梯度PCR在基因扩增研究中的应用

中国误诊学杂志2008年4月第8卷第 11期 Chin J Misdiagn，Apr 2008 Vol 8 No．11 梯度PCR在基因扩增研究中的应用 王德文 ，王铁兵 ，陈海霞。，王晓春。 【研究原著】 【摘要】 目的 ：探讨和尝试一种较为迅速确定最佳退火温度 的方法来扩增 目的基 因。方法 ：采用梯度 PCR对醛 固酮 合酶基因(CYP11B2)进行扩增，通过凝胶呈像技术判断cYPllB2基因最佳退火温度。结果：与普通PCR相比，梯度PCR 能够迅速地确定CYP11B2基因的最佳退火温度。结论：梯度PCR简单、直观、快速，适用于各种核酸分子的扩增，具有高 效率、高通量的优点，有着广阔的应用前景。 【主 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 词】 聚合酶链反应／方法 ；基 因扩增 【中图分类号】 R394—33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1009—6647(2008)11—2527—03 Use Of Gradient PCR in Gene Amplification Study WANG De—wen，WANG Tie—bing，CHEN Hai—xia，et a1． (Dongguan blood center，Dongguan 523930，China) [Abstract] Objective：To explore a method for quicker identification of the optimal annealing temperature in PCR． M ethods：Gradient PCR was employed in analysis of aldosterone synthase(CYP11B2)gene polymorphisms，and gel Imag— ing Technology was used to determine the optimal annealing temperature．Result：Compared with normal PCR，Gradient PCR could identify the the optimal annealing temperature of aldosterone synthase gene．Conclusions：Gradient PCR is simple，efficient and rapid，with a broad application prospects，which suitable for PCR of all kinds of genes． [MESH] Polymerase Chain Reaction／methods；Gene Amplification 自20世纪70年代人类第一个单基因病的致病基 因被克隆以后 ，医学界即开始关注基 因的问题 ，研究方 向遍及 临床医学各领域 ，聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)作为分子生物学中最基本的操 作技术 ，在基因与疾病关系的研究中发挥着重大 的作 用 ，但是在 日常实验 中PCR反应经常出现两种情况： 一 种是产生大量非特异性产物 ，另一种情况是未扩增 出任何产物。影响 PCR的因素很多，退火温度的确定 是 PCR是试验成败的关键_l1]，本人在对醛固酮合酶基 因(CYP11B2)对原发性 高血压影 响的研究 中应用 了 梯度PCR_2 ]，根据计算退火温度值设定PCR循环程 序 中退火温度变化范围，在通过实验结果判断确定最 佳退火温度方面作了一次尝试 。 1 对象和方法 1．1 对象 随机选择湘雅医院和湘雅 三医院 2005～ 03／2006—12期 间经门诊确诊的原发性高血压患者 150 例，入选者均符合 1999年世界卫生组织／国际高血压 基 金项 目：本课题获东莞市科技 基金资助项 目(编号：ZC051209， ZC060401) 作者单位：1．东莞市中心血站检验科，广东 东莞 523930；2．深圳市人民 医院检验科，广东 深圳 518106；3．中南大学湘雅医学院检验科，湖南 长沙 410013 作者简介：王德文(1968一)，男，湖南衡阳人，硕士，副主任医师。研究方 向：血液安全和病毒核酸诊断。 