硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测定灵芝多糖含量比较

第 28卷 � 第 9期 2 0 1 0年 9月 中 � 华 � 中 � 医 � 药 � 学 � 刊 CH INESE� ARCH IVES� OF� TRAD IT IONAL� CH INESE� MED IC INE Vo.l 28 No. 9 Sep. 2 0 1 0 中华中医药 2000� 学刊 硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测定灵芝多糖含量比较 郭晓蕾 1,朱思潮2,翟旭峰 1,王怀豫1,宝 � 丽 2 ( 1.无限极 (中国 )有限公司, 广东 广州 510665; 2.中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学实验室,北京 100101) � � 摘 � 要:目的:比较硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测定灵芝多糖含量的差异。方法: 分别采用上述两种方法利用 紫外可见分光光度计测定灵芝中多糖的含量。结果: 利用上述两种方法分别测定同一样品灵芝多糖的含量, 硫酸 蒽酮法测定结果高于硫酸苯酚法。结论: 两种方法均操作简便,稳定可行, 较之硫酸苯酚法,药典记载的硫酸蒽酮 法更加科学合理。 � � 关键词:灵芝多糖;硫酸蒽酮法; 硫酸苯酚法;含量测定 中图分类号: R284. 1� � � � 文献标识码: A� � 文章编号: 1673- 7717( 2010) 09- 2000- 03 Comparison ofMethods in Determ ination ofPolysaccharide inGanode rma Luc idum GUO X iao�lei1, ZHU Si�chao2, ZHA IXu�feng1, WANG H ua i�yu1, BAO L i2 ( 1. Inf in itus( ch ina) C om pany L td, Gu angzhou 510665, Guangdong, Ch in a; 2. Key Lab of Systemat ic Mycology and L ichen ology, In stitute ofM icrob iology, Ch ineseA cad em y of Scien ces, Bei jing 100101, Ch ina) Abstrac t: Objective: To com pare d ifference in determ ination con tent between pheno l- v itr io lic co lor im etry m ethod and an throne su lphuric ac id co lor ime try m ethod for po lysacchar ides in Ganoderm a lucidum. M ethods: Above tw o m ethods we re emp loyed to dete rm ine con tent of po lysacchar ides byUV spectrophotography. Results: The de term ina tion va lue o f an� throne- su lphuric ac id co lor ime try m ethod is high than the phenol- v itr io lic color im etrym ethod. Conclusion: The resu lt of anthrone- su lphur ic ac id co lor im etry m ethod is m o re reliable and accurate, it can be considered as the optim um assay me thod for po ly sacchar ides in Ganoderm a lucidum. Keywords: Ganoderma lucidum po lysacchar ide; anthrone su lphuric ac id co lo rim etry; pheno l- v itrio lic color im etry; content determ ination 收稿日期: 2010- 04- 15 作者简介:郭晓蕾 ( 1975- ) ,女, 辽宁人,主管药师,硕士,研究方 向:中药保健食品。 通讯作者:宝丽 ( 1981- ),女 (蒙古族 ) ,辽宁人,助理研究员,博士, 研究方向:中药药理及活性成分研究。 