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19 蛋白质研究技术2.ppt

19 蛋白质研究技术2

小猴o0
2011-07-02 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《19 蛋白质研究技术2ppt》,可适用于高等教育领域

电泳ASDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)使用含有十二烷基硫酸钠(SDS)和还原剂(通常为巯基乙醇)的样品处理液对蛋白质样品进行处理(一般煮沸~分钟)通过加热和SDS可以使蛋白质变性多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键(使二硫键还原)。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子同时它有一个长的疏水尾巴SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律小分子走在前头大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳缓冲液加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。相对迁移率水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶B等电聚焦电泳(IFE)利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处。凝胶中加有两性电解质溶液(pH)加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度加样品然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后(+)(+)(-)(-)高pH高pH低pH低pHC双向电泳第一向:等电聚焦电泳第二向:SDSPAGE双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图:水平方向反映出蛋白在pI上的差异垂直方向反映出它们在分子量上的差别。第一向电泳:等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上进行第二向电泳第二向电泳:SDSPAGE分子量大分子量小pHpHpHpH大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后(+)(+)(-)(-)高pH高pH低pH低pH组织匀浆硫酸铵分级离子交换凝胶过滤亲和层析一种目的蛋白经五个纯化步骤(分别取样)的凝胶电泳图蛋白质的氨基酸序列确定每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列。实际上蛋白质的氨基酸序列是由DNA决定的。一级结构二级结构三级结构四级结构A蛋白质的氨基酸组成的定量确定酸水解:破坏蛋白质的肽键柱层析:进行氨基酸定量分析每个氨基酸的量与洗脱峰的面积成比例。BEdman降解方法常用于氨基酸序列的测定第一轮降解第二轮降解PTH-丙氨酸少了一个氨基酸残基的肽C大蛋白被水解成肽段后再测序Edman降解法测序一次只能连续降解几十个氨基酸残基。要测定大的蛋白质的氨基酸序列需要将蛋白质降解为一些肽段然后再进行Edman降解测序。溴化氰(BrCN):可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应生成一个C末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的N末端残基的肽。胰蛋白酶:特异地催化赖氨酸(Lys)残基和精氨酸(Arg)残基羧基侧的肽键的水解胰凝乳蛋白酶:特异地催化苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)三种芳香族氨基酸残基羧基一侧的肽键水解。胰蛋白酶作用胰凝乳蛋白酶作用拼出完整氨基酸序列将蛋白质水解为氨基酸测组成确定N和C端氨基酸确定小肽段氨基酸序列确定小肽段氨基酸序列利用两组不同肽段序列确定完整氨基酸序列氨基酸序列确定过程要点归纳可以根据各种蛋白质的溶解度、电荷、大小以及结合特性上的差异从生物资源中纯化蛋白质。常用的方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、SDSPAGE、等电聚焦和双向电泳等方法。离子交换层析层析分离蛋白质主要取决于各种蛋白质所带净电荷分为阳离子和阴离子交换层析。在进行离子交换层析时时刻要想到这样的原则:处于等电点(pI)的蛋白质所带净电荷为零当蛋白质所处溶液pH>pI时该蛋白质带负电荷如果pH<pI时蛋白质带正电荷。凝胶过滤层析是按照蛋白质分子大小进行分离的。根据使用的凝胶排阻分子量不同可以分离分子量范围不同的蛋白质。在凝胶容许分离的分子量范围内蛋白质分子量对数与洗脱体积成比例所以可以根据标准蛋白质曲线求出未知蛋白质的分子量。要注意是整个蛋白质分子量而不是亚基(即构成寡聚蛋白的多肽链)的分子量而SDSPAGE求出的是亚基(肽链)的分子量。蛋白质质量的精确测定可以通过沉降平衡测定或质谱确定。亲和层析取决于分离蛋白与配体的亲和程度。配体都是通过共价键与载体(树脂或葡聚糖凝胶)结合配体可以是酶底物、抑制剂、抗体(或抗原)或其他特异识别要纯化的目的蛋白等的分子(或基团)。SDSPAGE是在变性条件下进行的电泳SDS按照一定比例(克蛋白结合克SDS)通过疏水相互作用与蛋白质结合由于SDS为十二烷基硫酸钠一端为疏水尾部另一端带负电荷所以掩盖了原有蛋白质所带电荷因此SDSPAGE大致按照肽链大小进行分离。在一定凝胶(指分离胶)浓度范围内蛋白质(肽链)分子量对数与蛋白质(肽链)的相对迁移率成直线关系所以利用一组标准蛋白同时与未知蛋白一起电泳通过标准蛋白的标准曲线可以求出未知蛋白的分子量。等电聚焦则是在一个pH梯度凝胶中根据蛋白质等电点进行分离的。双向电泳是等电聚焦电泳与SDSPAGE组合的电泳通常第一向为等电聚焦电泳第二向为SDSPAGE。最后得到的电泳图谱是二维图象。一个蛋白质的组成可以通过在NHCl、℃条件下水解成其构件分子氨基酸来确定。水解生成的氨基酸通过离子交换层析进行分离然后分离的氨基酸再与茚三酮等试剂反应进行定量。多肽的氨基酸序列可以通过Edman降解确定测定使用的是与N末端氨基酸残基的氨基反应的异硫氰酸苯酯(PITC也称之为Edman试剂)。PITC与末端氨基反应经环化等最后形成PTH-氨基酸每一轮都是从肽的N末端除去一个氨基酸。自动重复Edman降解测序仪可以分析大约个氨基酸残基的序列。长的多肽链的序列利用蛋白酶和化学试剂有选择地水解为小的肽段再通过Edman降解测序然后通过比较两套或几套有交叉重叠的肽段的氨基酸序列推测出整个多肽链的氨基酸序列。CNBr特异切断Met羧基侧的肽健切断后的Met变成高丝氨酸内酯。胰蛋白酶特异作用于Arg和Lys羧基侧的肽健胰凝乳蛋白酶特异作用于Phe、Tyr和Trp羧基侧肽健。另外羧肽酶从肽段或蛋白质的C末端逐一水解氨基酸残基。肽可以化学合成分为液相合成法和固相合成法。液相合成法中肽链的生长是从N端向C端方向而固相合成法肽链延伸是从C端向N端方向。现在常用的是固相合成法在该方法中生长着的肽链的羧基端与固相载体连接要整合到肽链上的氨基酸的α羧基被N,N二环己基碳二亚胺(DCC)激活并与生长着的肽链的α氨基结合使肽链延伸一个氨基酸。

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