协会诊断标准。 1．2 试剂和仪器 全血基 因组提取试剂盒 以及引物 Forward primer：5 一CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC一3 和 Reverse primer：5 一CCT CCA CCC TGT TCA GCC C一3 均购 自北京鼎国生物工程公司；Ther— mo Hybaid PX2型PCR仪为美国Thermo公司制造； DYY一Ⅲ5型稳压稳流电泳仪为北京六一仪器厂生产； 05PR～32低温离心机为 日本 日立工业株式会社制造； 凝胶成像系统为美国Polaroid。 1．3 方法 PCR反应 体系：TaqDNA聚合酶 (5 U／ 1)0．4 1，10xPCR Buffer 5 1，25 mmol／L Mgcl23 1，dNTPs Mixture 2 1，模板 DNA 2 1，弓l物 A 2 1， 引物B 2 1，灭菌双蒸水补足至50 1。PCR反应扩增条 件 ；94 C变性 1 min，45℃，Grad一15 C退火 45 S，72 ℃延伸1 min，经32个循环，循环前94 C预变性 3 min， 循环后72。C延伸10 min。取出反应管，分别取各退火 温度下PCR产物各10 1在含EB的2 琼脂糖凝胶上 进行电泳 ，电压 80 V，1 h后终止 电泳 ，取出凝胶直接 在紫外投射仪上观察并摄影 。根据PCR产物特异性及 产量确定最佳退火温度。梯度PCR各列退火温度分布 见表 1和图1。 表 1 96孔 PCR仪各列退火温度分布(℃) 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国误诊学杂志 2008年 4月第 8卷第 11期 Chin J Misdiagn，Apr 2008 Vol 8 No．11 8O 60 4O 2O (。C)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (列) 图 l 96孔 PCR仪 各 列 退 火 温 度 分 布 (C) 2 结果 CYP11B2基 因经 PCR后 ，其特异性扩增产物为 一 条 537 bp的条带。梯度pCR结果(图2)显示退火温 度为57．6 C、59．0 C、59．7 C时无其他非特异性条带 干扰，结合 PCR产物亮度 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，选定最佳退火温度为 57．6 C。 l ? 3 4 5 8 7 8 9 20 1：退火温度为 51．4 C时的PCR产物 3：退火温度为 55．3 C时的PCR产物 5：退火温度为 47．7 C时的PCR产物 7：退火温度为 60．2 C时的PCR产物 9：退火温度为 59．7 C时的PCR产物 M ．D2000 {}锋 丧 53 2：退火温度为 53．3 C时的 PCR产物 4：退火温度为 45．5 C时的 PCR产物 6：退火温度为 49．4 C时的 PCR产物 8：退 火温度为 59．0 C时的 PCR产物 1O：退火温度为 57．6 C时的PCR产物 图 2 CYP11B2磊 因梯 厦 PCR 结 果 3 讨论 PCR过程 中退火温度的确定有多种方法 ，通常应 用软件 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物时 ，软件如 DNAstar、Oligo6、Primer3 会 自动给出最佳退火温度 ；人工设计 的引物也可根据 公式 Tm一4(G+C)+2(A+T)计算最佳退火温度。 但在实际操作 中软件和通用公式计算 出的退火温度出 现非特异性扩增的可能性非常大，这主要是因为最佳 Tm值受各种因素的影响等。实验时必须对引物、模 板、MgC1 浓度及 Taq酶用量进行多因素联合优化分 析 ，通过多次PCR反应才确定最佳的退火温度，因 此既费时、又费力 ，整体过程繁琐 ，得到的结果往往又 不是很理想。虽然目前市售优化的配套扩增体系如 Master mix能满足大多数实验要 求，为我们省去了对 引物 、模板、MgC1 浓度及 Taq酶用量条件的优化 ，但 是最佳退火温度的确定始终困绕多数实验人员。梯度 PCR的出现为我们提供了一条较为简单有效的途径， 梯度PCR的操作与普通PCR基本一样 ，但它是根据计 算退火温度计算值设定 PCR循环程序中退火温度变 化范 围，通过实验确定最佳反应条件。