基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157_H7和霍乱弧菌O139

[收稿日期 ] 2005- 06- 05 [基金项目 ] 国家科技攻关 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目 ( 2003BA712A03- 09) [作者简介 ] 徐晓静 ( 1972- ), 女, 内蒙古自治区呼和浩特市 人,博士。E2mai:l xuxiaojing72@ sina. com。 * 通讯联系人, Te:l 010266932211, E2mai:l sqwang@ n ic. bm .i ac. cn 基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌 O157BH7和霍乱弧菌 O139 徐晓静 1, 2,文思远 1, 陈苏红1, 马学恩 2, 王 华1, 王升启 1* ( 1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京 100850; 2.内蒙古农业大学动物科学与医学学 院,呼和浩特 010018) [摘要 ] 目的:建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌 ( EHEC)O157BH 7和霍乱弧菌 O139的基因芯片, 并验证 该芯片的特异性和敏感性。方法 :选择 EHEC O157BH 7的产志贺样毒素基因 stx1、stx2和 B2葡糖醛酸糖苷酶基因 ( u idA);霍乱弧菌 O139的肠毒素 A亚单位 ( ctxA )、毒力协调菌毛 A亚单位 ( tcpA)、糖基转移酶 ( glycosotransfe rase LPSgt)基因序列分别 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物和探针, 反向引物用荧光素 Cy3标记, 探针在 3c端氨基修饰。在优化的 PCR和杂交 反应条件下, 分别进行三重 PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交, 产生特异性荧光信号,进一步筛选探针。随后 将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果: PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号, 临床样本检 测结果表明, 此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论:所研制的同时定性检测 EHEC O157BH 7和霍乱弧菌 O139 的基因芯片是特异、灵敏而且快速的, 为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。 [关键词 ] 基因芯片;多重 PCR;大肠杆菌 O157BH 7;霍乱弧菌 O139 [中图分类号 ] Q503 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 100025501( 2006) 0220122206 Detection and id en tification of en terohem orrhagicE scherichia coli O157BH7 and Vibrio cholerae O139 using genech ip technology XUXiao2J ing 1, 2 , WEN Si2Yuan 1 , CHEN Su 2H ong 1 , MAXue2En 2 , WangHua 1 , WANG Sheng 2Qi 1* ( 1. Institude ofRad iationMed icine, A cademy ofM ilitaryMedical Sc iences, Be ijing 100850, Ch ina; 2. School ofAn imal Sc i2 ence andMedic ine, InnerMongoliaAgricu ltura lUn iversity, H uhhot 010018, Ch ina) [ Abstra ct] O bjective: To develop a rapid, specific and sens itivemethod ofgenech ip assay for simultaneous identifica tion of en terohemorrhagicE scherich ia coli(EHEC) O157BH 7 and Vibrio cholera e O139. M ethods: Three pa irs of primers were designed for EHECO157BH 7multip lex PCR, correspond ing to stx1, stx2 ( Shiga2like toxins gene) and uidA (B2glucuron i2 dase gene) respectively, and three pa irs ofpr imers forO139 corresponding to toxin sub2un it A ( ctxA), toxin co2regulated p ili subunit A ( tcpA) and glycosotransferase (LPSgt). S ixty spare oligonuc leotide probes we re designed to capture the re2 verse strand of the PCR product. Consequently, only the reverse pr imers required fluoresce in (Cy3) modification a t 5c2te r2 m ina ,l and a ll probes were synthesized w ith 3c am ino2group mod ification. Then the mu ltiplex PCR system was optim ized, two sets ofmultip lexed PCR amplified produc t were m ixed and then hybr idized on the surface of the m icroarray conta in ing sixty oligonuc leotide probes, and specific signa lwere de tected. The best probes were chosen accord ing to the six re ference gene segmen ts and we re used to prepare them icroarraywh ich conta ined positive control and negative contro.l Them icroarray was used to detect clin ica l samp les. R esu lts: The resu lts showed tha t the sensitivity ofoligonucleotidem ic roarray was better than that of the routine bac teriologymethod. Conc lusion: It is proved tha t the m icroarray is a re liablemethod for de tection and identification of EHEC O157BH 7 andV. cholera e O139 simu ltaneously. [ K ey words] oligonucleotide m icroarray; multip lex PCR; E scherichia coli O157BH7; Vibr io cholera e O139 肠出血性大肠杆菌 ( ente rohemorrhagic E scherichia coli, EHEC)O157BH 7于 1982年首次被证实为致病菌 [ 1], 能引起 出血性肠炎和溶血性尿毒综合征等严重的临床症状,可通过 食物和饮水导致大规模暴发 [ 2, 3]。EHEC O157BH 7的致病性 与多个基因有关, 其中包括产志贺样毒素基因 stx1、stx2[ 4, 5], B2葡糖醛酸糖苷酶基因 u idA ( gusA )等 [6, 7]。有研究者采用 stx基因对 EHECO157BH7进行鉴定 [ 8] , 但 O157家族成员中 非 H 7型及其他致病性大肠肝菌也可能含有 stx基因 [ 9], 因 122 军事医学科学院院刊 2006年 4月 第 30卷 第 2期 Bu llAcadM ilMed Sc,i Apr 2006; Vol 30 No 2 此, 只针对 stx基因的检测结果进行鉴定并不可靠,还需结合 O157BH7特异性基因的检测才能进行鉴定。研究表明, O157BH 7型的 u idA基因中 + 93位碱基特异性的由 T突变 为 G [ 10] ,这为 O157BH 7与其他产 stx毒力基因的肠道菌进行 区分提供了依据。有研究者通过核酸杂交法对 O157BH 7 u idA基因内保守突变位点进行检测, 从而对 O157BH 7型与 非 H 7型进行鉴别 [ 10]。 霍乱弧菌 O139是 1992年才发现的一种新型菌株, 也可 引起以腹泻为主要症状的烈性传染病 [11] , 以发病急、传播 快、波及范围广、能引起大规模流行为特征。研究表明, 霍乱 弧菌 O139型是由 O1型变异而来 [ 12]。O139型和 O1型霍乱 弧菌都含有两种主要的毒力基因 ctxA和 tcpA[ 13] , 但它们的 糖基转移酶基因 ( LPSgt)组成却存在差异 [ 14]。有应用 PCR 技术进行快速诊断的研究, 其中通过识别 PCR产物中的 ctxA和 tcpA来区分霍乱菌株和非霍乱弧菌, 然后根据 tcpA 基因的不同 DNA序列来区分古典生物型和埃尔托生物型。 但不能区分出 O139型菌株。最近法国巴斯德研究所开发出 一种 /一步免疫色谱 d ipstick0法来检测霍乱弧菌 O1 和 O139[ 15] ,但灵敏性和特异性有待提高。 快速检测和鉴定病原体是突发性传染病诊断、治疗和控 制的关键。长期以来, 致病性 O157BH 7和 O139感染的实验 室诊断主要依靠传统的细菌学检测方法,步骤繁琐且需要数 天才能得出结果 [ 16]。免疫学方法也存在特异性和敏感性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。因此, 建立一种快速而且特异的诊断方法已成为一项重 要研究课题。近年来, PCR和核酸杂交技术的应用促进了细 菌检测技术的发展, 但存在一定的局限性。