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细胞培养的基本技术.pdf

细胞培养的基本技术

滴水藏海 2011-07-20 评分 0 浏览量 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《细胞培养的基本技术pdf》,可适用于自然科学领域,主题内容包含细胞培养基本技术ustcwhmustceducnhttp:ioiustceducn在授课程细胞生物学原理与技术PPT下载无菌操作技术体外培养细胞缺乏符等。

细胞培养基本技术ustcwhmustceducnhttp:ioiustceducn在授课程细胞生物学原理与技术PPT下载无菌操作技术体外培养细胞缺乏抗感染能力所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室若实验者粗心大意技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)无菌(asepsis)无菌技术无菌操作(antiseptictechnique)TermstorememberTermstoremember:无菌操作技术工作环境及表面的处理细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理实验者的操作技术培养液的处理无菌技术概念无菌技术无菌区非无菌区相对无菌区无菌物品污染物品是指在医疗、护理操是指在医疗、护理操作过程中防止一切作过程中防止一切微生物侵入人体和防微生物侵入人体和防止无菌物品、无菌区止无菌物品、无菌区域被污染的技术。域被污染的技术。是指经过灭菌处理是指经过灭菌处理且未被污染的区域。且未被污染的区域。是指未经过灭菌处理是指未经过灭菌处理或虽经过灭菌处理或虽经过灭菌处理但又被污染的区域。但又被污染的区域。是指无菌物品自无菌是指无菌物品自无菌容器内一经取出就容器内一经取出就认为是相对无菌不认为是相对无菌不可再放回。可再放回。无菌区边缘向内无菌区边缘向内cmcm为相对无菌区。为相对无菌区。是指经过物理或化学是指经过物理或化学方法灭菌后保持无菌方法灭菌后保持无菌状态的物品。状态的物品。是指未经处理或消毒是指未经处理或消毒灭菌后又被碰脏的物灭菌后又被碰脏的物品。品。【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内然后开始消毒。这可以避免开始实验后因物品不全往返拿取而增加污染机会。、实验时间与地点、实验目的、实验材料、实验方法、实验结果、结果分析与讨论【操作野消毒】无菌培养室每天都要用的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)紫外线照射消毒min超净工作台台面每次实验前要用%酒精擦洗。然后紫外线消毒min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时可穿着细胞培养室内紫外线照射min的清洁工作服。在利用超净台工作时因整个前臂要伸入箱内应着长袖的清洁工作服并于开始操作前要用%酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时首先要点燃酒精灯。以后一切操作如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等都需在火焰近处并经过烧灼进行。试管培养瓶培养皿滴管吸管【操作】进行培养时动作要准确敏捷但又不必太快以防空气流动增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿如已接触要用火焰烧灼消毒或取备品更换。接种环、接种针L形涂布棒培养细胞的观察1.肉眼观察培养物颜色及混浊度体外培养细胞的常见问题2.倒置显微镜观察细胞生长状态体外培养细胞的方式群体培养(massculture)将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中让细胞贴壁生长汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层克隆培养(clonalculture)将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中各个细胞贴壁后彼此距离较远经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落称为克隆(clone)。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。群体培养(左)和克隆培养(右)体外培养细胞的分型(一)贴附型:大多数培养细胞贴附生长属于贴壁依赖性细胞判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定仅大致分成以下四型:、成纤维细胞型:胞体呈梭型或不规则三角形中央有卵圆形核胞质突起生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外凡由中胚层间充质起源的组织如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。名称:凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源:由中胚层间充质组织起源的组织如:真正的成纤维细胞心肌平滑肌成骨细胞血管内皮形态:似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出个长短不等的突起中有卵圆形核生长特点:排列成放射状漩涡状并不紧靠连成片细胞细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞常有几个伸长的细胞突起成纤维细胞成纤维细胞、上皮型细胞:细胞呈扁平不规则多角形中央有圆形核细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动处于膜边缘的细胞总与膜相连很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。