梯度 PCR程序 设计 了具有独特的梯度升 降温功能程序，只需进行最 低 (第 1列)、最高(第 12列)温度二点设定，能在 96孔 反 应基座 上形成温度梯度，中间 10列温度将根据最 低 、最高温度 自动进行梯度递增 (或递减)，一次可控制 12个点的温度变化 。根据扩增的最终效果进行比较， 确定 最佳 的扩增反应条件 ，因此 ，在摸索 PCR扩增条 件时，只需一次或少量几次反应便可寻找最佳条件。同 时，由于常用的 96孔板 PCR扩增仪共有 8行，所以一 次反应可以最多摸索8个样品的PCR扩增条件。因此 在对多个基因的多态性分析 中，梯度 PCR无疑是一个 比较好的选择 。如CYP11B2基因进行梯度PCR，电泳 后可发现 1 0道 2017三年级奥数题100道及答案2017三年级奥数题100道及答案小学二年级奥数题100道及答案五年级解方程100道基督教要道问答100道 退火温度在 57．6 C时 ，PCR扩增效率 是最大的。运用梯度PCR确定 目的基 因的最佳退火温 度 唯一障碍 是对 目的基 因退火温度范 围的确定，即 Grad温度 ；经过多次试验结果表明可根据一下原则可 以解决大部分 Grad温度范围的确定问题 ：对于移用参 考文献的引物 ，可以根据参考温度确定 目的退火温度 的范围；对于新设计 的引物，则可以根据软件和经典公 式计算 的退火温度来确定 目的基 因的退火温度 的范 围 。 梯度PCR扩增是优化PCR反应条件的较好方法， 不仅能对退火温度 、并且能对PCR步骤 中的其他温度 设置进行优化 ，其优化范围根据每台具体的PCR扩增 仪不同，本室可达±15 C。梯度PCR程序设计简单、直 观、快速，适用于各种核酸分子 (RNA、DNA)的扩增 ， 具有高效率、高通量的优点 ，适用于摸索实验条件时， 多次实验可同时在一台仪器上完成 ，既节省实验时间、 提高效率，又节省实验成本。而且 ，梯度PCR扩增实验 的扩增条件能够很简单准确的移植到其他常规 PCR 扩增上。本实验利用了梯度PCR可同时设置不同退火 温度的特点将同一原发性高血压患者CYP11B2基因 启动区同时进行一次性有效扩增。结果表明，本实验成 功应用 了梯度 PCR的方法，仅需要一套温度程序扩 增 ，既可完成对 PCR条件的优化又能在较短时间内快 速完成基因的扩增。梯度PCR在操作和对仪器设备上 与普通PCR也没有区别和特殊的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 ，非常适合在各 舯脚卿 脚 脚 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国误诊学杂志 2008年 4月第 8卷第 11期 Chin J Misdiagn，Apr 2008 Vol 8 No．11 2529 种大中小科研机构和医疗卫生机构推广运用 ，可以为 基因的扩增 中寻找最佳退火温度提供 了快速可靠 的方 法，如果与多重PCR联合运用可同时对某些疾病多基 因的扩增提供有效手段 ，具有广阔的应用前景。 【参考文献】 [1] 魏太云 ，林含新，谢联 辉．PCR—SSCP分析 条件的优化[J]．福建农 林大学学报 (自然科学版)，2002，3(31)：22～25． r2] Brilla CG，Zhou G，Rupp H，et a1．Role of angiotensin II and prostaglandin E2 in regulating cardiac fibroblast collagen turnover[J]．A133 J Cardiol，1 995，76(13)：8D 13D． [3] Lodwick D，Kaiser MA，Harris J，et a1．Analysis of the role of an— gio tensinogen in spontaneous hypertension[J]．Hypertension， 1995，25(6)：1245一l251． [4] 张其鹏，张丹，刘贝，等．高血压相关基因和蛋白质数据库的初构 EJ]．北京大学学报(医学版)，2002，34(2)：178—183． Es3 李爱丽，姜涛，马峙英，等．提高PCR产物的几种有效方法EJ]．生 物技术 通报 ，2003，2：33—35． 收稿 日期 ：2007—09—20；修回日期 ：2008—02 14 责任编辑 ：许纬洲 急性会厌炎 135例诊治分析 张红 一 ，蒲雨鑫 【主题 词】 会厌炎／诊断 ；会厌炎／治疗 【中图分类号1 R767．