金霉素发酵过程的代谢特性及调控策略

中国抗生紊杂志2002年3月第27卷第3期 14l· 文章编号：1001．8689 c2O02}∞．01414)4 金霉素发酵过程的代谢特性及调控策略 扶教龙 储炬 刘玉伟 樊涛 庄英萍 彭皓宇 张嗣良 (华东理工太掌生l鞫反应器工程国家重点实验室， 上海200237) 摘要： 利用金霉紊链霉菌在 50L自控发酵罐中发酵生产金霉索。 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了发酵过程的糖、氧、氮和磷的 代谢特性以及菌体生长和金霉紊生物合成的规律。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，菌体前期的代谢控制显得非常重要．并对金霉 紊台成的整个过程起决定性作用。在参数相关理论的基础上，通过对发酵过程的实时优化，适宜增强前期的 菌体生长，使物质代谢流有利于流向金霉素形成的途径，从而使金霉紊的产率(效价)提高了10．3％。 关键词： 金霉索； 金霉紊链霉菌； 发酵； 代谢调控 中图分类号： TQ46S．4 文献标识码：A 金霉素(chlortetracycline，即 CTC)是属于四环素类 的一种广谱抗生素，在医疗、畜牧业和农业上有广泛的 用途。尤其在畜牧业上是用于饲料药物添加剂的八大 抗生素产品(金霉素，泰乐星和土霉素等)之一，金霉素 以其抑菌、促生长、饲料利用率高、在肌体内残留量低 的特点以及其生产技术成熟和生产成本低的优点，成 为了目前及今后较长一段时间内在饲料工业中用量最 大的抑菌促生长剂。我国的金霉素产品已出口到欧洲 和美国等发达国家。目前 ，工厂的金霉素效价一般在 lS000u／ml(不完全释放效价，下同)左右 因此，提高 CTC的效价成为厂家的当务之急。这既能提高产品的 竞争力，又能为厂家带来可观的经济效益。 cI℃的生物合成机制很复杂，在CTC的合成过程 中，不同阶段对应不同的(占主导地位的)糖代谢途径。 在菌体生长期，主要为糖酵解途径；在产抗生素期，则 遵循戊糖循环途径。其实，在发酵至 12～20h，戊糖途 径即已参与到葡萄糖代谢中。CTC的合成需要还原型 辅酶lI NADPH作为H 的受体以构成聚酮体衍生物， 而 NADPH只来自戊糖循环途径 ，可见戊糖循环途径对 CTC合成是至关重要的。另外，CTC的合成也与三羧 酸循环和脂肪酸代谢密切相关，因为 CTC的合成途径 是由乙酰辅酶 A到三羧酸循环、脂肪酸的合成和 cI℃ 的形成等三条代谢途径之一。研究发现，低产菌株的 三羧酸循环的酶活性比生产菌株高，而两种菌株中脂 肪酸的含量大致相同_1 J。由此可见，CTC的合成反应 是非常复杂的，它是受基因水平的遗传特’性、细胞水平 的代谢特性以及工程水平的传递特性三个不同水平因 素综合作用的结果，使过程参数表现为多样一性、时变 收稿日期：2oobo74Y2 惨回日期：2oo1 lI l1 作者简介：扶教龙，男．生于 1969年．博士，研究方向：生物化 L 性、不确定性和相关偶合性，使发酵过程呈现出非常复 杂的特点 。 由于发酵过程酶学研究的困难，以及过程数据采 集和处理的困难，发酵工艺优化研究的基本思路仍旧 是寻找最佳培养基配方和最佳的操作条件，其本质是 以细胞代谢流为控制要点，使物质代谢最大程度地流 向目的产物形成的代谢途径。本文在50L自控发酵罐 上，采用多参数检测和控制系统，以数据驱动型方法对 发酵过程参数趋势曲线进行相关分析- ，较深入的分 析和研究了CTC发酵过程的糖、氧、氮和磷代谢状况， 揭示了该过程的代谢特点及菌体生长和产物形成的规 律，提出了相应的调控策略。 1 材料和方法 1．1 菌种和培养方法 菌种：金霉 素链 霉 菌 (Streptomyces ameofaclens) 9l 培养基成分：淀粉、黄豆粉、玉米浆、酵母粉、硫酸 铵、磷酸二氢钾、氯化钠等。 培养方法：种子经过20h左右培养后移人发酵罐； 在发酵罐中作补料分批培养，进行金霉素的发酵生产 过程，到 120h左右放罐。 