目前, 对于多基 因同时检测才能鉴定的病原体 ,基因芯片技术以其特有的优 势已被应用于病原体的检测。基因芯片是近年来发展起来 的能同时检测多基因的技术,具有高通量、成本低、污染少、 可多基因平行检测等特点 [ 4, 17]。本研究利用这一技术研制 了一种低密度芯片,在多重 PCR基础上, 通过识别 PCR产物 中 ctxA、tcpA和 LPSgt基因来区分 O139菌株;此芯片能同时 检测 O157BH7的 stx1和 stx2毒力基因以及 u idA基因内保 守突变位点,从而对 EH EC O157BH 7进行鉴定。 1 材料和方法 1. 1 菌株及模板 EHEC O157BH 7 W 933、882364 株, 霍乱弧菌 O139 M045、1837株来自中国药品生物制品检定所; O1型霍乱弧 菌 569B株, 小川型霍乱弧菌, O157BH 7和 O139地方株, 一 些常见肠道菌,以及临床标本由浙江省疾病预防控制中心提 供。细菌 DNA用 Promega试剂盒提取。 用于标记修饰的荧光素 Cy3TM Am id ite购自 Amersham Pharmac ia B iotech。实验所用的酶或其他生物学试剂等均购 自 Promega公司和 TaKaRa公司。 1. 2 引物和探针 根据 GenBank和相关参考文献, 应用 PRIMER5. 0软件 设计引物和探针序列。选择 stx1、stx2和 uidA 基因用于 O157BH 7三重 PCR扩增, uidA引物间序列包含 + 93位突变 位点; O139进行三重 PCR扩增的引物来自 ctxA、tcpA、糖基 转移酶基因 ( LPSgt)序列。反向引物序列 5c端用荧光素 Cy3 标记修饰。针对上述基因 PCR产物序列,共设计 60条备选 探针,探针的核苷酸序列与 PCR产物带有荧光的反向链互 补,长度为 19~ 60 mer, 并在 3c端氨基修饰。探针和引物序 列经 BLAST分析确定其特异性。同时还用反向 (荧光标记 ) 引物的互补序列合成探针, 作为阳性对照, 选择与肠道菌无 关的探针作为阴性对照。引物序列见表 1。备选探针序列 未列出。 表 1 本研究所用的引物序列 基因名称 序列 ( 5cy 3c) 产物长度 ( bp ) 备 注 stx1 GAA TTT ACC TTA GAC TTC TCG AC 正向引物 TCC TGT TAA CAA ATC CTG TCA C 250 反向引物 stx2 TAC GAT AGA CTT TTC GAC TCA AC 正向引物 TCA ATA ATC AGA CGA AGA TGG TC 207 反向引物 u idA TAA TGA GGA GTC CCT TAT GTT AC 正向引物 ACT GAT CGT TAA AAC TGC CTG G 179 反向引物 ctxA ACT CAG ACG GGA TTT GTT AGG C 正向引物 ATC TAT CTC TGT AGC CCC TAT TAC 304 反向引物 tcpA TTGACC CAA GCA CAA TGT AAG AC 正向引物 CTA CTG TGA ATG GAG CAG TTC C 241 反向引物 LPSgt ACA TCT GTA GGG ATT GTA TTG AC 正向引物 ATA ACA ACT GAGATA TCA AGC GTC 340 反向引物 1. 3 PCR扩增 在 20 L l常规 PCR反应体系中, 正、反向引物浓度均为 1 Lmol/L, 100 Lmol/L dNTP, 1 U TaqDNA聚合酶, 1@PCR 反应缓冲液, 50~ 100 ng模板 DNA;扩增条件为: 94e 预变性 5m in;经变性 ( 94e , 30 s) , 退火 ( 55e , 30 s), 延伸 ( 72e , 30 s), 35个循环;最后于 72e 延伸 5m in。对荧光标记不对 称 PCR反应条件进行优化。 1. 4 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 质粒构建 EHEC O157BH 7W 933株和霍乱弧菌 O139M045菌株中 提取 DNA 作为模板, 用每对引物 (未标记荧光 )进行常规 PCR扩增。扩增产物经纯化后分别与 pGEM2T载体连接转 化入大肠杆菌 DH 5A中, 37e 摇菌过夜, 用 Promega质粒提 123 第 2期 徐晓静,等 1基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌 O157BH7和霍乱弧菌 O139 取试剂盒提取质粒。经纯化后测序, 鉴定阳性克隆, 计算所 提取质粒的拷贝数并进行 10倍系列稀释, - 20e 保存, 作为 PCR扩增的模板。 1. 5 芯片的制备和杂交 将合成的探针用点样液 ( 6@SSC, 0. 1% SDS)稀释至终 浓度 50 Lmol/L, 取 5 L l转移至 384孔板。用 Cartesian芯片 制备仪将探针点到醛基片 ( Te lechem)上, 每点体积约为 0. 5 n,l点芯间距为 500 Lm, 点直径约为 200 Lm, 点样时保 持湿度 90% , 温度 23e 。点样后的芯片在使用前于室温放 置至少 24 h。 荧光标记的 PCR产物变性 ( 98e , 2 m in )后与杂交液 ( 5@SSC, 5@Denhardt液, 10 L g/m l鲑精 DNA, 0. 