.Zhang JZ Restoration of the balanced alpha/beta-globin gene expression in beta654- thalassemia mice using combined RNAi and antisense RNA approach 2007(21) 17.Nuntakam L;Fucharoen S;Fucharoen G Molecular,hematological and clinical aspects of thalassemia major and thalassemia intermedia associated with Hb E-β-thalassemia in Northeast Thailand 2009(01) 18.Brian RS.Jeffrey SC Recombinant adeno-associated virus transduction and integration 2008(7) 19.田晶;王峰;薛金凤 2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达[期刊论 文]-现代生物医学进展 2010(11) 20.Srinoun K.Svasti S.Chumworathayee W Imbalanced globin chain synthesis determines erythroid cell pathology in thalassemic mice 2009(9) 21.Mueller C;Flotte TR Clinical gene therapy using recombinant adeno-associated virus vectors[外文期 刊] 2008(11) 22.Efremov GD Dominantly inherited β-thalassemia 2007(2) 23.Persons DA The challenge of obtaining therapeutic levels of genetically modified hematopoietic stem cells in β-thalassemia patients[外文期刊] 2010 24.Dasgupta T.Fabry ME.Kaul DK Antisickling property of fetal hemoglobin enhances nitric oxide bioavailability and ameliorates organ oxidative stress in transgenic-knockout sickle mice 2010(2) 25.Schechter AN Hemoglobin research and the origins of molecular medicine[外文期刊] 2008(10) 26.Williams JP.Scriveas JH.Green BN Hb Leeds[beta56 (DT)Gly-》Cys]:a new hemoglobin that aggravates anemia in a child with beta (0)-thalassemia trait 2007(3) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_shdeykdxxb201101003.aspx