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13 DNA的复制与修复.ppt

13 DNA的复制与修复

小猴o0
2011-07-02 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《13 DNA的复制与修复ppt》,可适用于高等教育领域

第十三章DNA的复制和修复生物体的遗传信息储存在DNA中并通过DNA的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能使后代表现出与亲代相似的遗传性状。基因性状:onegeneoneenzymehypothesis年FCrick提出中心法则:()以原DNA分子为模板合成出相同DNA分子的过程。()以某一段DNA分子为模板合成出与其序列对应的RNA分子的过程。()以mRNA为模板根据三联密码规则合成对应蛋白质的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。DNA生物合成有两种方式:DNA复制和反转录DNA体内复制涉及:原核、真核生物的染色体、细菌质粒(环状双链)、真核细胞器DNA(线粒体、叶绿体)、病毒(双链环状)DNA的体外复制:分子克隆。第一节 DNA的复制一、 DNA半保留复制年Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。P图Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型在复制过程中首先亲代双链解开然后每条链作为模板在其上合成互补的子代链结果新形成的两个子代DNA与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样而且每个子代DNA分子中有一条链完全来自亲代DNA另一条是新合成的。 年Meselson和Stahl用N标记EcoliDNA用密度梯度离心试验证明了DNA的复制是半保留复制。P图DNA的半保留复制。年Cairns用放射自显影法在显微镜下首次观察到完整的正在复制的Ecoli染色体DNA。P图 H脱氧胸苷标记EcoliDNA经过将近两代时间用溶菌酶消化细胞壁将EcoliDNA转至膜上干燥压感光胶片H放出β粒子还原银在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子并以半保留的形式进行复制。DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制DNA的多核苷酸链仍可以保持完整并存在于后代而不被分解掉。二、 复制起点、单位和方向DNA复制的调控是在起始阶段进行的一旦复制起始它就会继续下去直到整个复制子完成复制。、  复制起点复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时两条链的复制起点并不在同一点上(不对称复制如D环复制)。在一个完整的细胞周期中每一个复制起点只使用一次完成一次复制过程。多数生物的复制起点都是DNA呼吸作用强烈(甲醛变性实验)的区段即经常开放的区段富含AT。★环状DNA复制起点的genemappingP图★复制起点的克隆和功能分析重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点oriC区Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样受到严密控制每个细胞只有个拷贝用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小最后得到bp的基本功能区携带它的质粒依然能够自我复制拷贝数可以增加到以上这说明发动复制的序列在bp的基本功能区而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和Kb之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段bp的DNA片段上与大肠杆菌的复制起始区有同源性而且有些亲缘关系较远的细菌其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此复制起始区的结构可能是很保守的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。、  复制单位复制子(Replicon):Genome能独立进行复制的单位每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子它们都是单复制子都在一个固定的起点开始复制复制方向大多数是双向的少数是单向复制。多数是对称复制(θ形复制)少数是不对称复制(一条链复制后才进行另一条链的复制,如D环复制)。真核生物的染色体DNA是线形双链分子含有许多复制起点因此是多复制子每个复制子约有Kbp。人体细胞平均每个染色体含有个复制子。病毒DNA多种多样环状或线形双链或单链但都是单复制子。、  复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行)形成两个复制叉少数是单向复制形成一个复制叉。★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度P图单向和双向复制的放射自显影证明低放射性H脱氧胸苷高放射性H脱氧胸苷a单向b双向等速c双向异速Ecoli的一个温度敏感株在℃时能使DNA在完成复制后不再开始新的复制过程而在℃时复制功又能能恢复。、  DNA的几种复制方式()、   直线双向复制单点双向T多点双向真核染色体DNA()、θ型复制:环状双链DNA对称复制单向或双向(Ecoli)()、   滚环复制:环状单链DNAΦx()、   D环复制(取代环复制):不对称复制线粒体、叶绿体DNA。两条链的复制起点不在同一点上一条链先复制另一条链保持单链而被取代:当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点另一条链才开始复制。()、   多复制叉复制:第一轮复制尚未完成复制起点就开始第二轮的复制。DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定DNA复制的速率实际上取决于起始频率。Ecoli复制叉移动的速率约Kbmin复制一代约需分钟X(KbX)=。富营养时可采取多复制叉复制方式min复制一代。真核复制叉前进的速率约bpmin采用多复制子方式真核染色体复制一代要小时。