1 2 实验装置 发酵培养装置(发酵罐和过程参数检测与控制系 统 FUS-50L(A))是由国家生化工程技术研究中心(上 海)提供；氧气分析采用热磁分析仪(Magnos 4G)，二氧 化碳分析采用分光红外分析仪(Uras 3G)，均为H&B公 司生产；pH和溶氧(DO)电极为 METFIER TOLEDO电 极 维普资讯 http://www.cqvip.com · l42 金霉素发酵过程的代谢特性及调控策略 扶教龙等 发酵过程的参数检测与控制图如 Fig．1。 1．3 参数检测与分析方法 1．3．1 在线检测参数 在发酵过程中，以每分钟一次 的频率在线检测温度(T)、溶氧(DO)、pH值、补料总 量、朴氨总量、补油总量及尾气中氧气和二氧化碳的百 分含量等多个直接参数以及摄氧率(OUR)、二氧化碳 释放率(CER)、呼吸商(RQ)~tl氧体积传递系数( a)等 间接参数。 1．3．2 离线参数分析方法 离线参数的分析参考工 业生产的有关分析方法。总糖和还原糖采用斐林试剂 法。氨基氮采用甲醛法测定。溶磷采用钼酸盐法测 定。金霉素效价采用比色法测定：将发酵液过滤或离 心后，取 lml清液，按一定倍数稀释后，各取 1ml稀释 液于 2个 50ml容量瓶中，各加 5ml的 2mol／L盐酸，一 个在沸水中加热 5min，另一个作空白不加热，加水至 刻度，于．440rml处进行比色，读数后由标准曲线计算效 价。菌体浓度测定：发酵液离心后，测其中固含物的重 量百分比，因发酵液中包括不溶性营养物，该值称为相 对菌体浓度更合适。 2 结果与讨论 2．1 糖代谢特性及对发酵过程的影响 从金霉素发酵过程的总糖和还原糖的代谢曲线 (Fig．2)可以看出，曲线呈阶段性的下降趋势。在50h ng．1 Rowchaa 0f the fennentation vfith ∞II．e忙瑙 dPlemfinalian aⅡd conll~ system 'YinleCh) ng．2 Curve of sllg~r metabolism 1：Total sug~= 2：RPH~c mlgar 前，总糖含量维持在较高的水平，从起始的6．67％逐 渐下降到3．6％。由于菌体生长和产物形成都需要大 量的碳源，保持较高的糖含量很有必要。随后，菌体代 谢减弱，糖耗明显降低，总糖维持在 2．5％～3．5％左 右。还原糖在开始十几小时较低，随后逐渐上升，到 18h达 1．46％，然后再慢慢下降，基本在 1．25％ ～ 1．50％之间。这是因为发酵开始一段时间，菌体对还 原糖的利用速率大于淀粉的水解速率，随着菌体的生 长，淀粉酶受到诱导作用后，淀粉水解速率增大，使还 原糖浓度升高 』。细胞生长进入指数生长期，菌体的 比生长速率 达到最大值_5 J，糖耗增大，应开始补料。 在发酵后期，糖含量的偏高或偏低是由于补料速率过 高或较低所致。 近年的研究发现，在生物系统中存在混沌现象，发 酵初期的微小变化可能使发酵过程呈现出多态性和不 稳定性 J。所以，通过控制前期适宜的菌体生长速率 (即比生长速率 =I／X·dX／dt1对整个发酵过程是至 关重要的。若 太小，将会使菌体生长缓慢，对数生长 期过长，菌体不能良好生长，酶活力不强，产物产率低； 若 太大，菌体生长过快，使代谢过于激烈，在中前期 使氧耗过大以及因菌浓很高使发酵液粘稠导致氧传递 能力下降，易产生溶氧降至f临界氧浓度以下，影响菌体 的正常代谢和产物形成，同时，菌体滔力过早减弱，也 使金霉素效价偏低。因此，优化培养基的成分，控制补 料速率及其它有关工艺参数，是 CTC发酵过程的一个 关键因素。 (1／h)的计算可以 =l／x(△x／△t)近似估 算，x为菌体浓度，由相对菌体浓度减去消后菌浓(固 含物含量)得到，△x为菌体浓度的增加， 为时间间 隔。 2．2 氧的代谢特性及与代谢强度的关系 发酵过程中氧气的充分供给是保证菌体良好生长 和产物高产的必要条件。溶氧(DO)是需氧和供氧这 一 对矛盾平衡的结果，同时，DO的高低也反映了代谢 的强弱程度。Fig．3为金霉素发酵过程的氧代谢曲线， 以及OUR、CER和RO的变化规律。 