下载

1下载券

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术.ppt

核酸分子杂交技术

珍珠
2011-08-02 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《核酸分子杂交技术ppt》,可适用于人文社科领域

第九章核酸分子杂交技术与应用第九章核酸分子杂交技术与应用第一节杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理、变性(denaturation)()定义:在一定的条件下双螺旋之间氢键断裂双螺旋解开形成无规则线团双链解链成为单链。第一节杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理、变性(denaturation)()定义:在一定的条件下双螺旋之间氢键断裂双螺旋解开形成无规则线团双链解链成为单链。()引起核酸变性的因素酸碱热变性剂(尿素)有机溶剂(乙醇)()、变性核酸的特点:粘度下降沉降速度增加浮力上升紫外吸收增加()、变性核酸的特点:粘度下降沉降速度增加浮力上升紫外吸收增加、融解温度:定义:在DNA热变性时其A的升高达最大值一半时的温度。、融解温度:定义:在DNA热变性时其A的升高达最大值一半时的温度。影响Tm的因素:()DNA碱基的组成GC含量越多Tm值越高AT含量越多Tm值越低()溶液的离子强度低离子强度Tm值越低高离子强度Tm值越高()pH值pH值Tm值变化不明显pH<pH>不利于氢键形成()变性剂干扰碱基堆积力和氢键的形成、复性变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素:DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度、复性变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素:DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度、杂交、杂交定义两条来源不同但具有互补序列的核酸按碱基配对原则复性形成一个杂交体这个过程即杂交或称分子杂交。分类DNADNADNARNARNARNA二、核酸探针(一)探针的概念探针(probe)指能与特定靶分子发生特异性相互作用并能被特殊方法所检测的分子。例如抗原抗体、生物素亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记(同位素或非同位素标记)的核苷酸链。二、核酸探针(一)探针的概念探针(probe)指能与特定靶分子发生特异性相互作用并能被特殊方法所检测的分子。例如抗原抗体、生物素亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记(同位素或非同位素标记)的核苷酸链。(二)探针种类和选择探针种类()基因组DNA探针为某一基因的全部或部分序列或某一非编码序列。()cDNA探针以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。()RNA探针以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率但易于降解和标记方法复杂。()寡核苷酸探针(二)探针种类和选择探针种类()基因组DNA探针为某一基因的全部或部分序列或某一非编码序列。()cDNA探针以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。()RNA探针以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率但易于降解和标记方法复杂。()寡核苷酸探针探针的选择高度特异性一般探针越长杂交作用越强其专一性也越强。 探针的选择高度特异性一般探针越长杂交作用越强其专一性也越强。 三、探针标记原理与方法理想的探针标记物应具备①高度的敏感性②标记物与探针结合后不影响杂交时碱基配对及探针分子的主要理化性质③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性绿低外尚需考虑环境污染少价格低④若用酶促方法标记应对酶的Km值影响不大以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。三、探针标记原理与方法理想的探针标记物应具备①高度的敏感性②标记物与探针结合后不影响杂交时碱基配对及探针分子的主要理化性质③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性绿低外尚需考虑环境污染少价格低④若用酶促方法标记应对酶的Km值影响不大以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。(一)、标记物放射性同位素标记物非放射同位素标记物(一)、标记物放射性同位素标记物非放射同位素标记物放射性同位特点:●放射自显影技术检测信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点射线对人体有伤害放射性物质需特殊的处理半衰期短不宜存放使用放射性同位特点:●放射自显影技术检测信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点射线对人体有伤害放射性物质需特殊的处理半衰期短不宜存放使用非放射性标记物常用的有地高辛(digoxigeninDig)、生物素(biotin)、荧光素。特点:敏感性不如同位素标记稳定性和分辨率高检测时间短操作简便不需特殊的防护设备不存在放射性污染非放射性标记物常用的有地高辛(digoxigeninDig)、生物素(biotin)、荧光素。特点:敏感性不如同位素标记稳定性和分辨率高检测时间短操作简便不需特殊的防护设备不存在放射性污染(二)放射性同位素标记法探针标记法酶反应法化学反应法常用标记探针的同位素PHSIIC(二)放射性同位素标记法探针标记法酶反应法化学反应法常用标记探针的同位素PHSIIC全程标记、随机引物法(randompriming)利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。将寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火使该片段随机互补结合在单链分子上在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下以同位素标记的dNTP为原料寡核苷酸为引物的’OH端开始沿’至’方向合成一条与模板互补的新DNA链。全程标记、随机引物法(randompriming)利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。将寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火使该片段随机互补结合在单链分子上在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下以同位素标记的dNTP为原料寡核苷酸为引物的’OH端开始沿’至’方向合成一条与模板互补的新DNA链。、切口平移法◆胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口切口处形成’OH末端。◆大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用以另一条DNA链为模板。◆种三磷酸脱氧核苷酸为原料沿切口水解’端核苷酸和’端修复加入标记核苷酸同时进行切口平行推移。生成的两条链都被同位素均匀标记。、切口平移法◆胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口切口处形成’OH末端。