关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 凝胶层析.doc

凝胶层析.doc

凝胶层析.doc

上传者: ytdyan 2011-07-20 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《凝胶层析doc》,可适用于自然科学领域,主题内容包含凝胶层析凝胶层析简介凝胶层析(gelchromatography)又称为凝胶排阻层析(gelexclusionchromatography)、分子筛符等。

凝胶层析凝胶层析简介凝胶层析(gelchromatography)又称为凝胶排阻层析(gelexclusionchromatography)、分子筛层析(molecularsievechromatography)、凝胶过滤(gelfiltration)、凝胶渗透层析(gelpermeationchromatography)等。它是以多孔性凝胶填料为固定相按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。年Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物-交联葡聚糖凝胶作为柱填料分离水溶液中不同分子量的样品称为凝胶过滤。年Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶能够进行有机溶剂中的分离称为凝胶渗透层析(流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析)。随后这一技术得到不断的完善和发展目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒凝胶颗粒的内部具有立体网状结构形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后各个组分就向固定相的孔穴内扩散组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部完全被排阻在孔外只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动它们经历的流程短流动速度快所以首先流出而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部经历的流程长流动速度慢所以最后流出而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透渗透的程度取决于它们分子的大小所以它们流出的时间介于二者之间分子越大的组分越先流出分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出从而达到了分离的目的。凝胶层析的基本概念外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积如图-所示外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt外水体积为Vo内水体积为Vi基质体积为Vg则有:Vt=Vo+Vi+Vg由于Vg相对很小可以忽略不计则有:Vt=Vo+Vi设洗脱体积为VeVe一般是介于Vo和Vt之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内部而只存在于流动相中故其洗脱体积Ve=Vo对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内(忽略凝胶本身体积Vg)故其洗脱体积Ve=Vt。分子量介于二者之间的分子它们的洗脱体积也介于二者之间。有时可能会出现Ve>Vt这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。凝胶层析中的几种洗脱峰如图-所示:柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处然后测量水的体积来测定。外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定一般常用蓝色葡聚糖作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大(为万)在各种型号的凝胶中都被排阻并且它呈蓝色易于观察和检测。分配系数分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中分配系数通常表示为:Kav=(VeV)(VtV)前面介绍了Vt和Vo都是可以测定的所以测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。对于一定的层析条件Vt和Vo都是恒定的大分子先被洗脱出来Ve值小Kav值也小。而小分子后被洗脱出来Ve值大Kav值也大。对于完全排阻的大分子Ve=Vo故Kav=。而对于完全渗透的大分子Ve=Vt故Kav=。一般Kav值在-之间如Kav值大于则表示这种物质与凝胶有吸附作用。对于某一型号的凝胶在一定的分子量范围内各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系:Kav=-blgMW+c其中b、c为常数MW表示物质的分子量。另外由于Ve和Kav也成线性关系所以同样有:Ve=-b'lgMW+c'其中b'、c'为常数。这样我们通过将一些已知分子量的标准物质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱分别测定Ve或Kav并根据上述的线性关系绘出标准曲线然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav通过标准曲线即可求出其分子量。这就是凝胶层析测定分子量的基本原理这种方法在后面的应用中还将详细介绍。排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部直接从凝胶颗粒外流出所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如SephadexG的排阻极限为,它表示分子量大于,的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围对于分子量在这个范围内的分子用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如SephadexG对球形蛋白的分级分离范围为,-,它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过SephadexG得到较好的分离。应注意对于同一型号的凝胶球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。吸水率和床体积吸水率是指g干的凝胶吸收水的体积或者重量但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指g干的凝胶吸水后的最终体积。凝胶颗粒大小层析用的凝胶一般都成球形颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大流速快但分离效果差颗粒小分离效果较好但流速慢。一般比较常用的是-目。凝胶的种类和性质凝胶的种类很多常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶(dextran)、聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide)、琼脂糖凝胶(agarose)以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。下面将分别介绍。葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是指由天然高分子-葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由PharmaciaBiotech生产。常见的有两大类商品名分别为Sephadex和Sephacryl。葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列它是葡聚糖与-氯-,环氧丙烷(交联剂)相互交联而成交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex的主要型号是G~G后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mlg干胶)乘以。如SephadexG表示吸水率是mlg干胶。Sephadex的亲水性很好在水中极易膨胀不同型号的Sephadex的吸水率不同它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的排阻极限越大分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的G为′。Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的可以多次重复使用。