3% SDS)混 匀, 取 10 L l转移至芯片反应区,芯片置于杂交盒内, 连同杂 交盒浸入 42e 水浴中反应 90 m in, 杂交后的芯片依次在洗 液 A ( 1@SSC, 0. 2% SDS), 洗液 B( 0. 2 @SSC)和洗液 C ( 0. 1@SSC)中于室温各洗涤 1m in。置室温晾干后, 芯片用 共聚焦扫描仪 GeneP ix 4000B进行扫描, 用 GeneP ix P ro 4. 0 软件分析结果。 2 结果 2. 1 PCR扩增条件优化 多重不对称 PCR反应中, 3对引物之间浓度的改变对目 的基因的扩增效率有明显影响 ,每个基因的正向与反向荧光 引物的比例和杂交信号的强弱密切相关。经过多次实验, 使 一个反应管中 3个产物均能达到相近而且较好的扩增效率 和杂交信号。优化的结果为: O157BH7多重 PCR反应中 stx1, stx2和 uidA基因的正向引物浓度分别为 0. 15 Lmol/L, 0. 1 Lmol/L, 0. 1 Lmol/L, 反向荧光标记引物浓度分别为 0. 75 Lmol/L, 0. 5 Lmol/L, 0. 5 Lmol/L; O139多重 PCR反应 中 ctxA、tcpA、LPSgt基因的正向引物浓度分别为 0. 15 Lmol/ L, 0. 15 Lmol/L, 0. 2 Lmol/L, 反向荧光标记引物浓度分别为 0. 75 Lmol/L, 0. 75 Lmol/L, 1. 0 Lmol/L。 20 L l反应体系中, dNTP为 200 Lmol/L, MgC l2为 3 mmo,l 2U Taq DNA聚合酶, 1@PCR反应缓冲液;扩增条件为:预变性 ( 94e , 5 m in), 变 性 ( 94e , 30 s) ,退火 ( 56e , 30 s), 延伸 ( 72e , 30 s), 40个 循环;延伸 ( 72e , 5 m in)。结果见图 1。 图 1 单一和多重 PCR产物电泳检测结果 1~ 3.分别为 stx1, stx2, u idA扩增片段; 4. EHEC O157BH 7三重 PCR扩增片段; M. DL2000标志物,可见的两条带为 250 bp, 500 bp; 6.霍乱弧菌 O139三重 PCR扩增片段; 7~ 9. LPSgt, ctxA, tcpA 扩增片段 2. 2 探针筛选 以不同浓度的模板扩增的单一和多重 PCR产物, 与备 选探针杂交筛选结果如图 2。此图是三重 PCR产物混合杂 交结果, PCR扩增模板为 104拷贝质粒 DNA。每个基因有 10 条备选探针,杂交后扫描分析结果,在扣除背景值后, 信号强 度以每条探针重复点的均值计算,所选择的探针见表 2。统 计分析结果为: stx1的 7号、stx2的 10号、u idA的 9号、LPSgt 的 10号探针在与其不同模板量的 PCR产物杂交时信号值 都明显高于其他探针, 而且无其他基因探针产生非特异信 号。 uidA基因 + 93位突变位点位于其 9号探针中间位置, 探针序列较短,与不含突变位点的 10号探针相比具有特异 性,说明此探针可用于检测 u idA基因的突变位点。 ctxA的 3 号、4号和 6号探针杂交信号值统计结果相近, 但 4号探针 特异性更好。 tcpA的 2号、5号和 9号杂交信号值在高拷贝 时相近,但低拷贝时 9号明显高于 2号和 5号。因此, 针对 两种病原体的 6个基因筛选出的探针分别为 stx1 7号、stx2 10号、u idA 9号、ctxA 4号、tcpA 9号和 LPSgt 10号。筛选出 的 6条探针在检测特异性与信号强度方面均较好。将筛选 出的探针连同阳性、阴性对照按图 3阵列制备芯片, 再进行 杂交条件优化。 比较了不同成分的杂交液以及离子浓度的改变对杂交 效果的影响, 对所有探针来说, 最终选择的杂交液成分为 6@SSC, 1@Denhard t液, 0. 2% SDS, 可保证 6条探针均能达 到很强的杂交信号和较高的信噪比, 杂交温度为 50e , 反应 60m in即可使探针与 PCR产物有效且特异性结合。 图 2 备选探针杂交结果 ( PCR模板为 104拷贝 DNA ) 第 1~ 3行分别为 stx1, stx2和 u idA基因的探针,检测大肠杆 菌 O157BH7;第 4~ 6行分别为 ctxA, tcpA, LPSgt基因的探针, 检测霍乱弧菌 O139 阳性对照 stx1 stx1 stx1 stx1 阴性对照 (无关探针 ) 阳性对照 stx2 stx2 stx2 stx2 阴性对照 (无关探针 ) 阳性对照 u idA u idA u idA u idA 阴性对照 (无关探针 ) 阳性对照 ctxA ctxA ctxA ctxA 阴性对照 (点样液 ) 阳性对照 tcpA tcpA tcpA tcpA 阴性对照 (点样液 ) 阳性对照 LPSgt LPSgt LPSgt LPSgt 阴性对照 (点样液 ) 图 3 基因芯片阵列排布 124 军事医学科学院院刊 2006年 4月 第 30卷 第 2期 表 2 探针序列 基因名称 序列 ( 5cy 3c) 长度 ( bp) 退火温度 ( e ) stx1 GTA CGT CTT TAC TGA TGA TTG ATA GTGGCA CAG GG 35 73. 5 stx2 AGT TAT TTT GCT GTG GAT ATA CGA GGG CTT GAT GT 35 69. 6 u idA TGG AAT TGA GCA GCG TTG G 19 70. 1 ctxA CAT ACA GTC CTC ATC CAG ATG AAC AAG AAG TTT CTG CTT TAG GTG 45 75. 