◆大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用以另一条DNA链为模板。◆种三磷酸脱氧核苷酸为原料沿切口水解’端核苷酸和’端修复加入标记核苷酸同时进行切口平行推移。生成的两条链都被同位素均匀标记。大肠杆菌DNA聚合酶I()’’聚合酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I()’’聚合酶活性()’’外切酶活性()’’外切酶活性()’’外切酶活性、全程RNA探针标记、化学法全程标记、全程RNA探针标记、化学法全程标记末端标记法末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的’端或’端的一类标记法。 ’端标记法’端标记法末端标记法末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的’端或’端的一类标记法。 ’端标记法’端标记法()’端标记法(T噬菌体多苷酸激酶)用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链’末端的磷酸基团使其成为’OH然后在(γP)ATP存在下经T噬菌体多苷酸激酶催化将γ位上的P转移到DNA或RNA分子的’OH末端使DNA片段或RNA或寡核苷酸’端均带P标记。()’端标记法(T噬菌体多苷酸激酶)用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链’末端的磷酸基团使其成为’OH然后在(γP)ATP存在下经T噬菌体多苷酸激酶催化将γ位上的P转移到DNA或RNA分子的’OH末端使DNA片段或RNA或寡核苷酸’端均带P标记。()’端标记法(大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段)大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段有’→’DNA聚合酶和微弱的’→’外切酶活性但无’→’外切酶活性。对残缺’末端可进行标记。()’端标记法(大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段)大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段有’→’DNA聚合酶和微弱的’→’外切酶活性但无’→’外切酶活性。对残缺’末端可进行标记。kDkD苦草杆菌蛋白酶裂解全酶’’外切酶’’聚合酶’’外切酶’’聚合酶’’外切酶Klenow片段DNA聚合酶I全酶四、杂交与杂交后检测四、杂交与杂交后检测(一)核酸分子与固相介质的结合、支持介质的类型和性质硝酸纤维薄膜:本底低易检测杂交信号对小于碱基的核酸结合力低脆性大易破裂。尼龙膜和带电荷的尼龙膜:耐用结合力强但其本底高。(二)核酸分子的转移(二)核酸分子的转移、噬菌体克隆的转移、从凝胶上转移DNA、从凝胶上转移DNA()毛细转移()真空转移()电转移(三)核酸的固定(三)核酸的固定、烘烤℃小时、紫外光固定、碱固定(四)杂交(四)杂交、预杂交()目的:减少非特异性杂交()成分:去污剂:SDS(可促进溶液对薄膜的覆盖可抑制RNase酶活性)封闭剂:Denhard氏溶液、杂交、杂交影响杂交的因素()影响长探针杂交的因素)影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素◇核酸分子浓度与杂交速率◇高浓度双链探针的杂交◇碱基组成:探针的Tm高杂交速率快◇盐浓度:离子强度与杂交速率成正比与杂交稳定性也成正比。◇温度:与杂交速率成正比。◇甲醛:可降低Tm值。◇错配的核酸序列:错配降低杂交速率。◇杂交的加速剂影响长探针杂交的因素影响长探针杂交的因素)酶联探针)杂交反应体积)杂交时间、洗脱、洗脱除去溶液未反应的探针与滤膜疏松结合的探针非特异性结合的探针(五)杂交信号的检测(五)杂交信号的检测放射自显影非放射性杂化分子的检测五、分子杂交技术液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片(一)液相分子杂交将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中在一定条件下(溶液的离子强度、温度、时间等)进行杂交然后再将未杂交的探针除去即得到杂交后的核酸分子。五、分子杂交技术液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片(一)液相分子杂交将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中在一定条件下(溶液的离子强度、温度、时间等)进行杂交然后再将未杂交的探针除去即得到杂交后的核酸分子。(二)固相分子杂交将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上而标记的探针则游离在溶液中进行杂交反应后使杂交分子留在支持物上故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去留在膜上的杂交分子容易被检测能防止靶DNA的自我复性故被广泛应用。(二)固相分子杂交将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上而标记的探针则游离在溶液中进行杂交反应后使杂交分子留在支持物上故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去留在膜上的杂交分子容易被检测能防止靶DNA的自我复性故被广泛应用。、菌落杂交用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤:菌落平板培养滤膜灭菌后放到细菌平板上菌落粘到滤膜上滤膜放到杂交液中探针杂交检测、菌落杂交用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤:菌落平板培养滤膜灭菌后放到细菌平板上菌落粘到滤膜上滤膜放到杂交液中探针杂交检测、Southern印迹杂交膜上检测DNA的杂交技术年由EdwinSouthern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。、Southern印迹杂交膜上检测DNA的杂交技术年由EdwinSouthern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。、Northern印迹杂交应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小其方法类似于Southern印迹杂交。、Northern印迹杂交应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小其方法类似于Southern印迹杂交。、点杂交和狭缝杂交、点杂交和狭缝杂交(三)原位杂交、定义:将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交(hybridizationinsitu)。、操作步骤:载片的清洁与处理组织与细胞的固定探针湿盒(三)原位杂交、定义:将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交(hybridizationinsitu)。、操作步骤:载片的清洁与处理组织与细胞的固定探针湿盒HPVFISH(四)基因芯片技术是集成化的核酸分子杂交技术。(四)基因芯片技术是集成化的核酸分子杂交技术。TheEnd TheEnd 

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/65

核酸分子杂交技术

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利