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新药药代研究所需的药物及代谢物分析技术、方法学研究及注意要点---中国科学院上海药物研究所、上海药物代谢研究中心——李川

新药药代研究所需的药物及代谢物分析技术、方法学研究及注意要点-…

上传者: lwjxz 2011-07-14 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《新药药代研究所需的药物及代谢物分析技术、方法学研究及注意要点---中国科学院上海药物研究所、上海药物代谢研究中心——李川pdf》,可适用于自然科学领域,主题内容包含新药药代研究所需的药物及代谢物分析技术、方法学研究及注意要点新药药代研究所需的药物及代谢物分析技术、方法学研究及注意要点药代动力学与生物等效性研究培符等。

新药药代研究所需的药物及代谢物分析技术、方法学研究及注意要点新药药代研究所需的药物及代谢物分析技术、方法学研究及注意要点药代动力学与生物等效性研究培训班国家食品药品监督管理局培训中心李川(chlimailshcncaccn)中国科学院上海药物研究所上海药物代谢研究中心年月日杭州演讲内容一新药药代研究与生物样品分析二检测生物样品中的药物浓度三生物样品中药物的代谢物谱分析四未知代谢物结构鉴定一新药药代研究与生物样品分析涉及生物样品的药物分析技术是开展新药药代动力学研究的一项关键技术。通过分析获取的信息包括:()药物存在的形式()药物的浓度()浓度变化的动态特征()改变浓度的关键因素药物作用作用靶位药物活性药物浓度新药的药代动力学研究新药的药代动力学研究一新药药代研究与生物样品分析浓度的可测性?在作用部位的药物浓度通常很难直接检测!!!()采样困难(伦理、知识、技术)()没有适合的检测技术(灵敏度、可靠性)()没有标准品(缺标尺)()分析目标不明确在作用部位的药物浓度通常很难直接检测!!!()采样困难(伦理、知识、技术)()没有适合的检测技术(灵敏度、可靠性)()没有标准品(缺标尺)()分析目标不明确()用替代方法进行分析血药浓度分析WhyandHow()多种分析手段相结合一新药药代研究与生物样品分析新药药代研究与生物样品分析药代研究的需求决定分析方法的发展!!!药代研究的需求决定分析方法的发展!!!药代研究的需求()分析工作进展要快()分析结果要准且可重复()分析数据全面()降低采样要求二测定生物样品中的药物浓度测定生物样品中药物浓度的要素和步骤液质联用分析技术及基质效应的干扰解决分析困难的一些技术分析方法的建立和可靠性验证围绕药代研究需求发展的一些分析方法二生物样品中药物浓度的测定测定生物样品中药物浓度的要素和步骤()药代研究需求要获得什么信息?准确性要求?灵敏度要求?()生物样品是否含有信息?何种样品?样品初始量?样品数量?样品存放?()被测化合物是否含有信息?有几种被测物?是否有标准品?主要暴露形式?有无药效活性?是否与毒性相关?()分析技术用何种检测技术?能否直接检测?灵敏度和准确性?是否需要附加技术?如何转变被测物的形式以便检测?生物样品分析方法的发展要满足药代研究获取信息的要求信息!!可靠性!!二生物样品中药物浓度的测定测定生物样品中药物浓度的步骤动物试验体外试验人体试验生物样品生物样品研究报告研究报告样品预处理样品预处理色谱分离色谱分离质谱检测质谱检测数据处理数据处理分离转变被测物后进行检测含被测物的混合物气态离子状被测物分离转变分离分离转变分离液质联用分析技术及基质效应的干扰二生物样品中药物浓度的测定液相色谱仪液相色谱仪离子源离子源质谱仪质谱仪高压系统真空系统过渡提供色谱分离影响质谱工作分子变离子决定灵敏度提供质谱分离提供结构信息完成分析检测电喷雾离子源(ESI源)较适用于极性、非挥发性、分子较大、热稳定性差的化合物源上断裂少易受基质效应的影响。大气压化学离子源(APCI源)较适用非极性化合物流动相流速较高(–mLmin)易产生源上断裂基质效应影响较小。大气压光离子源(APPI源)与APCI源结构类似但使用光电离灯和dopant较适用于某些中型、质子亲和性不好的化合物。液质联用的离子源二生物样品中药物浓度的测定二生物样品中药物浓度的测定在药物分析中广泛应用的ESI源易受基质效应的影响基质效应(Matrixeffects,ME)是指在色谱分离中与被测物共流出的样品残留基质成分对被测物电离过程的影响。通常出现抑制或增强被测物的检测相应进而影响分析的精密度和准确性。Matrixeffects:TheAchillesheelofquantitativeLC–MSMSPaulJTaylor“绝对”基质效应:表示基质效应影响分析的程度。“相对”基质效应:表示样品间基质效应大小的差异。亲水性基质成分尿样中的盐胆汁样品中的盐磷脂类物质药物生成的代谢物一同使用的药物制剂加工中使用的辅料物质血浆抗凝剂(如:肝素锂)不同厂家生产的分析用试管所带的外源性物质色谱柱样品过载二生物样品中药物浓度的测定样品中哪些物质会产生基质效应?