名称:仅形态上似体内实际上不完全相同来源:来源于外胚层、内胚层细胞,如:皮肤及其衍生物,消化道乳腺肺泡,上皮性肿瘤形态:类似体内的上皮细胞扁平不规则多角形中有圆形核生长特点:易相连成片相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动很少脱离细胞群而单个活动上皮型细胞人大肠癌细胞HT系细胞种类:人大肠上皮粘膜癌培养天数:传代后天放大倍数:电镜*培养基种类:MEMHamF:混合细胞状态与特征:细胞呈贴壁生长梭形或不规则形伪足较多生长较快。衰退期细胞衰退期细胞、游走细胞型:呈散在生长一般不连成片胞质常突起呈活跃游走或变形运动方向不规则。此型细胞不稳定有时难以和其他细胞相区别。细胞种类:小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞培养的天数:h放大倍速:倒置显微镜X培养基种类:RPMI胎牛血清细胞状态与特征简述:细胞呈圆形边缘清晰整齐贴壁生长。细胞种类:小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞培养的天数:h放大倍速:倒置显微镜X培养基种类:RPMI胎牛血清细胞状态与特征简述:细胞形态不规则向四周伸展伪足边缘不清贴壁生长。、多型细胞型:有一些细胞如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态可统归于此类。新生小时wistar大鼠皮质神经细胞细胞种类:大鼠皮质神经细胞培养的天数:天放大倍速:倒置显微镜X倍培养基种类:DEMEF+N细胞状态与特征简述:神经细胞聚集成球向外爬行生长各神经球之间有丰富的神经丝联系。单个神经细胞胞体呈锥形或圆形树突交错呈网贴壁生长。(二)悬浮型:见于少数特殊的细胞如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形不贴于支持物上呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。概念:培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源:自血脾或骨髓尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点:在悬浮中生长良好细胞圆形单个或小细胞团优点:生存空间大提供数量大传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态缺点:观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)人PBMC(PHA活化剂刺激h后):细胞种类:人PBMC培养的天数:h放大倍速:倒置显微镜X培养基种类:RPMI胎牛血清细胞状态与特征简述:淋巴细胞母细胞化并聚集。人PBMC(经EB病毒转化后的淋巴母细胞):细胞种类:人PBMC培养的天数:weeks放大倍速:倒置显微镜X培养基种类:RPMI胎牛血清(Hyclone公司)细胞状态与特征简述:淋巴细胞母细胞化并聚集。•根据细胞生长的恃点传代方法有种:•.悬浮生长细胞传代•离心法传代:离心(转分)去上清沉淀物加新培养液后再混匀传代。•.半悬浮生长细胞传代(Hela细胞)•此类细胞部分呈现贴壁生长现象但贴壁不牢可用直接吹•打法使细胞从瓶壁脱落下来进行传代。•.贴壁生长细胞传代•采用酶消化法传代。常用的消化液有%的胰蛋白酶液。细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法:•吸光培养瓶中的培养液•加入ml%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)•静置min(显微镜下动态监测)。•吸去胰蛋白酶液加入培养液。•用吸管吸取瓶内培养液反复吹打瓶壁细胞形成细胞悬液。•离心细胞沉淀用培养液制成悬液。•吸取细胞悬液接种于新的培养瓶内。•加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。•将后者放入培养箱中培养。细胞传代培养消化法细胞计数•培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。•血细胞计数器:手工计数细胞•血球计数仪:自动计数细胞计数:、将血球计数板及盖片擦拭干净并将盖片盖在计数板上。、将细胞悬液吸出少许滴加在盖片边缘使悬液充满盖片和计数板之间。、静置分钟。、镜下观察计算计数板四大格细胞总数压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:细胞数ml=大格细胞总数注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团应按单个细胞计算若细胞团占以上说明分散不好需重新制备细胞悬液。•任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成从形态上区别死、活细胞是困难的。•在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力由组织中分离细胞一般也要检查活力以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力了解冻存和复苏的效果。