灵芝 [Ganoderma lucidum ( L eys. ex F r. ) Ka rst]为担子 菌亚门多孔菌科灵芝属真菌, �中华人民共和国药典 2000 年版将灵芝补录, 并将其指定为赤芝 Ganoderma lucidum ( Curtis: F r. )或紫芝 G anoderma sinense Zhao, Xu et Zhang 的干燥子实体。�神农本草经 将灵芝列为上品药物, 认为 有 !益心气∀ !安精魂∀!补肝益气∀!坚筋骨∀之功效。灵芝 有灵芝多糖、氨基酸、蛋白质、多肽、甾体、萜类、有机酸、挥 发油、生物碱等多种化学成分 ,其中灵芝多糖因其具有抗肿 瘤 [ 1- 2]、提高机体免疫力 [ 3]、耐缺氧能力、消除体内自由 基 [ 4]、抗辐射、提高肝脏解毒功能、降血糖、降血脂 [ 5- 6]等作 用,而被认为是灵芝药用的主要有效成分。目前市场上灵 芝加工产品较多, 其质量参差不齐, 又缺乏统一的质量标 准。为了比较评价以灵芝多糖为有效成分的灵芝原料或灵 芝产品的质量,本实验对硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法测定同 一批样品灵芝多糖含量进行了比较研究, 旨在为以灵芝多 糖为有效成分的灵芝原料和灵芝产品质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的制定提供 理论依据。 1 仪器与试剂 岛津 UV - 2500型紫外可见分光光度计 (日本岛津公 司 ), KQ500B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公 司 ), Sartor ius BS110S分析天平 (北京赛多利斯仪器有限公 司 )。 苯酚、硫酸、蒽酮均为国产分析纯试剂, 葡萄糖标准品 (批号: 11083- 200503)购自中国药品生物制品检定所。 灵芝子实体由无限极 (中国 )有限公司提供。 2 实验方法 2. 1� 样品制备 灵芝子实体粉碎, 过 80目筛, 取 2g干粉加入 90mL水 加热回流提取 2h,提取液抽滤后定容至 100mL, 取 10mL加 入 150mL无水乙醇, 4# 放置 12h沉淀多糖, 离心, 弃上清, 2000 第 28卷 � 第 9期 2 0 1 0年 9月 中 � 华 � 中 � 医 � 药 � 学 � 刊 CH INESE� ARCH IVES� OF� TRAD IT IONAL� CH INESE� MED IC INE Vo.l 28 No. 9 Sep. 2 0 1 0 中华中医药 2001� 学刊 沉淀加水溶解,并定容至 50mL,得到样品溶液。 2. 2� 试剂配制 5%苯酚溶液的制备: 精密称取 10g苯酚, 加入 200mL 水使溶解,混匀 (棕色瓶保存 )。 硫酸蒽酮溶液的制备: 精密称取蒽酮 0. 1g,加 80%的 硫酸溶液 100mL使溶解,摇匀 (棕色瓶保存 )。 对照品溶液的制备: 精密称取无水葡萄糖 10m g, 加水 定容至 100mL, 摇匀, 即得 0. 1m g /mL的葡萄糖对照品溶 液。 2. 3 硫酸 -苯酚法 2. 3. 1 标准曲线的绘制 � 分别精密量取 0. 1m g /mL的葡 萄糖对照品溶液 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7mL置于 10mL具塞试管中, 依次添加水使终体积为 1. 0mL, 空白对 照为水 1. 0mL, 各加入 5%苯酚溶液 1�0mL, 振摇混匀,加入 6. 0mL浓硫酸, 迅速振摇混匀, 于室温放置 30m in后测定 490nm处吸光度。以葡萄糖溶液的浓度 ( mg /mL )为横坐 标,吸光度 A为纵坐标,绘制标准曲线。 2. 3. 2 精密度实验 � 精密量取葡萄糖对照品溶液 25mL, 加水定容到 50mL容量瓶中, 制备 0. 05mg /mL的葡萄糖溶 液。取 0. 05m g /mL的葡萄糖溶液 1. 0mL置于 10 mL具塞 试管中, 按照标准曲线项下自 !各加入 5% 苯酚溶液 1�0mL∀起操作,连续测定 6次考察仪器精密度。 2. 3. 3 稳定性实验 � 取 0. 05mg /mL的葡萄糖溶液 1. 0mL 置于 10mL具塞试管中,按照标准曲线项下自 !各加入 5% 苯酚溶液 1. 0mL∀起操作。测定在反应结束后 0、10、20、 30、40、50、60、90、120、150m in的吸光度。 2. 3. 4 样品含量测定 � 8批灵芝子实体干粉分别取 2 g 按照 2. 1项下 !样品制备 ∀方法制备样品溶液。取 0. 4mL 样品溶液并加入水补足到 1. 0mL, 按照标准曲线项下自 !各 加入 5%苯酚溶液 1. 0mL∀起操作, 由回归方程计算, 即得 样品含量。 2. 3. 5 回收率实验 分别精密量取 3份样品溶液 0. 4mL 置于 10mL具塞试管中, 依次添加 0. 1mg /mL的葡萄糖溶液 0. 36、0. 30、0. 24mL,并加入水使终体积为 1. 0mL,空白对照 为水 1. 0mL,得到 3个水平的供试品溶液, 测定含量, 计算 回收率。 2. 3. 