0 tcpA CAG GAA GTG CCA ACT TAA ACC TAA CTA ATA TCA CGC ATG TTG AGA 45 76. 8 LPSgt TCG ATA AGA AGA GAT AAA GAT CTG AGT TAT CTA AAG ATA TTT G 43 71. 2 阴性对照 TCT TCG CCA GAG GCC TGC TAG CCT GGT TCA AGA TAC TAC C 40 68. 5 阳性对照 反向荧光引物互补序列 40 70. 5 2. 3 探针的特异性检测 为考察探针的特异性, 在优化的三重 PCR扩增和杂交 反应条件下, 使用基因芯片检测了 149株不同血清型的肠道 菌。其中包括大肠杆菌 O157BH7 W933、882364标准菌株, 97- O157BH 7等 5株地方株, 大肠杆菌非 H 7型 3株;霍乱弧 菌 O139M045、1837标准菌株和 72株地方分离株, O1型霍 乱弧菌 569B和小川型, 非 O1型非 O139型霍乱弧菌 3株; 常见肠道菌:侵袭性大肠杆菌 48017、STM408、191、197、247、 AT大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 6538、沙门菌属、耶尔森菌 属、蜡样芽孢杆菌、志贺菌属、李斯特菌属、假单胞菌属、变形 菌属等。以细菌 DNA为模板进行两套三重 PCR扩增, 荧光 标记 PCR产物与芯片杂交。 表 3结果显示, 所检测的 O157BH 7都含有 stx1、stx2毒 力基因,而 O157非 H7型和一些肠道菌也含有 stx1或 stx2, 但用于检测 O157BH7特异性突变位点的 u idA探针可将以 上细菌区分开。本实验所检测的 O139型和 O1型霍乱弧菌 都含有 c txA、tcpA, 而毒力基因 LPSgt探针只与 O139型霍乱 弧菌特异结合,可将二者明确区分, 本实验检测的其他肠道 菌以及 3株非 O1型非 O139型霍乱弧菌与检测探针杂交均 无信号产生。 表 3 特异性检测结果 菌株 数量 stx1 stx2 u idA ctxA tcpA LPSgt O157BH 7 8 + + + - - - O157非 H 7 2 + + - - - - O157非 H 7 3 + - - - - - 191、197 2 + - - - - - O139 74 - - - + + + O1 2 - - - + + - 其他肠道菌 55 - - - - - - 2. 4 探针的灵敏度检测 将构建的阳性质粒 10倍系列稀释, 在优化的三重 PCR 反应条件下, 当 PCR反应模板均为 1 000拷贝时, 三重 PCR 反应为阳性, 琼脂糖凝胶电泳检测条带可见, 杂交信号为阳 性 (图 4)。当模板浓度为 500拷贝时,三重 PCR扩增产物电 泳检测为阴性, 杂交反应为阳性;将模板再进行 2~ 10倍稀 释, 5倍稀释后扩增产物杂交仍有弱阳性信号, 继续稀释则 杂交反应为阴性 (图 5)。结果表明,要达到芯片检测的最低 样品量, 多重 PCR扩增的 DNA模板量应大于 100拷贝, 本研 究制备的芯片检测灵敏度比多重 PCR产物电泳检测灵敏度 高 10倍,此芯片检测的灵敏度为一个 PCR反应体系中 100 拷贝质粒 DNA模板。 图 4 三重 PCR灵敏度检测结果 图 5 芯片灵敏度杂交结果 125 第 2期 徐晓静,等 1基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌 O157BH7和霍乱弧菌 O139 2. 5 对临床样本的检测结果 共检测了 342份临床备检样本, 备检样本来源于浙江省 一起流行性霍乱 60例患者的粪便。取病人发病及治疗不同 时期的肛拭子, 于碱性蛋白胨水中增菌 2~ 3 h, 然后煮沸裂 解 10m in, 12 000 r /m in离心 2 m in, 取上清作为模板进行多 重 PCR扩增, 产物与芯片杂交。表 4显示, 有 137份在芯片 ctxA, tcpA, LPSgt探针处都出现阳性信号, 鉴定为 O139型霍 乱弧菌, 其余 205份除阳性对照外, 未见杂交信号。用传统 细菌培养方法共检出 89份样本为 O139型霍乱弧菌, 用荧光 定量 PCR方法检测 LPSgt基因共检出 142份为阳性。结果 表明本研究建立的检测霍乱弧菌 O139的基因芯片比细菌培 养的方法敏感性高。细菌培养鉴定结果由浙江省疾病预防 控制中心提供, 荧光定量 PCR检测结果由本实验室研制的 /新发肠道致病菌荧光定量检测试剂盒0鉴定。 表 4 临床样本的检测结果 检测方法 检测指标 检出样本数 阳性检出率 (% ) 细菌培养 生理、生化特征 89 26. 0 基因芯片 ctxA, tcpA, LPSgt 137 40. 0 荧光定量 PCR LPSgt 142 41. 5 3 讨论 以多重 PCR为基础的基因芯片检测技术, 可同时检测 病原体的多个相关基因 ,因此能够较为准确地甄别病原体。 本研究利用这一技术建立了包含 6个检测探针的基因芯片, 可同时鉴定肠出血性大肠杆菌 O157BH 7和霍乱弧菌 O139 两种病原体。实验结果表明, 此芯片检测的灵敏度为一个 PCR反应体系中 100拷贝质粒 DNA模板量, 比常规用凝胶 电泳方法检测 PCR产物的灵敏度高 10倍。但对于细菌量较 少的检测标本, 特别是 10个菌即可致病的 O157BH7, 要采用 增菌步骤, 然后再进行扩增, 这样可避免出现假阴性结果。 对临床样本的检测结果表明此芯片检测的灵敏度明显高于 传统的细菌学检测方法,略低于荧光定量 PCR检测灵敏度。 