培养细胞活力测定•台盼蓝法•活细胞不被染色死细胞染成蓝色•用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力•方法:、将细胞悬液以ml加入试管中、加入ml台盼兰染液染色一分钟、吸取少许悬液涂于载玻片上加上盖片、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数计细胞活力死细胞能被台盼兰染上色镜下可见深兰色的细胞活细胞不被染色镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。其他染色方法未固定凋亡细胞染色:台盼蓝法:AOEB双染色法:致密浓染黄绿色:早期凋亡细胞致密浓染鲜红色:晚期凋亡细胞鲜红色膨大状:坏死细胞凋亡细胞固定后染色观察:MGG染色法:玻片晾干后用MGG染液染色min光镜观察Hoechst染色法HE染色法其他:AnnexinVPI双染法:正常活细胞AnnexinV、PI均低染凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染坏死细胞AnnexinVPI均高染TUNEL染色:检测细胞凋亡CFSE染色:检测细胞增殖MTT比色法:测定细胞相对数和相对活力AOEB双染色原理:AO能够透过细胞膜把细胞核内的DNA染成绿色细胞浆内的RNA呈桔红色。早期凋亡细胞的细胞膜尚完整细胞浆发生固缩细胞核固缩或碎裂因此呈致密浓染的黄绿色有的还可见碎块状。晚期凋亡细胞的细胞膜通透性增加EB能够通过使其呈鲜红色固缩体或碎块。坏死细胞不仅细胞膜不完整而且线粒体肿胀为鲜红色的膨大细胞。方法:Ld离壁漂浮的细胞悬液与μlAO染液(μgml)和μlEB染液(μgml)混合后滴片立即用荧光显微镜观察。结果:大部分细胞主要呈致密浓染的黄绿色染色或黄绿色碎片(早期凋亡细胞)部分细胞呈致密浓染的鲜红色染色或鲜红色碎片(晚期凋亡细胞)少部分为鲜红色的膨大细胞。而在正常对照细胞主要呈细胞核绿色淡染细胞浆桔黄或桔红色。坏死对照大部分为鲜红色的膨大细胞。MGG染色MGG由MayGrunwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ对胞质着色较好后者对胞核着色较好。因此MGG染色可兼两者的优点常用于细胞涂片染色。正常细胞呈细胞浆淡蓝色细胞核粉红色着色。实验组的大部分细胞固缩变圆整个细胞呈深蓝色。坏死对照为外形不规则的淡蓝色膨大细胞。AnnexinVPI双染法:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(AnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白它与PS具有高度的结合力。因此AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC)同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。AnnexinVFITCPIhhhPBSPICliposomePICliposomePICliposomeliposomePICIntracellularExtracellularTUNEL技术TUNEL是末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferaseTdT)介导的dUTP原位切口末端标记(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabelingTUNEL)技术是原位检测细胞凋亡情况的一种基本方法。细胞发生凋亡时染色体DNA会发生断裂DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的’OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的’末端从而可进行凋亡细胞的检测。xxPBSConAILConACFSE染色法:CFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester羧基荧光素双乙酸盐琥珀酰亚胺酯)被动扩散进入细胞其本身是无色无荧光的被细胞内的酯酶分解后产生高强度的荧光该荧光产物与胞内的氨基结合长时间留存于细胞内并可被乙醛固定。未结合的试剂与副产物扩散至胞外基质中被洗去。传代或胚胎分裂分析CFSE与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白细胞分裂时被平均分配至子代细胞荧光强度降到母代细胞的一半。适合用于胞内示踪在细胞分裂或融合后分配至子代细胞中并不会被转移至邻近的细胞。在小鼠淋巴细胞迁移实验中CFSE注射进入小鼠体内后标记的淋巴细胞的检测可长达周。肝内注射荧光显微镜定位检测可长达天。CFSEEvents::::TCDCD:TregTCDCDTregAPCantiCDCFSEEventsCFSEEvents::::TCDCD:TregTCDCDTregAPCantiCD细胞冻存和复苏•细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费减少污染减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则:慢冻快融•当细胞冷到零度以下可以产生以下变化:细胞器脱水细胞中可溶性物质浓度升高并在细胞内形成冰晶。•如果缓慢冷冻可使细胞逐步脱水细胞内不致产生大的冰晶相反结晶很大大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融目的是防止小冰晶形成大冰晶即冰晶的重结晶。低温保护剂的应用•在细胞冻存时加入低温保护剂能大大提高冻存效果。