二生物样品中药物浓度的测定在利用液质联用技术开展生物样品分析时需了解和克服基质效应对分析的干扰TheGuidanceforIndustryBioanalyticalMethodValidationissuedbyUSFDAhasexplicitlyindicatedtheimportanceoftakingappropriatestepstoensurethelackofmatrixeffectsthroughouttheapplicationofLCMSorLCMSMSbasedmethodwhenthenatureofthematrixchangesfromthematrixusedformethodvalidation以往有一种看法:采用液质联用技术可以简化甚至省去样品前处理和色谱分离步骤。二生物样品中药物浓度的测定评判基质效应的方法Postcolumninfusionmethod直观地显示受基质效应影响的被测物色谱保留时间范围和影响程度Postextractionspikingmethod既提供绝对基质效应数据也提供相对基质效应数据AnalChem:RapidCommunMassSpectrom:关于基质效应的综述性文献ClinBiochem:MassSpectromRev:JChromatogrB:二生物样品中药物浓度的测定Postcolumninfusion方法SyringePump(analyte)TeeABAutosampler(Extractofblankbiosample)Massspectrometer(ESIinterface)LCcolumnLCPumpRapidCommunMassSpectrom:用Postcolumninfusion方法检测基质效应(抑制)二生物样品中药物浓度的测定Postextractionspiking方法SetSetSet被测物溶于有机溶剂提取异源空白生物样品制成溶剂被测物溶于上述溶剂被测物加入异源空白生物样品中提取样品用有机溶液复溶残渣影响被测物检测的因素仪器及系统操作影响被测物检测的因素仪器及系统操作基质成分影响被测物检测的因素仪器及系统操作基质成分提取回收率AnalChem:SetvsSet基质效应(绝对基质效应和相对基质效应)SetvsSet样品提取回收率二生物样品中药物浓度的测定解决分析困难的一些技术如何提高分析的灵敏度?如何有效克服基质效应?液相色谱电解质效应脉冲梯度色谱技术稳定同位素内标物二生物样品中药物浓度的测定提高分析的灵敏度高灵敏度分析给药代研究带来的好处有利于测算药物的t可降低生物样品的初始用量有助于动物福利保护可节约候选化合物、代谢酶等的用量开展微量试验可开展低剂量药代试验提高分析灵敏度的手段选择最合适的离子源比较正、负电离模式选择最合适的母离子采用二级质谱分析利用液相色谱电解质效应和脉冲梯度色谱技术或利用流动相对质谱检测的其它影响加大样品的初始用量在样品预处理中采用浓缩技术方法灵敏度vs检测灵敏度浓度LLOQvs质量LLOQ(oncolumnLLOQ)检测相应噪音水平低浓度下峰保存二生物样品中药物浓度的测定克服基质效应的影响当测试发现分析中存在基质效应的影响时可采用以下措施解决问题。()选择合适的样品预处理方法()改变被测物的色谱分离条件()采用稳定同位素内标()采用小进样量()利用液相色谱电解质效应Matrixeffectsarecompounddependent,matrixdependent,andMPelectrolytedependentMatrixeffectsarecompounddependent,matrixdependent,andMPelectrolytedependent二生物样品中药物浓度的测定液相色谱电解质效应的发现“液相色谱电解质效应”(LCelectrolyteeffects)是指:当在流动相中使用极低浓度(以往通常不用的浓度)的甲酸铵等电解质加入后会产生一种十分有利于液质联用检测的效果即:ESI质谱的检测响应获得显著提高且复杂生物样品的基质效应被大大减弱。Relativeanalyteresponse()LQALQNLQGConcentrationofHCOONH(gmL)inLCeluent‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)TestedflavonoidILAILNILGOOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOOHOOOOHOHOHOHOOHOOHOHOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOHOHOOOOHOHOHOHOHOHOOHRelativeanalyteresponse()LQALQNLQGConcentrationofHCOONH(gmL)inLCeluent‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)TestedflavonoidILAILNILGOOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOOHOOOOHOHOHOHOOHOOHOHOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOHOHOOOOHOHOHOHOHOHOOHTestedflavonoidPeakarea()LQALQNLQGILAILNILGSolutionPlasmaSampleTestedflavonoidPeakarea()LQALQNLQGILAILNILGSolutionPlasmaSampleRelativeanalyteresponse()LQALQNLQGConcentrationofHCOONH(gmL)inLCeluent‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)TestedflavonoidILAILNILGOOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOOHOOOOHOHOHOHOOHOOHOHOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOHOHOOOOHOHOHOHOHOHOOHRelativeanalyteresponse()LQALQNLQGConcentrationofHCOONH(gmL)inLCeluent‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)‰(pH=)TestedflavonoidILAILNILGOOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOOHOOOOHOHOHOHOOHOOHOHOHOOOOHOOHOOHOHOHOHOHOHOOOOHOHOHOHOHOHOOHTestedflavonoidPeakarea()LQALQNLQGILAILNILGSolutionPlasmaSampleTestedflavonoidPeakarea()LQALQNLQGILAILNILGSolutionPlasmaSampleJAmSocMassSpectrom:二生物样品中药物浓度的测定液相色谱电解质效应的特点RelativeAbundance()NL:InjectionofblankbiosampleNL:NL:QCTKMFISRNL:NL:NL:NL:NL:NL:InjectionofblankbiosampleInjectionofblankbiosampleNL:NL:NL:InjectionofblankbiosampleTime(min)InjectionofblankbiosampleNL:NL:NL:NL:ENL:NL:InjectionofblankbiosampleNL:CanineplasmaCanineplasmaprehydrolyzedwithMHClElectrolytefree‰HCOONH‰HCOOHRelativeAbundance()NL:InjectionofblankbiosampleNL:NL:QCTKMFISRQCTKMFISRNL:NL:NL:NL:NL:NL:InjectionofblankbiosampleInjectionofblankbiosampleNL:NL:NL:InjectionofblankbiosampleTime(min)InjectionofblankbiosampleNL:NL:NL:NL:ENL:NL:InjectionofblankbiosampleNL:CanineplasmaCanineplasmaprehydrolyzedwithMHClElectrolytefree‰HCOONH‰HCOOHRapidCommunMassSpectrom:JAmSocMassSpectrom:Abundance()LCmobilephase‰HCOOHWithoutelectrolyte‰HCOOH()ESI()ESI()APCI()APCIQCTKMFISR‰HCOONH‰HCOONHAbundance()LCmobilephase‰HCOOHWithoutelectrolyte‰HCOOH()ESI()ESI()APCI()APCIQCTKMFISR‰HCOONH‰HCOONHAccuracy:QuercetinAccuracy:Accuracy:LCmobilephasemodifiedwithmMHCOONHLCmobilephasemodifiedwithmMHCOONHLCmobilephasemodifiedwithoutanyHCOONHPlasmaconcentration(ngmL)SignalIntensityinpeakarea(x)OHOOHOHOOHOHAccuracy:QuercetinAccuracy:Accuracy:LCmobilephasemodifiedwithmMHCOONHLCmobilephasemodifiedwithmMHCOONHLCmobilephasemodifiedwithoutanyHCOONHPlasmaconcentration(ngmL)SignalIntensityinpeakarea(x)OHOOHOHOOHOH增加ULOQ抑制基质效应增加ESI检测响应OHOOHOHOOHOHOHOOHOHOOHOHOOHOHOOHOCHQCTKMFISROHOOHOHOOHOHOHOOHOHOOHOHOOHOHOOHOCHQCTKMFISR二生物样品中药物浓度的测定脉冲梯度色谱技术BTime(min)EPSEPSPSPSCESForUPLCBTime(min)EPSEPSPCESForHPLCBTime(min)EPSEPSPSPSCESForUPLCBTime(min)EPSEPSPSPSCESBTime(min)EPSEPSPSPSCESForUPLCBTime(min)EPSEPSPCESForHPLCBTime(min)EPSEPSPCESBTime(min)EPSEPSPCESForHPLC“脉冲梯度色谱技术”(Pulsegradientchromatography)的原理是采用双溶剂系统进样后首先采用几乎是水的流动相将被测化合物保留在反相色谱柱的柱头直至极性基质成分和样品中有机溶剂(如甲醇或乙腈等)从柱上完全洗脱掉随后再用洗脱能力强的流动相以最快的速度将被测化合物从柱上洗脱下来以达到压峰、抗基质效应和抗溶剂效应的目的。脉冲梯度色谱技术的优点包括:对不同化合物的通用性好、色谱条件优化简单、压窄色谱峰能力强、能抗样品的“溶剂效应”、与“液相色谱电解质效应”相结合能进一步提高抗基质效应干扰的效果等。二生物样品中药物浓度的测定利用“液相色谱电解质效应”和“脉冲梯度色谱技术”分析血浆样品中安柔比星和安柔比星醇的浓度Injectionvolume:µLRelativeAbundance()Injectionvolume:µLTime(min)Injectionvolume:µLInjectionvolume:µLRelativeAbundance()Injectionvolume:µLTime(min)Injectionvolume:µLJChromatogrA:µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)(ABN)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)RelativeAbundance()Time(min)UPLCconventionalgradientmethodUPLCisocraticmethodUPLCpulsegradientmethodµL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)(ABN)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(IS)(ABN)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)µL(ABC)(ABN)(IS)RelativeAbundance()Time(min)UPLCconventionalgradientmethodUPLCisocraticmethodUPLCpulsegradientmethodHCOOHconcentrationinmobilephase(mM)Peakarea(x)LLOQ(ngmL)HCOOHconcentrationinmobilephase(mM)Peakarea(x)LLOQ(ngmL)OHOOOHONHOOOHOHABCCHNOMW:OHOOOHOHNHOOOHOHABNCHNOMW:CHOHOHOOOHOOHOOCHONHOHHCISCHNOMW:OHOOOHONHOOOHOHABCCHNOMW:OHOOOHONHOOOHOHABCCHNOMW:OHOOOHOHNHOOOHOHABNCHNOMW:OHOOOHOHNHOOOHOHABNCHNOMW:CHOHOHOOOHOOHOOCHONHOHHCISCHNOMW:CHOHOHOOOHOOHOOCHONHOHHCISCHNOMW:克服大进样量带来的基质效应和溶剂效应二生物样品中药物浓度的测定稳定同位素内标的使用稳定同位素内标Stableisotopelabeledanalogsarechemicallyandstructurallythesameastheirtargetdrugsbutdifferinmolecularmass在分析中使用内标的主要原因:抵消样品预处理、进样、仪器参数等对被测物检测响应造成的变异。许多研究表明使用稳定同位素内标能有效地抵消基质效应对生物样品分析造成的影响但应注意被测物在高浓度时对内标检测相应的影响。RapidCommunMassSpectrom:RapidCommunMassSpectrom:二生物样品中药物浓度的测定使用内标物前后基质效应对检测Fluoxitine及其代谢物Norfluoxetine影响的比较FluoxetineNorfluoxetineISRapidCommunMassSpectrom:二生物样品中药物浓度的测定分析方法的建立和可靠性验证生物样品分析方法的建立包括两个阶段前一阶段主要是优化方法所涉及的各种条件后一阶段主要是从多个角度来验证方法的可靠性。只有通过可靠性验证的分析方法才能用于新药药代动力学研究。