Time(h) ng．3 Curve of oxygen metabolism l：D0； 2：Ro； 3：OUR 4：CER 事亨 一 嚣～ 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国抗生素杂志 2OO2年3月第 27卷第 3期 · l43 随着菌体的快速增长，在 20—30h之间，细胞对氧 的需求量也增大，DO较快地降到 15％以下，这时菌体 代谢最旺盛，表现在 OUR和 CER达到最高值，分别为 每小时41．1和 38．1amaol／L。这时，往往采取提高转 速、加大通气量或适当降低温度、减小补料速率等措施 使DO 保持在一个较高的水平，以保证菌体的正常代 谢。随后，40—90h间，菌体代谢慢慢减弱，OUR和 CER也缓慢减小到每小时 25mn'~l／L左右，耗氧减少， 相应 DO也缓慢上升，在 20％一30％ 这段时间，因发 酵液很稠使供氧能力下降，以及因逃液频繁不断加人 消泡剂，也使 DO 再度降低。因此，适当的加油量和加 油次数也是保证较高的DO 水平的有效调控方法。在 发酵后期，随着菌体的自溶，代谢明显减弱，OUR和 CER也降到每小时20mmol／L以下，对氧的需求也大大 减少，使 DO 值逐步升高到60以上，表明发酵过程已 趋结束。 呼吸商 RQ(即CER／OUR)反映了代谢途径的变化 情况。在5h左右RQ达到一个高峰后，有一下降峰。 这是因为培养基中的还原糖的消耗使其浓度降低，菌 体只能利用还原度更高的碳源，使 RQ下降。随着淀 粉的水解速率增加，还原糖浓度上升，使 CER的升高 幅度大于 OUR ，RQ也反弹，到 21h左右达到最大值 0．93。此后，RQ值维持在 0．9～0．8之间，逐渐下降 表明代谢途径由开始主要为酵解途径(EMP途径)，逐 步转向戊糖途径(HMP途径)，使物质的代谢流向 HMP 途径增强，使金霉素效价逐渐上升l7J。 2．3 氮和磷的代谢特性 氨基氮(NH2．N)和溶磷(DP)的代谢曲线见 Fig．4 可以发现，氨氮代谢曲线先是下降，然后较长时间维持 在一个稳定的水平，到后期又有所回升。菌体的生长 需要大量的氮源用于构成细胞的组成物质以及形成氮 的代谢物 ，从发酵开始到 18h，氨氮值 由200rag／100ml 左右大幅降到 100,W,／100ml左右 随后．氨氮继续下 降到 60mg／100ml上下。这时，随着补料和氨水的加 一 毛 {兰 ． - _ --兰 墨 Time(h) 啦 ．4 Cm'~e 0f Nth-N and plmsphorus metabolism I： -N； 2：Dissdved ∞pho 人，菌体对氨氮需求与加人量基本持平，到95h，氨氮 维持在 60—90mg／100ml之间。在 100h后，因代谢减 弱及菌体自溶，氨基氮逐渐回升到100,W,／100ml以上。 在整个发酵过程中氨水的加入量与效价的增长呈某种 正比例关系。 溶磷(DP)代谢曲线与氨氮曲线稍有不同，它在全 过程呈下降趋势。到 18h时，溶磷从初始值 180t．,g／ml 迅速下降到30t~g／ml，到 25h，降至 20t．,g／ml左右。此 后，基本维持在 10—20t．,g／ml的范围内。溶磷 的消耗 主要在前期的菌体生长阶段 ，用于蛋白质和核酸的形 成，以及作为重要的能量传递者——三磷酸腺苷的成 分，在 CTC的合成期，菌体对磷浓度的承受限度比生 长期低，溶磷过高会抑制戊糖循环所需的6．磷酸葡萄 糖脱氢酶，从而抑制产物的形成． 因此，在培养基中 控制溶磷的含量以及保持发酵期间稳定的较低溶磷浓 度是有利于 CTC的合成。 2．4 菌体生长和金霉素合成曲线 菌体浓度 x(％)和 CTC效价增长(oYm1)与时间的 关系曲线见 ng．5 可以看出，菌体浓度在发酵前期增 长最快，到32h达到43．6％(发酵罐消后菌浓即固含物 含量一般为 15％左右)。这段时间的菌体处于生长 期，糖、氨氮和溶磷消耗都很大，糖代谢主要处于酵解 途径，因此代谢剧烈，逃液严重。