•常用的低温保护剂是DMSO它是一种渗透性保护剂可迅速透入细胞提高胞膜对水的通透性降低冰点延缓冻结过程能使细胞内水分在冻结前透出细胞外在胞外形成冰晶减少胞内冰晶从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法•.预先配制冻存液:含血清培养基DMSODMSO液用培养液配好避免因临时配制产热而伤害细胞•.取对数生长期细胞经胰酶消化后加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(~细胞ml)•.加入ml细胞于冻存管中密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。标准程序:当温度在以上时~min当温度达以下时~min当温度达时可迅速放入液氮中慢冻程序程序降温仪立升降温速率:度分升温速率:度分温度偏差:小于度个预设程序个用户设定程序每分钟地冷冻速率可大大提高冻存细胞的复苏率。简易程序:将冷冻管(管口要朝上)放入纱布袋内纱布袋系以线绳通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口按每分钟温度下降~的速度在分钟内降至液氮表面停分钟后直接投人液氮中。慢冻程序一般程序:先将冻存管放入冰箱约min。接着置于冰箱约~min。置于超低温冰箱中放置过夜。置于液氮罐中长期保存。慢冻程序液氮罐细胞复苏方法()从液氮中取出冷冻管迅速投入~水浴中使其融化(分钟左右)()分钟内用培养液稀释至原体积的倍以上()低速离心分钟()去上清加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞培养的污染和检测细胞培养的污染和检测细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。、细菌的污染和检测、细菌的污染和检测肉眼直接观察法培养检查法显微镜观察法PCR检测细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染即使在细胞培养液中加入了抗菌素也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌如枯草杆菌、白色葡萄球菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。培养细胞受细菌污染后会出现培养液变混浊pH改变。污染后细胞发生病理改变胞内颗粒增多、增粗最后变圆脱落死亡。小鼠胃癌细胞的球菌感染图片细菌污染原核细胞SrRNA基因序列通用引物检测细菌污染染绿脓杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌,以及支原体Mfermentans的Hela细胞的培养上清SrRNA特异性序列通用引物上游引物(A):′GTTTGATCCTGGCTCAG′下游引物():′AAGGAGGTAATCCAGCC′扩增片段大小约bp。革兰氏染色检测细菌污染培养检测细菌污染血平板SS平板麦康凯平板标准管痢疾杆菌伤寒杆菌大肠杆菌生化鉴定、真菌的污染和检测、真菌的污染和检测真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点有的散在生长培养液一般不发生混浊倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中有的呈链状排列。真菌污染后细胞生长变慢但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细胞被霉菌污染的镜检图细胞被白色念球菌污染的镜检图细胞被真菌污染的镜检图丝状菌污染图片无菌试验和测定菌数用培养基品名英文名用途硫乙醇酸盐培养基ThiogllycollateMedium需氧菌、厌氧菌无菌试验霉菌培养基MouldMedium霉菌无菌试验改良马丁培养基ModifiedMartinMedium生物制品霉菌无菌试验支原体半流体基础培养基MycoplasmaSemifluidBase生物制品支原体检查图度培养的接种天后硫乙醇酸盐流体培养基注:为对照管其余为实验管各管均未见细菌生长图度培养的接种天后改良马丁培养基注:为对照管其余为实验管各管均未见真菌生长外源性因子检测结果图外源性因子检测结果图支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物最小直径μm一般过滤除菌无法去除它光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现能在偏碱条件下生存对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢部分细胞变圆从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化或略有变化若不及时处理还会产生交叉污染。、支原体的污染和检测、支原体的污染和检测造成支原体高污染率的原因支原体大小um无细胞壁可透过一般过滤膜(um)支原体污染时没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式细胞流通之间缺乏物品管理造成实验室间的相互污染研究或操作人员忽略污染问题已受污染的细胞已受污染的培养基、血清。HowfrequentlyshouldItestmycells检测频率?•Whenevernewcellsenterthelab•Beforeeachliquidnitrogenstorage•Routinelyeverymonths•Weeklyaftercontaminationhasbeenfoundinthelaboratory•Whenyoubelievethatcellscharacteristicshavebeenmodified•新细胞进入实验室•液氮保存前•定期每-个月•发现污染后每周•发现细胞特性改变支原体之检测:相差显微镜观察法Hayflick培养基直接培养法原理:直接培养支原体于培养基中观察其生长及菌落生成。