在方法建立第一阶段的关注重点:()提高分析的灵敏度(提高样品预处理回收率、提高质谱检测响应等)()避免和减小基质效应对分析的影响()避免影响分析方法的可靠性(特异性、准确度、精密度等)二生物样品中药物浓度的测定建立分析方法的工作程序优化与确定被测物检测条件(暂不考虑生物样品)考察与克服基质效应(考察样品预处理方法)(优化色谱条件)(采用同位素内标)提高分析的灵敏度考察分析的浓度范围(考察样品预处理方法)(利用液相色谱电解质效应)(利用脉冲色谱梯度)预测药代研究所需的分析灵敏度使用同位素内标或其它内标分析方法的可靠性验证二生物样品中药物浓度的测定分析的准确性分析的精密度分析的特异性分析的灵敏度分析的可重复性被测物的稳定性基质效应对分析的影响样品提取回收率内标的可靠性验证Fullvalidation(新建分析方法)Partialvalidation(对原有方法进行部分调整)(分析方法在实验室间传递)Crossvalidation(两个或多个分析方法被用于研究)Accuracy(准确性):ThedegreeofclosenessofthedeterminedvaluetothenominalorknowntruevalueunderprescribedconditionsPrecision(精密度):Theclosenessofagreement(degreeofscatter)betweenaseriesofmeasurementsobtainedfrommultiplesamplingofthesamehomogenoussampleundertheprescribedconditionsRecovery(回收率):Theextractionefficiencyofananalyticalprocess,reportedasapercentageoftheknownamountofananalytecarriedthroughthesampleextractionandprocessingstepsofthemethod二生物样品中药物浓度的测定分析的准确性、精密度及样品预处理的回收率二生物样品中药物浓度的测定考察基质效应在第一阶段和第二阶段的异同第一阶段(建方法)“Postcolumninfusion方法”和“Postextractionspiking方法”都会使用。评估基质效应对分析的影响情况为采取措施提供建议帮助方法优化。在建分析方法的早期即开始关注基质效应问题由此可减少分析方法在后期应用时出现失败。第二阶段(方法可靠性验证)主要采用“Postextractionspiking方法”。检验优化好的分析方法受基质效应影响的情况包括“绝对基质效应”和“相对基质效应”。二生物样品中药物浓度的测定内标的可靠性验证内标与生物样品(内标不是生物样品中的内源性物质、生物样品未被内标污染)内标与被测物(内标与被测物有不同的质量数、不是被测物的代谢物、但化学结构相近)内标的检测响应(内标与被测物有相似的检测响应、能在相同的离子化模式下工作、内标与被测物在二级质谱CID打碎的情况相近)内标受基质效应的影响(内标受到的基质效应影响应在可接受的范围、内标与被测物在对基质效应的反应上基本同步且程度相近)内标的理化特性(在影响质谱检测响应和色谱行为的理化性质上内标与被测物相同或相近)RapidCommunMassSpectrom:应用液质联用技术分析血中Sophocarpine的浓度:分析方法的建立及其可靠性验证二生物样品中药物浓度的测定SC血药浓度测定:第一阶段(建方法)IntensityMHSCCHNOMW:mzMHISCHNOMW:NNOHHHHNOOHOHOHIntensityMHSCCHNOMW:mzMHISCHNOMW:NNOHHHHNOOHOHOH优化并确定被测物Sophocarpine(SC)的液质联用检测条件证明内标在此条件下检测响应良好。APImassspectrometerIonizationmode:ESIIonpairs:mz(SC)mz(IS)LCmethod:IscraticelutiononCcolumnSamplethroughput:mininjection液液提取法的优化既关注提取回收率也关注基质效应。二生物样品中药物浓度的测定样品预处理方法的比较:LiquidliquidextractSC血药浓度测定:第一阶段(建方法)二生物样品中药物浓度的测定SCISpeakarearatio,YSCISpeakarearatio,Y标准曲线SC血药浓度测定:第一阶段(建方法)二生物样品中药物浓度的测定被测物SC及内标IS的稳定性(I)Control()()()MeanSD(RSD)InMTBEatoCforh―Control―()()MeanSD(RSD)InplasmaafterfreezethawcyclesofoCControl()()()MeanSD(RSD)InplasmaatoCforh―Control―()()MeanSD(RSD)InplasmaatoCformonthsngmLngmLngmLISSCPeakarea()SC血药浓度测定:第二阶段(方法可靠性验证)二生物样品中药物浓度的测定ControlIS:()SC:()MeanSD(RSD)InSCstocksolution(μgmL)orinISspikingsolution(ngmL)atoCformonthsControlIS:()SC:()MeanSD(RSD)InSCstocksolution(μgmL)orinISspikingsolution(ngmL)atoCfor

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