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上传者: ytdyan 2011-07-20 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《包涵体doc》,可适用于自然科学领域,主题内容包含包涵体  HYPERLINK"http:imgsrcbaiducombaikepicitemefebedajpg"t"blank"包涵体(inclu符等。

包涵体  HYPERLINK"http:imgsrcbaiducombaikepicitemefebedajpg"t"blank"包涵体(inclusionbody)  病毒在增殖的过程中常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物不含病毒粒子。有的位于细胞质中(如天花病毒包涵体)有的位于细胞核中(如疱疹病毒)或细胞质、细胞核中都有(如麻疹病毒)。有的还具有特殊名称如天花病毒包涵体叫顾氏(Guarnieri)小体狂犬病毒包涵体叫内基氏(Vegri)小体。昆虫病毒可根据包涵体的形状、位置而分为细胞质型多角体病毒、核型多角及颗粒体病毒等。编辑本段包涵体  包涵体:  包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集形成无活性的固体颗粒。  包涵体的组成与特性:  一般含有以上的重组蛋白其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等环状或缺口的质粒DNA以及脂体、脂多糖等大小为um难溶与水只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。  包涵体的形成:  主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适无法形成正确的次级键等原因形成的。  、表达量过高研究发现在低表达时很少形成包涵体表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快以至于没有足够的时间进行折叠二硫键不能正确的配对过多的蛋白间的非特异性结合蛋白质无法达到足够的溶解度等。  、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。  、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。  、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类致使中间体大量积累容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。  包涵体表达的有利因素:  、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。  、降低了胞内外源蛋白的浓度有利于表达量的提高。  、包涵体中杂蛋白含量较低且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离有利于分离纯化。  、对机械搅拌和超声破碎不敏感易于破壁并与细胞膜碎片分离。  实验方法:  破菌:  、机械破碎  、超声破碎  、化学方法破碎  分离:  、离心:gmin离心可使大多数包涵体沉淀与可溶性蛋白分离。  、过滤或萃取方法:  洗涤:  由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体通常用低浓度的变性剂如M尿素在mMTrispH左右,mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX洗涤去除膜碎片和膜蛋白。  溶解:  常用的变性剂有尿素(M)、盐酸胍(GdnHClM)通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差异氰硫酸胍(GdnSCN)最强。  去垢剂:如强的阴离子去垢剂SDS可以破坏蛋白内的疏水键可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。  极端pH:可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。  变性剂的使用浓度和作用时间:一般在偏碱性性的环境中如pH尿素在碱性环境中不稳定一般不要超过pH。有些蛋白只能用盐酸胍如IL。增溶时一般室温过夜但盐酸胍在度小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。  还原剂:  由于蛋白间二硫键的存在在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是mMBME或DTT也有文献使用mM浓度。在较粗放的条件下可以使用mll的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶有时还原剂的使用也是必要的可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。  复性:  通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度M左右时复性过程开始到M左右时结束。对于盐酸胍而言可以从M开始到M时复性过程已经结束。  复性中常采用的方法有:  稀释复性:直接加入水或缓冲液放置过夜缺点是体积增加较大变性剂稀释速度太快不易控制。  透析复性:好处是不增加体积通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度有人称易形成沉淀且不适合大规模操作无法应用到生产规模。  超滤复性:在生产中较多的使用规模较大易于对透析速度进行控制缺点是不适合样品量较少的情况且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。  柱上复性:是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法如华北制药的GCSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。  还原剂的去除:  还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的可以考虑在变性剂完全去除之后在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。  常用的氧化方法有:  空气氧化法:在碱性条件下通空气或者加入二价铜离子能够取得更好的效果缺点是不易控制氧化还原电势。  氧化还原电对(redox):常采用GSSGGSH通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如:mMGSSGmMDTT=GSHGSSG()。  复性的效率:  复性是一个非常复杂的过程除与蛋白质复性的过程控制相关外还很大程度上与蛋白质本身的性质有关有些蛋白非常容易复性如牛胰RNA酶有对二硫键在较宽松的条件下复性效率可以达到以上而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来蛋白质的复性效率在左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。  复性过程的添加剂:  、共溶剂:如PEG据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在左右具体条件可根据实验条件确定。  、二硫键异构酶(PDI)和脯氨酸异构酶(PPI):PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合从而有利于恢复到正常的结构此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量常常是复性过程中的限速步骤而PPI的作用是促进两种构象间的转变从而促进复性的进行。  、分子伴侣即热休克蛋白(HSP)是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株据说效果不错。不过在生产中还没有看到和的应用的例子。  、MLArg:成功的应用于很多蛋白如tPA的复性中可以抑制二聚体的形成。  、甘油等:增加黏度减少分子碰撞机会一般使用浓度在。  、一定的盐浓度可能是为了降低某些带电集团间的斥力有利于蛋白质的折叠。  、辅助因子:添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。  、色谱法:通过将目标蛋白结合到层析柱上减少蛋白分子间的相互影响该方法得到越来越多的应用常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。  当然虽然有很多所谓的理性的复性方案设计目前的复性工作更多的是一个经验的过程没有一种通用的方法可以套用。  复性时的蛋白浓度:  一般使用浓度为mgml太高的浓度容易形成聚体沉淀太低的浓度不经济而且很多蛋白在低浓度时不稳定很容易变性。  复性效果的检测:  根据具体的蛋白性质和需要可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。  、凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。  、光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测但一般只用于复性研究中的过程检测。  、色谱方法:如IEX、RPHPLC、CE等由于两种状态的蛋白色谱行为不同。  、生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定较好的反映了复性蛋白的活性值得注意的是不同的测活方法测得的结果不同而且常常不能完全反映体内活性。  、黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加变性状态时由于疏水残基暴露一般水溶性很差大多形成可见的沉淀析出。  、免疫学方法:如ELISA、WESTERN等特别是对结构决定簇的抗体检验比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。  几个复性的实例:  、MHCIIJBC():  增溶:mgProtein,MGdnHCl,mMDTT,mMEDTA,mMTrispH度hr  复性:folddilutiontomgmlProtein  、增溶:mMDTT,SDS,mMTris,mMGlucinepH  复性:倍稀释到mMDTT,mMDodOMalt(dodecylbetaDmaltoside),mMNaCl,mMTrispH对起始缓冲液密闭透析hr开口透析hr对mMNaCl,mMTrispH透析hr。  、BovinePrethrombin,JBC():四对二硫键。  增溶:MGdnHCl,mMTrispH,mMEDTAmgml  复性:稀释到mMNaHPO,mMEDTA,PEG,MGdnHCl,mMGSSG,mMGSH,pH,mgmlProteinRThr对LmMsodiumphosphate,mMEDTA,PEG,pH透析次温度度。  纯化:  一般说来复性液的体积较大为了减少处理体积在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高可以直接进行HIC纯化目标峰经适当稀释后(cond<mScm)进行IEX纯化然后通过SEC脱盐更换缓冲液除菌过滤后在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。  当然在复性浓度较高的情况下也可以直接将复性液进行IEX纯化优点是在纯化的同时进行体积的浓缩为以后的精制创造条件。  从生产的角度看由于每增加一步纯化工序便降低很多收率所以可过两到三次柱纯化工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白不得不进行多次纯化。

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