不过，戊糖循环途径 在十几小时就参与糖代谢，CTC的合成也已开始，在 30h CTC增长速率达到最大为每小时 300tr／ml左右。 此后，糖代谢逐步转向戊糖循环途径，进人 CTC的生 产期⋯。到 42h以后，菌浓基本稳定在 45％ 50％之 间，CTC的效价稳步上升。到后期，菌浓略有增大，是 由于糖含量偏高所致。在73h以后近20h间效价基本 没有增长，在 15100～15500u／m1之间徘徊，可能是由 于固体物大量积累，影响氧的溶解，抑制了 CTC的合 成 。在 114h，效价达到最高值 18173．8u／m1。最终效 价的高低，与众多的影响因素相关，如何控制好这些因 素来调节菌体的生长和代谢，使发酵过程代谢的物质 餐 Time(h) F ．5 Curve 0f biomass and CTC biosynthesis I：C0Il L∞ of 口a ‘％)； 2： l盯0f CTC(1l， ) 维普资讯 http://www.cqvip.com 144 · 金霉素发酵过程的代谢特性及调控策略 扶教龙等 流流向有利于产物 CTC合成的戊糖循环途径是最关 键的。 2 5 通过优化的发酵过程特性 通过优化基础培养基中的组成成分，以增大前期 菌体的比生长速率，使前期的产抗生素速率增大，并使 糖含量控制在较适当的范围，适宜增强菌体的代谢强 度，使后期CTC的效价也能平稳地升高。以此来调控 菌体生长和代谢，来获得较高的CTC效价。 ．1为 通过优化调控的发酵过程的有关参数值(T为时间， h)， ．6为优化与未优化过程的比生长速率 (Specif- ic Growth rate，简写为 SGR)和 CTC效价随时间的变化 曲线。 可以看出，通过优化基础培养基，使前期的生长适 当增强，到25h菌浓和效价也相应由38．7％和3959u／ 盯d增加到 45．O％和 4962u／ml。尤其在 32～73h间， OUR和CER普遍提高了每小时2—3mmol／L，使代谢增 强，溶氧值相应也降低。过程的总糖和氨基氮也较高， 潘 1『 “‘ 21000 18000 15000 = E 一 幢o0。墨喜毛 O000 l 0 五rj= 6000 0 啦 ．6 Cur~esdSC-R andtheflier C他 in opa~ d and unoptimized 8es 1：0In ∞ I (sGR)； 2：Un~ imized (sGR)； 3：Optimizedtito-ofCTC& 4：Unoptinfin~ tiler of 保证了代谢增强所需更多的碳源和氨源。在 73～ 90h，避免了效价不增长的现象，达到 18399u／ml。溶磷 在前期(18h)降幅更大，达 100btg／ml，说明在前期对磷 的利用更完全，使菌体的生长速率增加，同时过程的溶 磷也更低。过程的还原糖稍有降低，表明菌体对还原 糖的消耗速率更大，相应 “也更大，碳源除向 EMP途 径增加(CER增大)外，也向 HMP途径增强。同时，从 OUR和CER的值可以发现，代谢强度较大且维持的时 间更长。从Fig．6可以发现，优化的比生长速率 值 比未优化的在 50h以前菌体生长期明显的大，CTC的 效价在发酵全过程也普遍比原来的高，在 1 14h CTC效 价达到最高，为 2(X)46u／ml，比未优化过程提高 了 10．3％ 3 结论 通过对金霉素发酵过程特性的分析，对培养基进 行优化，对发酵过程代谢作了相关的调控，使代谢向有 利于产物合成的途径进行，最终使 CTC的效价增加了 10．3％，达到了2tD,16u／ml。由于金霉素是典型的次级 代谢产物，其发酵过程是在基因水平的遗传特性、细胞 水平的代谢特性和工程水平的物质传递特性三个不同 水平综合作用的结果。CTC的生物合成 除种子因素 外，还受很多其它的影响，如移种、培养基成分、温度、 pH值、DO和补料速率、糖、氨氮、溶磷浓度等。而这些 因素叉通过对前期菌体的生长状况和过程代谢特性 (如DO、CElt、OUR等)影响来决定 CTC效价。较高的 CTC效价，实质上就是较多的营养物质在代谢流分布 上流向CTC合成的途径 。因此，如何对发酵过程的 参数进行相关分析，对菌体的生长、细胞的代谢和产物 的合成过程进行动态优化，使代谢流向CTC合成的途 径方向增强，是提高CTC效价较有效的方法之一。 Tab．1 The i~r'dnleters optimized process (下转第 187页) - 嘶 ∞ 耋}毗 0 吡 此 O 0 0 0 0 0 0 0 一∈H一 一 c∞ 目_E_ ；^ ． 一一 c∞ E= 【】 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国抗生紊杂志 213O2年 3月第 27卷第 3期 187 · 3．2 呼吸道感染治疗的成功与致病菌对抗生素的敏 感性和抗生素在感染区域的浓度这两个因素密切相 关 美 罗培南对绝大部 分致病 菌的 MIC均小 于 lt,g／m~。有关美罗培南在肺组织中的渗透强度报道甚 少 我们用纤支镜灌洗方法测定 BAL液中美罗培南 的浓度，了解其对肺组织的穿透作用。用20ml生理盐 水作支气管肺泡灌洗 ，BAL液美罗培南浓度为(0 297 ±0．65) ／ml，用 BAL液单位蛋白含量表达则为(1．37 ±0．18)t,g／mg。Bmude_5 认为后者更能反映药物在肺 组织的实际浓度。我们检测 BAL液中美罗培南的浓 度较Allegranzi 等报道为高．这可能与灌洗液用量不 同有关。上述结果充分说明美罗培南对肺组织具有良 好的穿透作用．很适宜呼吸道肺部感染治疗。 3．3 抗生素使用的剂量和使用的时间直接影响抗感 染疗效。因此使用美罗培南时对其药动学的了解至关 重要 ，目前国内尚未见报道。本文检测了6例肾功能 正常的老年肺部感染患者的血药浓度的动态变化，结 果表明其峰值浓度为(29．47±0．99)mg／L，半衰期为 lh，用药后 6和 ＆h血药浓度为(3．0±0．95)和(2．44± 0．90)~e／L，提示美罗培南有效血浓度时间可达6～8h， 此结果与Aue m 报道相比，峰值浓度相似，而6 ＆h 血药浓度更高 我们建议对肺部重度感染患者可每 6～8h给药，既减少用药费用，又达到治疗效果。 参 考 文 献 [1]侯显明 纤支镜肺泡灌洗及其临床应用【】] 中华结核和呼 吸杂志，1994；17(6)：339 [2：刘刚，沈寒放，张蔚东，等．小剂量亚胺培南／西司他丁在肺 部感染患者中的药动学及疗效观察[J ．中国抗生素杂志， I997；22(4)：281 【3一rtng,~ ，Karen L，F丑lj ， a／ Di Ie_ meropenem and i rHn／c_1asla血 lJJ Infect Dis ain Praet，1997；6(5)：291 [4]Barry S，Steve~l J，RonaldW， ．Empiric Ⅲ of 一 tal-acqLIired lower respiratory tmet infections with Tne ptmelll or ceftazidimewithtobramycin：A randomized study[J]．Crit Care Med．1997；25(10)：1653 【5 J Bmude A C，Homsteia A，Klein M， a／．PuIM cfispositkm oftobramyc Jn【J J m^ Rev Resp Dis．1983；127：563 l6』Au 删 B，Ca．~adod A，Perri G D，d a／ Concentrations。f db鸵mempenem (1giv)in bronchatdveolarlavage and ep- ithelial lining flnid[J]．J Anti／nic~b Olemother．2ooo；46(2)：319 (上接第 l44页) 参 考 文 献 ：1：张克旭，陈宁，张蓓，等．代谢控制发酵[M ．北京：中国轻 工业出版社 ．