但荧光定量 PCR只针对 LPSgt一个基因进行了检测, 不能鉴 定 O139菌株的致病性, 而芯片不仅检测了 O139的特异性基 因 LPSgt, 同时还对毒力基因 c txA、tcpA进行检测,因此, 结果 更可靠。而且同时还能对 O157BH 7进行鉴定。 此外, 基因芯片检测结果的可靠性与芯片所包含探针的 特异性密切相关。由于生物种类存在一定的同源性, 就要求 所选探针的特异性越高越好。本研究通过多次实验筛选出 的 6条探针, 在优化好的杂交条件下, 经不同菌株特异性检 验结果表明, 所制备的基因芯片探针设计合理, 每个探针的 特异性良好, 可以对 O157BH7的 stx1、stx2毒力基因和 u idA 特异性突变位点及 O139的 ctxA、tcpA、LPSgt基因进行特异 性检测。 PCR技术是目前公认的快速检测病原菌的方法。但由 于临床采集的样本成分复杂,可能含有与扩增目的片段相似 的序列, 这样就会产生假阳性扩增产物, 而凝胶电泳检测无 法进行区分 [ 18]。荧光定量 PCR的发现, 虽然根除了凝胶电 泳检测 PCR产物的不足, 但一次只能检测一个基因或一种 病原体, 而对于多个基因同时检测才能进行鉴定的病原体或 多种病原体同时进行检测时却存在一定的局限。相比之下, 基因芯片技术却是一种比较适合的检测方法 ,结合其高通量 的特点, 一次实验即可获得大量数据, 即可实现多种病原体 多个样本的同时检测,为流行病学调查和突发性传染病的早 期诊断提供了一种有效的检测手段。总之, 本研究建立的基 因芯片可同时用于鉴定致病性大肠杆菌 O157BH 7和霍乱弧 菌 O139,可在 4~ 6 h内得到检测结果。 真正实现在一张芯片上完成对所有肠道致病菌进行检 测和鉴定是一项复杂而艰巨的系统 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 , 问题的最终解决有 赖于技术、信息等方面的积累与整合。本研究的开展为寡核 苷酸芯片技术应用于肠道致病菌检测做了有益的探索, 并为 今后实现制备更高密度寡核苷酸芯片, 扩大对肠道致病菌的 检测奠定了基础。 [参考文献 ] [ 1 ] Fach P, Perelle S, Grout J, et a l. Comparison of d ifferen t PCR tests for detect ing Sh igatox in2producingE scherich ia coli O157 and d evelopment of an EL ISA2PCR assay for sp ecific iden tificat ion of th e b acteria[ J]. M icrob iolMethod s, 2003, 55 ( 2): 383 - 392. [ 2] Song JM, Vo2D inh T. M in iature b ioch ip system for detection of E scherich ia coliO157BH 7 based on ant ibody2immob ilized cap illary reactors and en zyme2l ink ed immunosorben t assay[ J]. Anal Ch im A cta, 2004, 50( 7 ): 115- 121. [ 3] Fort in NY, Mulchandan iA, Ch enW. U se of real2t ime polymer2 ase chain react ion and molecu lar beacons for the detection of E scherich ia coli O157BH 7 [ J ]. Anal Biochem, 2001, 289 ( 2 ): 281- 288. [ 4 ] Call DR, Brockman FJ, Chand ler DP. Detecting and genotyping E scherich ia coliO157BH 7 us ingmu lt ip lexed PCR and nu cleic acid m icroarrays[ J]. FoodM icrob io,l 2001, 67 ( 1- 2): 71 - 80. [ 5] Fagan PK, H orn itzkyMA, Bettelheim KA. Detection of Sh iga2like toxin ( stx1 and s tx2 ), int im in ( eaeA ), and en teroh emorrhagic E scherich ia coli ( EHEC) hemolys in ( EHEC2h lyA ) genes in an i2 mal fecesbymult ip lex PCR [ J]. App lEnvironM icrob io,l 1999, 65 ( 2): 868 - 872. [ 6] Cebula TA, PayneWL, Feng P. Simultaneous ident ification of strain s ofE scherich ia col i serotype O157BH7 and their Sh iga2tox in type by mismatch amp lification mu tat ion assay2mu lt ip lex PCR [ J]. C linM icrob io,l 