6 重现性实验 称取同一批次灵芝子实体干粉 5 份,按照 2. 1项下 !样品制备∀方法和 2. 3. 4项下 !样品含 量测定∀方法进行操作, 考察操作方法的重现性。 2. 4 硫酸 -蒽酮法 2. 4. 1 标准曲线的制备 � 按照中国药典的方法: 分别精 密吸取对照品溶液 ( 0. 1mg /mL ) 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2mL,置 10mL具塞试管中,加水至 2. 0mL, 精密加入硫酸蒽 酮溶液 6mL, 置水浴中加热 15m in, 取出, 放入水浴中冷却 15m in,以相应的试剂为空白, 按照紫外 -可见分光光度法, 测定 625nm波长处吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横 坐标,绘制标准曲线。 2. 4. 2 稳定性实验 � 取 0. 05mg /mL的葡萄糖溶液 2. 0mL 置于 10mL具塞试管中,按照标准曲线项下自 !精密加入硫 酸蒽酮溶液 6mL∀起操作。测定在反应结束后 0、10、20、 30、40、50、60、90、120、150m in的吸光度。 2. 4. 3 样品含量测定 � 8批灵芝子实体干粉分别取 2g过 80目筛灵芝干粉,按照 2. 1项下 !样品制备∀方法制备样品 溶液。取 2mL样品溶液按照标准曲线项下自 !精密加入硫 酸蒽酮溶液 6mL∀起操作, 由回归方程计算, 即得样品含 量。 2. 4. 4 重现性实验 � 称取同一批灵芝子实体干粉 5份, 按照 2. 1项下 !样品制备∀方法和 2. 4. 3项下 !样品含量测 定∀方法进行操作,考察操作方法的重现性。 3 结果与分析 3. 1 硫酸苯酚法实验结果与分析 3. 1. 1� 标准曲线的绘制及回归方程的建立 � 利用上述方 法制作标准曲线如图 1所示。通过对数据进行线性回归, 得到多糖测定过程中, 浓度 - 吸光度的回归方程: y= 7� 3531x- 0. 0219 ( 0. 02 ~ 0. 07mg /mL ), 相关系数 R2 = 0� 9995, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明方程的拟合度较好。 图 1 硫酸 -苯酚法标准曲线 3. 1. 2 精密度的测定 从表 2可见,仪器精密度良好, 所 测 6次 RSD为 0. 12%。 表 2 精密度实验结果 ( n= 6) 1 2 3 4 5 6 RSD% 吸光度 A 0. 420 0. 421 0. 420 0. 420 0. 421 0. 420 0. 12% 3. 1. 3 稳定性实验的测定 � 实验结果表明, 随着放置时 间的延长 ,吸光度值逐渐减小, 因此建议在 20m in内完成测 定。 表 3 稳定性实验结果 时间 0m in 10 m in 20 m in 30 m in 40 m in 50 m in 60 m in 90m in 120m in 150m in 吸光度 0. 372 0. 372 0. 370 0. 365 0. 361 0. 360 0. 359 0. 360 0. 359 0. 359 3. 1. 4� 样品含量的测定 � 从表 4可见,灵芝多糖含量均在 0. 5%以上,符合中国药典的规定。 表 4 样品含量测定实验结果 1 2 3 4 5 6 7 8 糖含量% 1. 77 0. 98 1. 63 0. 99 0. 87 1. 04 1. 17 1. 24 3. 1. 5 回收率实验的测定 � 通过加样回收率的计算,可考 察实验方法的准确度。以葡萄糖标准品为对照,硫酸 -苯酚 法进行灵芝多糖的含量分析, 加样回收率为 101�18%, RSD 为 0. 87% (表 5),所以本方法的准确度较高。 2001 第 28卷 � 第 9期 2 0 1 0年 9月 中 � 华 � 中 � 医 � 药 � 学 � 刊 CH INESE� ARCH IVES� OF� TRAD IT IONAL� CH INESE� MED IC INE Vo.l 28 No. 9 Sep. 2 0 1 0 中华中医药 2002� 学刊 表 5 回收率实验结果 样品含量 (�g) 对照品加 入量 ( �g) 测得值 ( �g) 回收率 (% ) 平均回收 率 (% ) RSD % 36 69. 50 102. 18 36 68. 58 100. 83 36 69. 94 102. 83 30 62. 05 100. 05 32. 02 30 62. 22 100. 33 101. 18% 0. 87% 30 62. 75 101. 18 24 57. 05 101. 83 24 56. 21 100. 35 24 56. 61 101. 05 3. 1. 6 重现性实验的测定 � 为考察上述测定方法是否可 靠,设计重现性实验, 用硫酸 -苯酚法进行灵芝多糖的含量 分析,如表 6所示, 结果 RSD为 1. 14% ,实验重复性好,所 得实验结果可靠。 