1998：434 [2：张嗣良，金沙，徐萼辉，等 青霉紊发酵过程特点与控制对 策[J]华东化工学院学报，1989；15(4)：510 [3：张嗣良 发酵过程多水平问题及其生物反应器装置技术研 究——基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技术[J] 中国工程科学，2001；8(3)：37 [4]郝师曾，冯密云，刘璞．全国第三次抗菌素会议论文集(第 二册)[M]．上海：科学出版社，1960：80 [5：俞俊棠，唐孝宣．生物工艺学(上 下册 数学七年级下册拔高题下载二年级下册除法运算下载七年级下册数学试卷免费下载二年级下册语文生字表部编三年级下册语文教材分析 )[M]．上海：华东化 工学院出版杜，1991：82(下)，53(上) [6j钱梓文，Tohyama M，Saknizn K混沌控制在聚 羟基丁酸混合 培养过程中的应用[J]．无锡轻工大学学报，2000；19(5)：451 【7一Hostalek z，Tinterova M，Jchova V a／ Regulation of Biosyn— thesis of SecoMa~,Metaholi|es：I．Bi鹏vn 酏 of Chlortetracy— chne Tfiearhoxyllc Acid Cyde Activity l JI．Biat~chnol Bio— eng，1969；11(4)：539 【8 J Jol-gen~ell H，Nielsen J，Villadsen J．M曲d FI呱 Distributkms in pelficilllum chrysogenum O．,4ng Fed-Batch Cultivations[J] Biotechnol Bioeng，1995；46(2)：117 The Metabolic charateristics and the regulative strategy of chlortetracycline fermentation process Fu Jiao—long， Chu Ju， Liu Yu—wei， Fan Tao， Zhuang Ying-ping． Pel】gHao-yn and Zhang Si—hang (State Key Laboratory of n r h r．ee rIg ECUST， Shanghai 200237) ABSIIIAcr Chlortetracyeline(c1℃)WaS produced hv Streptomyces aureofadens in 50liters fearnentor．The meta]~lie eharatefisfics of carbohydrate，DO，NH2-N and dissolved phosphorus，and the regulations of cell and CTC biosynthesis were anal删 ．The results showedthatit惴 hnportantfor cont~lling oftheinitial stage of cell metabolism andit was also crucial to the whole CTC biosynthesis process．The growth of cells in the initial stage offerr~mtation was properly enhanced using real—time opitimization strategy based On related multi—parameter．The metabolic flux favoumble to lead to the Da ． ways of c1℃ biosynthesis and the yield ofCTC was；ncw~ased by 10．3％ ． 1皿YWORDS Chlortetracycline； Streptomyces oareofac~m： Fennentafion； Metabofic regulation 维普资讯 http://www.cqvip.com