1995, 33( 1): 248- 250. [ 7] Law D. V iru len ce factors ofE sch erichia coli O157 and other Sh iga toxin2producingE. coli [ J]. JApp lM icrob io,l 2000, 88( 5): 729- 745. [ 8] Guan J, LevinRE. Quant itative detection ofE sch erich ia coli O157BH7 in ground b eef by the polymerase chain react ion[ J]. FoodM icrob io,l 2002, 19( 4): 159- 165. [ 9] Wu CF, Vald es JJ, Ben tleyWE. Biosen sors and DNA microarray for d iscrim ination between pathogen ic O157BH 7 EDL933 and non2pathogen ic E sch erichia coli strains [ J ]. Biosen s Bioelectron, 2003, 19 ( 1): 1- 8. (下转第 130页 ) 126 军事医学科学院院刊 2006年 4月 第 30卷 第 2期 在用 N i2NTA亲和层析柱纯化 rBoNT /B H c蛋白过程中 发现, 上柱前在样品缓冲液中预先加入少量咪唑 (其终浓度 范围为 2~ 20 mmol/L)是消除非特异性蛋白结合的重要环 节。通过摸索确定当咪唑终浓度达到 15mmol/L时,既可有 效抑制非特异性蛋白的结合, 又不影响目的蛋白的结合和随 后的洗脱效果, 还降低了分离难度,从而提高了目的蛋白的 纯度。在进行蛋白上样时, 选择较低的温度 ( 4e )可保证目 的蛋白与镍柱结合良好。在洗脱目的蛋白时,选择较高的离 子强度 ( 200mmol/L咪唑 )一次快速洗脱, 洗脱体积小、效率 高, 从而获得高浓度的目的蛋白。 Western印迹分析、鉴定 rBoNT /B H c时发现, 在普通转 移缓冲液转移 5 h后,用丽春红 S对蛋白染色几乎见不到蛋 白带。原因可能是 rBoNT /B H c属于强碱性蛋白 (理论 pI为 10. 265),转移效率很低造成的。为提高转移效率,在普通转 移缓冲液中加入了终浓度为 1%的 SDS, 结果转移效率明显 提高, 这说明加入 SDS有助于改善碱性蛋白的转膜效率 [ 8]。 总之, rBoNT /BH c的高效表达与快速纯化及其良好的 抗原性, 为下一步建立快速检测方法和制备相应的抗体及亚 单位疫苗奠定了基础。 [参考文献 ] [ 1 ] A rnon SS, Sch ecter R, Inglesby TV. Botu linum tox in as a b io2 logicalweapon: med ical and pub lic health management [ J ]. JAMA, 2001, 285 ( 16): 1059- 1070. [ 2 ] 王景林. 肉毒神经毒素及其相关医学防护问题 [ J ]. 军事医 学科学院院刊, 2003, 27( 3): 213- 215. [ 3 ] Swam inathan S, E swaramoorthyS. Structu ral analys is of the cata2 lytic and b ind ing sites of Clostrid ium botulinum n eurotoxin B [ J]. Nat Struct Bio,l 2000, 7 ( 8): 693- 699. [ 4 ] Singh BR. In timate details of th emos tpo isonou s poison [ J]. N at Stru ct Bio,l 2000, 7( 8 ): 617 - 619. [ 5] J.萨姆布鲁克, E. F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯著. 金冬雁, 黎 孟枫等译.分子克隆实验指南 [M ].北京:科学出版社, 1992. [ 6 ] 裴东生, 胡书群, 赵惠仁. 人白细胞介素 18在大肠杆菌中的 表达、纯化和复性 [ J]. 生物化学与生物物理学报, 2000, 32 ( 4 ): 397 - 400. [ 7] K irazov LP, V enkov LG, K irazov EP. Comparison of the Lowry and the Bradford protein assays as app lied for p rote in estimation of memb rane2contain ing fract ions [ J ]. Anal B ioch em, 1993, 208 ( 1): 44- 48. [ 8] 汪家政, 范 明,主编. 蛋白质技术手册 [ M ]. 北京:科学出 版社, 2000. 