特点:是目前最直接与灵敏之步骤亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。缺点:培养时间长须星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如Mhyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组可能会造成污染。支原体污染照片。左图为阳性右图为阴性。DNA荧光染色法原理︰利用荧光染剂(bisbenzimide,Hoechst)检测支原体污染。此染剂会结合到DNA之AdenosineThymidine(AT)rich区域因为支原体之DNA中AT含量占多数(~)所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点即为支原体之DNA证明有支原体之污染。测试步骤用间接步骤将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中(indicatorcell例如VerocellorTcell)然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicatorcell内作为对照。待测细胞亦可作直接测试但需为吸附型细胞培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景而干扰结果判读则建议使用接种于指示细胞之步骤。特点︰简单、经济与灵敏广泛使用可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体例如Mhyorhinis较直接培养法快约一星期即可知道结果。缺点:有时仍会有荧光背景影响判读。荧光染色法()显示染色体细胞周围亮点为支原体Giemsa染色法附于胞质上黑点为支原体扫描电镜法显示支原体附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体PCR方法支原体菌株来源:MArgininiATCC精氨酸支原体,MFermentaneATCC发酵支原体,MSalivariumATCC唾液支原体,MHominisATCC人型支原体,MOraleATCC口腔支原体,MHyorhinisATCC猪鼻支原体。其共同引物序列来自s和s保守区域:外部引物为:F′ACACCATGGGAGCTGGTAAT′R′GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT′内部引物为:F′GTTCTTTGAAAACTGAAT′R′GCATCCACCCAAAAACTCT′。EZPCRMycoplasmaTestKitCat#(assays)Cat#(assays)ReadytousePCRmixforthedetectionofmycoplasmaincellculture即用型细胞培养中支原体检测PCR试剂盒Theprimersetallowsdetectionofvariousmycoplasmaspecies,withhighsensitivityandspecificity:系列引物可以高特异性和高灵敏度地检测很多种支原体MhyorhinisMargininiMbovisMhominisMpulmonisMarthritidisMsalivariumMoraleMfermentansMpirumMpneumoniaeMcapricolumAcholeplasmaSpiroplasma内酰胺类、万古霉素等:不敏感多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺:耐药四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮:抑制氨基糖苷类、氯霉素:较小抑制作用MPlasmocin:InvivoGen公司研究开发,有效地杀灭支原体支原体污染后的抗生素处理:BiologicalIndustriesisnowofferingacombinationofantibiotics,whichhavebeenshowntobeeffectiveintheeliminationofmycoplasmaspeciesthataccountforofthecontaminationfoundincellculturesBiologicalIndustries的抗生素系列产品能有效杀灭细胞培养中的以上的支原体BIOMYC(cat#)BIOMYC(cat#)BIOMYC(cat#)BIOMYCisbasedontheantibiotictiamutin,whichisproducedbythefunguspleurotusmutilus成分为泰妙菌素BIOMYCisbasedonminocycline,whichisatetracyclinederivative二甲胺四环素四环素衍生物Thesetwoantibioticsolutionsaregenerallyusedsequentiallyincombination以上抗生素溶液一般按顺序联合使用BIOMYCBIOMYCBIOMYCBIOMYCBIOMYCBIOMYCBIOMYCisbasedontheciprofloxacinantibiotic,whichisamemberofthefluoroquinolonegroupManymycoplasmaspecieshavebeenfoundtobesensitivetoBIOMYCBIOMYC成分为氟喹酮类的环丙沙星多种支原体对其敏感•BiomycBiomycsequentially,orBiomycalone•BiomycBiomyc按顺序联合使用Biomyc单独使用•Biomyc,Biomyc,Biomyctogethercoverofthespecies•三种同时能去除%支原体•Thereisnosingleantibioticthatcoversthewholespectrum•没有一种抗生素能去除全部支原体•WerecommendtoworkinparalleltosavetimeBiomycwithhalfthedishesandBiomycwiththeotherhalf•建议平行使用节约时间Biomyc用在一半的Dish中而Biomyc用在另一半中。