5 【文献标识码】 B 【文章编号1 1009—6647(2008)11 2529—01 对我科 1993—10／2005—05收治 的急性 会厌炎 135例分析 如 痊愈 。 下 。 1 临床资料 1．1 一般 资料 本组男 96例 ，女39例 ，年龄 22～68岁 ，其 中40 4 52岁 占45 左右。就诊时间于发病后3～30 h，住院治疗 时间 4～ 15 d。 1．2 临床表 现 以剧 烈 的咽痛 、吞 咽痛 、吞 咽 困难 为 主要 症 状 ，多数伴有发热 (116例)，有少数就诊时有不 同程度 的呼吸困 难 (8例 )。查体 ：间接喉镜下可见会厌舌 面黏膜充血 、水肿 ，会厌 呈球状或平 台状 ，不能抬举 ，病程长者 (>24 h)表现为黏膜肥厚 感，充血略呈暗红色，有时伴有脓肿形成。重者颈前部软组织肿 胀 、压痛。呼吸困难 以吸气期为主 。 1．3 辅 助检查 本 组血常规 检查均显 示 白细胞 总数 升高 ，中 性粒细胞计数多数偏高。 1．4 治疗方法 确诊后首 先给予地 塞米松 10 rag／次 ，肌注或 静点 ，病情重时立 即静推 ，同时给予足量 的抗生素静点 。包括青 霉素、氨苄青霉素、红霉素、阿奇霉素、头孢类、克林霉素、磷霉 素钠以及喹诺酮类等等 。再给予雾 化吸人、微 波理 疗、退热 、补 液、呼吸困难者吸氧等对症及支持治疗。做好气管切开的准备。 脓肿形成并 局限者 于间接喉镜下脓肿切开。吸气期 呼吸困难 Ⅲ 度及以上者立即气管切开 。 2 结果 本组中 2例 紧急气 管切开 ，其 中 1例 因在 内科 以上呼吸道 感染治疗 ，未应用激素 ，治疗后 出现 Ⅲ度呼吸困难 。另 1例延误 就诊，就诊时 Ⅲ度呼吸困难。其余132例均经积极抗炎治疗而痊 愈 。 3 讨论 急性会厌炎是一种 以声 门上 区会厌为主 的急性 炎症 ，是 喉 科急重症之一，病情发展极快，如果治疗不及时不恰当，易导致 喉阻塞 ，甚至窒息死亡 ，但 如果及时确诊及正确 治疗 ，一 般均可 作者单位：辽宁省大连市第五人民医院耳鼻咽喉科 116021 【经验交流】 由于会厌舌 面及其侧缘杓会厌襞 的黏膜较松驰 ，炎症后可 引起会厌高度充血肿胀 ，可使 其增厚 至 6～7倍_l_。会厌 的静脉 血流 均通过会厌根部 ，炎症 浸润压迫 ，静 脉 回流受阻 ，一方面是 水 肿显著 ，一方面水肿 不易消退 。这 就决定 了急性会 厌炎早发 现 、早治疗的意义。 急 性会厌炎 的主要 病因是感 染 ，致病 菌有 乙型流感杆 菌、 葡萄球菌、链球菌等 。在具体诊治过程中我们的体会也是如 此 。在本组病 例中 ，实验室化验检查 白细胞总数升 高。由于病情 的急重，无法对每个患者进行咽拭子菌培养及药敏检查，抗生 素的选择取决于患者有无药敏史、当班医生的经验等。在本组 中 ，所应 用的抗 生素种类 很多 ，抗 生素 的选择 与愈后 的关系无 统计学意义。但地塞米松 的适时和适量应用却与疾病的转 归有 很大关系 ，尽 早、适量 、适时停用等都 是治疗的关键所在 。尽早 应用适量地塞米松可避免气 管切开 给患者带来 的痛苦 。如本 组 中第 1例气管切开者 。适 时停用可避免疾病 的反复及过量应用 激素。我们一般 以地塞米松 10 rag／次开始 ，随着水肿逐渐减退 ， 改为 5 rag／次 ，直至水肿彻底消失。本组 中应用地塞米松最短者 3 d，最 长者 11 d 通过 回顾本组 病例 ，我们认 为对 于急性会厌 炎 的治疗 ，糖 皮质激 素的尽早、适量应用是非 常关键 的。激素有 治疗 和预防 会厌 、杓会 厌襞水 肿的作用 ，同时又有非 特异性 抗炎 、抗过敏 、 抗休克 等作用 ]。随 即是 足量的抗生素 的使用 ，抗生 素的选择 没 有特 定的要求。当患者出现吸气期 呼吸困难 Ⅲ度 以下 ，仍可 在做好气管切开 的准备下进行抗炎治疗 ，观察病情的进展。 【参考文献】 [1] 黄选兆，汪吉宝．实用耳鼻咽喉科学[M]．北京：人民卫生出版社 l998：456-457． [2] Itl勇泉．耳鼻咽喉科学[M]．5版．北京：人民卫生出版社，2001 l85． [3] 谭建国．成人急性会厌炎512例分析EJ]．临床耳鼻咽喉科杂志 2002，l6(7)：358． 收稿 日期 ：2007—08 12；修回 日期 ：2007 12—14 责任编辑 ：魏建 维普资讯 http://www.cqvip.com