172 - 183. [ 9] Zhou Y, Singh BR. Clon ing, h igh2 level exp ression, s ingle2step purification, and b ind ing act ivity ofH is62tagged recomb in ant type B botu linum neurotoxin heavy chain tran smembrane and b inding domain[ J]. Protein E xp r Puri,f 2004, 34( 1): 8- 16. [ 10] Ihara H, Kohda T, Morimoto F, et al. Sequ ence of the gen e for Clostridium botulinum typ e B neu rotox in associated w ith in fant botu lism, expression of the C2term inal half of heavy chain and its b ind ing act ivity [ J]. Bioch im Biophys Acta, 2003, 1625 ( 1 ): 19 - 26. (本文编辑 杨兆弘 ) (上接第 126页 ) [ 10 ] Y osh itom iKJ, Jinn emana KC, Weagant SD, et a l. Opt im izat ion of a 302minor groove b inder2DNA p robe target ing th e u idA gene for rap id iden tificat ion of E sch erichia col i O157BH 7 u sing real2t ime PCR[ J]. Cell Probes, 2003, 17( 2): 275- 280. [ 11 ] H osh ino K, Yamasak i S, Mukhopadhyay AK. Developmen t and evaluat ion of a mu ltiplexPCR assay for rap id detect ion of tox igen ic Vibrio choleraeO1 and O139 [ J]. FEMS Immuno lMedM icrob io,l 1998, 20 ( 3): 201 - 207. [ 12 ] Robert2P ilotA, Baron S, Lesne J, et a l. Improved detection ofVib2 rio ch olera e in en vironmentalwater samp les by cu ltu re on select ive med ium and colony hybrid izat ion assay w ith an oligonucleotide p robe[ J]. FEMSM icrob io lE co,l 2002, 40( 3 ): 39- 46. [ 13 ] Sa id B, Sm ith HR, Scotland SM. D etect ion and differen tiat ion of gene for tox in co2regu lated p ili ( tcpA ) in Vibrio ch olera e non2 O1u sing the polymerase chain react ion [ J]. FEMSM icrob iolL ett, 1995, 125 ( 2- 3): 205- 209. [ 14 ] N airGB, Bag PK, Sh imada T. Evaluation ofDNA probes for spe2 cific detect ion ofVibrio choleraeO139Benga l[ J]. Cl inM icrob io,l 1995 , 33( 8): 2186- 2187. [ 15 ] Bhu iyanNA, Qadri F, Faruque AS. U se of d ipst ick s for rap id d i2 agnosis of cholera caused by Vibrio cholerae O1 and O139 from rectal swabs[ J]. Cl inM icrob io,l 2003, 41( 8 ): 3939- 3941. [ 16 ] Call DR, Boru ck iMK, Loge FJ. Detect ion of bacterial pathogens in env ironmental samp les us ing DNA microarrays[ J]. JM icrob io l Methods, 2003, 53 ( 2): 235 - 243. [ 17 ] H ong BX, J iang LF, H u YS. App lication of oligonucleotide array technology for the rap id detection of path ogenic b acteria of food2 borne in fections[ J]. J M icrob iolMethods, 2004, 58 ( 3 ): 403 - 411. [ 18 ] W ilsonW J, Strout CL, DeSant isTZ. Sequen ce sp ecific ident ifica2 tion of 18 pathogen ic m icroorgan isms u sing m icroarray technology [ J]. Mol Cell Probes, 2002, 16( 2): 119- 127. (本文编辑 杨兆弘 ) 130 军事医学科学院院刊 2006年 4月 第 30卷 第 2期