常用抗生素用量和效应抗生素抗菌谱细菌真菌支原体常用浓度青霉素GIUml链霉素Ggml庆大霉素G,G+gml卡那霉素G,G+gml四环素G,G+gml两性霉素+gml制霉菌素+gml、病毒的污染和检测、病毒的污染和检测细胞的直接观察动物接种检查电子显微镜观察免疫学检查PCR技术组织细胞培养过程中如果没有除去潜在的病毒就会产生病毒污染。目前从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于种血清性病毒。HBVHepGHPVHelaEBV永生化B细胞由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。、非同种细胞污染、非同种细胞污染对于黑胶虫的分类学术界没有明确给予说法。关于黑胶虫的分类目前大部分人认为黑胶虫污染是微生物感染。在一些文章论述上把黑胶虫归为生物污染类型但是没把它归为确定的生物分类类型只是把黑胶虫独立为一种未知生物。而根据中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫似乎和草履虫和变形虫有类似之处但是由于课题经费不够而不能继续下去最终也没有有力证明黑胶虫是属于原虫。也有一些学者不认为所谓的黑胶虫污染是一种生物污染而认为是细胞碎片类物质是在细胞培养时细胞衰亡破裂产生的也有在文献中报道说是玻璃瓶中类似氧化硅的物质那个文献很少人找得到还有报道黒胶虫是一种纳米级的细菌。、黑胶虫污染、黑胶虫污染形态上类似与杆状细菌但长度比细菌长直径约在~微米不染色观察为黑色胶虫成熟后呈线状而且形态是椭圆形。运动形式:在X倒置显微镜小有典型的布朗运动(不规则的原地小距离抖动)即很多细胞培养者看到的像黑色的小虫游来游去。可以穿透滤膜也可以通过空气传播低倍下为黑色点状高倍下可看见黑色的小虫游来游去。但是在物理学上来说颗粒足够小在液体中也是做布朗运动的这不足以说明黑胶虫的布朗运动就证明它是生物。质量标准质量标准成品检定ng剂量即ngmlELISA法:《年中华人民共和国药典第三部》附录ⅨL鼠IgG残留量测定法鼠源性IgG残留具有杀伤功能(效靶比为:时>)体外杀伤(对人卵巢癌细胞系SKOV或人肺鳞癌细胞系NCIH)MTT法生物学活性EUml鲎实验LAL(签发):《年中华人民共和国药典第三部》附录ⅫE细菌内毒素检查法内毒素阴性培养法:《年中华人民共和国药典第三部》附录ⅫB支原体检查法阴性PCR法(签发)支原体阴性培养法:年中华人民共和国药典第三部》附录ⅫA支原体无菌检查法阴性革兰染色(签发)无菌免疫荧光染色流式细胞仪检测法(签发)纯度台盼兰染色法(签发)存活率血球计数法(签发)细胞数量白色悬浊液肉眼观察(签发)外观质质量量标标准准检检测测方方法法检检测测项项目目ng剂量即ngmlELISA法:《年中华人民共和国药典第三部》附录ⅨL鼠IgG残留量测定法鼠源性IgG残留具有杀伤功能(效靶比为:时>)体外杀伤(对人卵巢癌细胞系SKOV或人肺鳞癌细胞系NCIH)MTT法生物学活性EUml鲎实验LAL(签发):《年中华人民共和国药典第三部》附录ⅫE细菌内毒素检查法内毒素阴性培养法:《年中华人民共和国药典第三部》附录ⅫB支原体检查法阴性PCR法(签发)支原体阴性培养法:年中华人民共和国药典第三部》附录ⅫA支原体无菌检查法阴性革兰染色(签发)无菌免疫荧光染色流式细胞仪检测法(签发)纯度台盼兰染色法(签发)存活率血球计数法(签发)细胞数量白色悬浊液肉眼观察(签发)外观质质量量标标准准检检测测方方法法检检测测项项目目幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号无菌技术概念幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号贴壁生长细胞传代方法:幻灯片编号细胞计数幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号细胞冻存和复苏冻存和复苏的原则:慢冻快融低温保护剂的应用细胞冻存方法幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号细胞复苏方法幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号HowfrequentlyshouldItestmycells检测频率?幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号BiologicalIndustriesisnowofferingacombinationofantibiotics,whichhavebeenshowntobeeffectiveintheeliminationofmycoplasmaspeciesthataccountforofthecontaminationfoundincellculturesBiologicalIndustries的抗生素系列产品能有效杀灭细胞培养中的以上的支原体BIOMYCBIOMYCBIOMYC幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号幻灯片编号质量标准幻灯片编号

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