表 6 重现性实验结果 1 2 3 4 5 RSD% 糖含量% 1. 35 1. 38 1. 35 1. 38 1. 36 1. 14 3. 2 硫酸蒽酮法实验结果 3. 2. 1 标准曲线的绘制 � 利用药典所述方法制作标准曲 线如图 2所示。通过对数据进行线性回归 ,得到多糖测定 过程中,浓度 -吸光度的回归方程: y= 11. 301x- 0. 012( 0. 01~ 0. 07mg /mL ),相关系数 R2 = 0. 9984, 表明方程的拟合 度较好。 图 2 硫酸 -蒽酮法标准曲线 3. 2. 2 稳定性实验的测定 � 实验结果表明, 随着放置时 间的延长,吸光度值逐渐减小 ,因此建议在 20m in内完成测 定。 表 7 稳定性实验结果 时间 0m in 10m in 20m in 30m in 40m in 50m in 60m in 90m in 120m in 150m in 吸光度 0. 403 0. 401 0. 399 0. 395 0. 392 0. 39 0. 389 0. 389 0. 388 0. 387 3. 2. 3� 样品含量测定 � 从表 8可见, 8批灵芝中多糖含量 均在 0. 5%以上, 符合中国药典的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 。 表 8 样品含量测定实验结果 1 2 3 4 5 6 7 8 糖含量% 2. 04 0. 84 1. 87 0. 98 0. 97 1. 47 1. 75 1. 81 3. 2. 4 重现性实验 � 为考察上述测定方法是否可靠, 设 计重现性实验,用硫酸蒽酮法进行灵芝多糖的含量分析,如 表 9所示, 结果 RSD为 0. 58% , 实验重复性好,所得实验结 果可靠。 表 9 重现性实验结果 1 2 3 4 5 RSD% 糖含量% 1. 83 1. 81 1. 83 1. 83 1. 81 0. 58 4 讨 � 论 通过硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法的比较, 笔者发现药典 记载的硫酸蒽酮法重现性要好于硫酸苯酚法, 这可能是硫 酸苯酚法影响因素较多造成的: 实验前笔者也考察了硫酸 加入量、苯酚加入量、反应时间、反应温度等因素对实验结 果的影响,可以看出这些因素都会影响最终结果。另外, 苯 酚容易氧化, 见光或氧即逐渐氧化成淡红色, 在 490nm下 对显色也有干扰。 实验中笔者还发现, 硫酸蒽酮法测得的吸光度要高于 硫酸苯酚法,而且线性范围较宽, 这可能反应试剂有关。多 糖在浓硫酸的作用下水解成单糖, 然后脱水形成呋喃环结 构的糠醛衍生物,糠醛衍生物可以和许多芳胺、酚类以及具 有活性次甲基的化合物缩合生成有色的化合物, 实验中笔 者发现糠醛衍生物与蒽酮反应产物的吸光度要高,这样测 定过程中的误差就会相对减小。 综上所述,笔者认为药典记载的硫酸蒽酮法要优于硫 酸苯酚法 ,因此建议在灵芝多糖的测定中, 还是优选硫酸蒽 酮法。 参考文献 [ 1] � 方一苇.具有药理活性多糖的研究现况 [ J] .分析化学, 1994, 22( 9) : 955- 960. [ 2] � C ao L. Z. , L in Z. B. R egu lat ion of Ganoderm a lu cidum Polyas� charides on cytotox ic T Lymphocyte indu ced by dendritric cells in vitro. Ganoderm a: Gen et ics, Ch em istry, Pharm acology and ther� apeu tics[ M ]. Beijing: M edical U n iversity P ress, 2002: 122 - 129. [ 3] � 李明春, 梁东升, 许自明, 等. 灵芝多糖对小鼠巨噬细胞 CAMP含量的影响 [ J].中国中药杂志, 2000, 25( 1) : 41- 43. [ 4] � Lei L. S. , L iM . C. , Sun L. S. G anoderm a lucidum and its com� ponents on the functions of m acrophases. Ganoderm a: G enetics, Chem istry, Pharm acology and th erapeut ics[ M ] . B eijing: M ed i� calUn ivers ity Press, 2002: 20- 23. [ 5] � 金春华,姜秀莲,王英军, 等.灵芝多糖活血化瘀作用实验研 究 [ J].中草药, 1998, 29( 7) : 470- 472. [ 6] � 李容芷.从灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的发现讨论中药 活性研究的方法途径 [ J] .北京医科大学学报, 1987, 119 ( 6) : 431. 2002