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19 蛋白质研究技术1.ppt

19 蛋白质研究技术1

小猴o0
2011-07-02 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《19 蛋白质研究技术1ppt》,可适用于高等教育领域

蛋白质研究技术透析层析原理凝胶过滤离子交换层析亲和层析电泳蛋白质氨基酸序列确定肽的化学合成透析按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋开始透析处于平衡状态层析也称之色谱基本原理是分析样品作为流动相流过固相时由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。层析原理将作为固相成分的不溶性基质例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中用平衡液平衡。然后加样品再用适当的溶剂洗脱。样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用最后以不同速率被洗脱出来达到将各个成分分离的目的。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。凝胶过滤层析带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响有时带正电荷有时带负电荷此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。离子交换层析的固相是离子交换体包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。带有SO-或COO-基团通常以SO-Na+或COO-H+形式出现的叫做阳离子交换基带有N+(CH)基团通常以N+(CH)Cl-出现的叫做阴离子交换基。离子交换层析阳离子交换基强酸性聚苯乙烯树脂弱酸性羧甲基纤维素弱酸性螯合作用聚苯乙烯树脂阴离子交换基强碱性聚苯乙烯树脂弱碱性二乙氨乙基纤维素时刻要记住:蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物所以蛋白质也存在等电点(pI)蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同取决于所处溶液的pH值。当pI<pH时蛋白质带净负电荷而当pI>pH时蛋白质带净正电荷。举一例子:已知蛋白X等电点为设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案:建立阴离子交换柱比如QSepharose。用pH的缓冲液平衡柱子同时蛋白X溶解于pH的缓冲液中在此pH值下蛋白X带有负电将含有蛋白X的混合液上样然后用起始液冲洗蛋白X会与此柱结合然后盐梯度洗脱。阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集依赖于蛋白质和它的配体(ligand)之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合(一般是非共价结合)的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中配体是通过共价键先与基质结合配体可以是酶结合的一个反应物或产物或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时只有靶蛋白可以特异地与基质结合而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高至倍。亲和层析含配体溶液收集目的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠(或胶粒)亲和层析过程

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