Sephadex稳定工作的pH一般为为-。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。Sephadex在高温下稳定可以煮沸消毒在C下min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex由于含有羟基基团故呈弱酸性这使得它有可能与分离物中的一些带电基团(尤其是碱性蛋白)发生吸附作用。但一般在离子强度大于的条件下几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附但应注意如果盐浓度过高会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex有各种颗粒大小(一般有粗、中、细、超细)可以选择一般粗颗粒流速快但分辨率较差细颗粒流速慢但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex的机械稳定性相对较差它不耐压分辨率高的细颗粒要求流速较慢所以不能实现快速而高效的分离。另外SephadexG和G中分别加入羟丙基基团反应形成LH型烷基化葡聚糖凝胶主要型号为SephadexLH和LH适用于以有机溶剂为流动相分离脂溶性物质例如胆固醇、脂肪酸激素等。Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺(N,N'methylenebisacrylamide)交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl的优点就是它的分离范围很大排阻极限甚至可以达到远远大于Sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。Sephacryl与Sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高:Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液耐高温Sephacryl稳定工作的pH一般为~。另外Sephacryl的机械性能较好可以以较高的流速洗脱比较耐压分辨率也较高所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺(acrylamide)与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶主要由BioRadLaboratories生产商品名为BioGelP主要型号有BioGelP~BioGelP等种后面的数字基本代表它们的排阻极限的所以数字越大可分离的分子量也就越大。各种型号的主要参数如附表所示。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的BioGelP为′。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好在pH为~之间比较稳定。但在较强的碱性条件下或较高的温度下聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水基本不带电荷所以吸附效应较小。另外聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D-半乳糖(Dgalactose)和,-脱水半乳糖(anhydrogalactose)交替构成的多糖链。它在C时呈液态当温度降至C以下时多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异常见的主要有PharmaciaBiotech生产的Sepharose(B~B)和BioRadLaboratories生产的BiogelA等。关于各种琼脂糖凝胶的基本参数如附表所示。琼脂糖凝胶在pH为-之间是稳定的它在室温下很稳定稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好一般好于前两种凝胶在高盐浓度下柱床体积一般不会发生明显变化使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大分离范围很广适合于分离大分子物质但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温使用温度以-C为宜。Sepharose与,二溴丙醇反应形成SepharoseCL型凝胶(CLB~CLB)它们的分离特性基本没有改变但热稳定性和化学稳定性都有所提高可以在更广泛的pH范围内应用稳定工作的pH范围为-。SepharoseCL型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB提供商品名为Ultragel。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺所以有较高分辨率而它又含有琼脂糖这使得它又有较高的机械稳定性可以使用较高的洗脱速度。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel有不同的分离范围多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。顾名思义它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。这类凝胶属于硬质无机凝胶它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好使用方便而且寿命长无机胶一般柱效较低但用微粒的多孔硅胶制成的HPLC柱也可以有很高的柱效可以达到′塔板米。多孔玻璃珠易破碎不能填装紧密所以柱效相对较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽多孔硅胶一般为-′多孔玻璃珠一般为′-′。它们的最大缺点是吸附效应较强(尤其是多孔硅胶)可能会吸附比较多的蛋白但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。另外它们也不能用于强碱性溶液一般使用时pH应小于。另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。例如PharmaciaBiotech的Superdex和SuperroseSuperdex的分辨率非常高化学物理稳定性也很好可以用于FPLC、HPLC分析而Superose的分离范围很广分辨率较高可以一次性的分离分子量差异较大的混合物。同时它的机械稳定性也很好。关于各种凝胶产品的详细情况可以参阅本书附录以及各个公司的产品目录。凝胶的选择、处理和保存凝胶的选择通过前面的介绍可以看到凝胶的种类、型号很多。不同类型的凝胶在性质以及分离范围上都有较大的差别所以在进行凝胶层析实验时要根据样品的性质以及分离的要求选择合适的凝胶这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素。一般来讲选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围根据分离范围来选择合适型号的凝胶。一般的凝胶层析实验可以分为两类:分组分离(groupseparations)和分级分离(fractionations)分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组一组分子量较大另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。分级分离则是指将一组分子量比较接近的组分分开。在分组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶这样分离效果好。一般常用排阻极限较小的凝胶类型。分级分离时则要根据样品组分的具体情况来选择凝胶的类型凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量另一方面要合适不能过大。如果分离范围选择过小则某些组分不能得到分离如分离范围选择过大则分辨率较低分离效果也不好。选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小。颗粒小分辨率高但相对流速慢实验时间长有时会造成扩散现象严重颗粒大流速快分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况而定例如样品中各个组分差别较大则可以选用大颗粒的凝胶这样可以很快的达到分离的目的如果有个别组分差别较小则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。由于凝胶一般都比较稳定所以它在一般的实验条件下都可以正常的工作。如果实验条件比较特殊如在较强的酸碱中进行或含有有机溶剂等等则要仔细查看凝胶的工作参数选择合适的类型的凝胶。凝胶的处理凝胶使用前要首先要进行处理。选择好凝胶的类型后首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶所以要计算干胶用量:干胶用量(g)=柱床体积(ml)凝胶的床体积(mlg)。由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加%-%。葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶的处理首先是在水中膨化不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶(即型号较小、排阻极限较小的凝胶)膨化时间较短在C条件下需-小时但吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长C条件下需十几个到几十个小时如SephadexG以上的干胶膨化时间都要在小时以上。如果加热煮沸则膨化时间会大大缩短一般在-小时即可完成而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热以免凝胶被破坏。琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态所以不需膨化处理。另外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。膨化处理后要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的否则会影响分离效果可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。凝胶的保存凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质然后加入适当的抗菌剂通常加入%的叠氮化钠C下保存。如果要较长时间的保存则要将凝胶洗涤后脱水、干燥可以将凝胶过滤抽干后浸泡在%的乙醇中脱水抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水至%乙醇脱水后将凝胶抽干。置于C烘箱中烘干即可装瓶保存。注意膨化的凝胶不能直接高温烘干否则可能会破坏凝胶的结构。凝胶层析的基本操作凝胶层析的基本操作步骤与前面介绍的柱层析的操作过程基本相似这里就不再重复了。下面主要介绍凝胶层析操作中应注意的一些具体问题。层析柱的选择层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲主要是层析柱的长度对分辨率影响较大长的层析柱分辨率要比短的高但层析柱长度不能过长否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过cm为得到高分辨率可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在:-:之间。用于分组分离的凝胶柱如脱盐柱由于对分辨率要求较低所以一般比较短。凝胶柱的鉴定凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果关于填装的方法前面已有介绍这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质如蓝色葡聚糖、血红蛋白等上柱观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降则表明柱中的凝胶填装情况较好可以使用如果色带弥散、歪曲则需重新装柱。另外值得一提的是有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附可以用一些物质预先过柱以消除吸附。洗脱液的选择由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用所以和其它层析方法相比凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用一般洗脱液都含有一定浓度的盐。加样量关于加样前面已经有所介绍要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响加样过多会造成洗脱峰的重叠影响分离效果加样过少提纯后各组分量少、浓度较低实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定:凝胶柱较大当然加样量就可以较大样品中各组分分子量差异较大加样量也可以较大一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的%-%左右而分组分离时加样体积可以较大一般约为凝胶柱床体积的%-%。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve和Ve那么加样量不能超过(Ve-Ve)。实际由于样品扩散所以加样量应小于这个值。从洗脱峰上看如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开为了提高效率可以适当增加加样量如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开则不能再加大加样量甚至要减小加样量。另外加样前要注意样品中的不溶物必须在上样前去掉以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大否则会影响分离效果。洗脱速度洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法一种是使用恒流泵另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等一般来讲洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽反而会降低分辨率而且实验时间会大大延长所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是-cmhr市售的凝胶一般会提供一个建议流速可供参考。总之凝胶层析的各种条件包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率提高分辨率的选择应主要包括:选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶选择颗粒小的凝胶选择分辨率高的凝胶类型选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。但正如前面讲过的各种选择都有一个限度的问题超过这个限度可能会产生相反的效果。另外需要提的一点是实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验以选择最合适的实验条件。凝胶层析的应用前面介绍了凝胶层析的基本理论以及基本实验操作下面简单介绍一下凝胶层析在生物学方面的应用。生物大分子的纯化凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的由于它的这一分离特性以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段尤其是对于一些大小不同但理化性质相似的分子用其它方法较难分开而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。分子量测定前面已经介绍了在一定的范围内各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。Kav=-blgMW+cVe=-b'lgMW+c'由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单所需样品量也较少是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用那么测量的误差就会比较大上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立所以凝胶层析不能用于测定这类分子的分子量另外由于糖的水合作用较强所以用凝胶层析测定糖蛋白时测定的分子量偏大而测定铁蛋白时则发现测定值偏小还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶层析的线性范围之内。脱盐及去除小分子杂质利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法它比一般用透析的方法脱盐要快得多而且一般不会造成样品较大的稀释生物分子不易变性。一般常用的是SephadexG另外还有BioGelPDG或UltragelAcA等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售使用方便但价格较贵。去热源物质热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质凝胶层析是一种简单而有效的方法。溶液的浓缩利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex(粗颗粒)加入溶液中Sephadex可以吸收大量的水溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值

用户评论(0)

0/200

精彩专题

上传我的资料

每篇奖励 +2积分

资料评价:

/8
2下载券 下载 加入VIP, 送下载券

意见
反馈

立即扫码关注

爱问共享资料微信公众号

返回
顶部