三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子目前已发现多种酶及蛋白质因子参与DNA复制(一)DNA聚合酶和DNA的聚合反应DNA生物合成→化学合成→、  DNA聚合反应必备的条件⑴DNA聚合酶⑵DNA模板(反转录时用RNA模板)⑶引物(DNA、RNA或蛋白质)⑷种dNTP⑸Mg、  聚合反应过程及特点总反应式:ndATPDNApoldAMPndGTPDNAdGMPDNA(nnnn)PPindCTPMgdCMPndTTPdTMP P图P图 在链的延长过程中链的游离羟基对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击生成磷酸二酯键并脱下焦磷酸。DNA聚合酶的反应特点:⑴以种dNTP为底物⑵反应需要接受模板的指导不能催化游离的dNTP的聚合。⑶反应需有引物羟基存在⑷链生长方向→⑸产物DNA的性质与模板相同、  由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型P图()   发荚环结构:加入单链DNA作为模板和引物'羟基端回折成引物链。()   末端延伸聚合:加入双链DNA作为模板和引物’末端突出作为模板。()   分枝型和切口平移型聚合:加入双链DNA聚合发生在切口或末端单链区。()   环形聚合:加入带引物的环形DNA作为模板。、  EcoliDNA聚合酶()、EcoliDNApolI(Kornberg酶copycell)单体酶分子量Kd含一个Zn每个细胞中含个DNApolⅠ催化活性:→聚合活性→外切活性→外切活性用蛋白水解酶将DNApolⅠ部分水解可得:大片段(Klenow)Kd活性:→聚合活性、→外切活性。小片段Kd活性:→外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分切除修复)。Klenow片段的用途:a补齐DNA隐缩未端b标记DNA片段未端c.cDNA合成第二链d.dDNA测序()、   EcoliDNAPolⅡ(copycell)单体酶分子量Kd催化活性:→聚合(活性很低)→外切可能在DNA的修复中起某中作用。()、   EcoliDNApolⅢ(复制酶copycell)寡聚酶全酶由种共个亚基组成α、ε和θ三种亚基组成核心酶。P表 DNApolⅢ是合成新链DNA主要的酶又称复制酶(Replicase)PolⅢ的→外切酶活性只作用于单链DNA。P表Ecoli三种DNA聚合酶的性质比较  ★DNA聚合酶有个结合位点⑴模板DNA结合位点⑵引物结合位点⑶引物OH位点、反应位点⑷底物dNTP结合位点⑸→外切位点(polⅡ没有)⑹→外切位点(校正)、  真核生物DNA聚合酶P表真核生物DNA聚合酶 真核DNA聚合酶一般不具备外切活力可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。⑴DNA聚合酶α多亚基功能与EcolipolⅢ类似是真核DNA复制酶。⑵DNA聚合酶β主要在DNA损伤的修复中起作用。⑶DNA聚合酶γ从线粒体得到可能与线粒体DNA的复制有关。⑷DNA聚合酶δ特点:有→外切活力(二)引物酶或RNA聚合酶(引发酶)细胞内DNA的复制需要引物(DNA或RNA)引物酶或RNA聚合酶可合成个碱基的RNA引物。★DNA复制为什么要用RNA引物?(为什么DNA聚合酶要用引物RNA聚合酶不需要引物?)P⑴从模板复制最初几个核酸时碱基堆集力和氢键都较弱易发生错配⑵新复制的最初几个核苷酸没有与模板形成稳定双链DNA聚合酶的→校对功能难发挥作用。(三)、解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同作用将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链的’→’方向随着复制叉的前进而移动而rep蛋白则在另一条模板链上沿’→’方向移动。(四)DNA旋转酶属DNA拓扑异构酶Ⅱ可引入负超螺旋消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类:I和II广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接反应无须供给能量主要集中在活性转录区与转录有关。拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部与复制有关。(五)单链DNA结合蛋白(SSB)复制叉上的解螺旋酶沿双链DNA前进产生单链区大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。(六) DNA连接酶(ligase)连接双链DNA上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。TDNAligase即可连接粘性末端的DNA又可连接平齐末端的双链DNA。Ecoli和其它细菌的DNAligase以NAD为能源动物细胞和噬菌体DNAligase以ATP为能源。(七) DNA复制的拓扑结构 P四、 DNA的半不连续复制P图DNA的半不连续复制DNA聚合酶催化的方向是→。前导链:滞后链:年发现冈崎片段。长度:细菌:KbKb相当于一个顺反子的大小。真核:bp约等于一个核小体DNA的长度。五、 DNA复制过程(Ecoli)P图大肠杆菌的复制体结构示意图、  复制的起始引发:当DNA的双螺旋解开后合成RNA引物的过程。引发体:引物合成酶与各种蛋白质因子(dnaB、dnaC、n、n'n''I)构成的复合体负责RNA引物的合成。引发体沿着模板链’→’方向移动(与冈崎片段合成的方向正好相反而与复制叉移动的方向相同)移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。 EcoliDNA复制原点oriC由bp组成三组bp重复序列(近端处)四组bp重复序列(另一端处)。 图★大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质:DNaA在原点处打开双螺旋DNaB使DNA解旋DNaCDNaB结合在原点所需Hu刺激起始引物酶(DNaG)合成RNA引物SSB结合单链DNARNA聚合酶促进DNaA活性旋转酶松驰DNA扭曲应力个DnaA结合在四组bp重复区形成起始复合物DNA环绕此复合物。三组bp重复区依次变性产生开放型复合物。DnaB(在DnaC协助下)与开放复合物结合进一步解链。、  DNA链的延长反应前导链只需要一个RNA引物后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物链的延长反应由DNApolⅢ催化。复制体:在DNA合成的生长点(既复制叉上)分布着许多与复制有关的酶和辅助因子它们在DNA的模板链形成离散的复合物彼此配合进行高度精确的复制称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。、  RNA引物的切除及缺口补齐DNApolⅠ的→外切活力切除RNA引物。DNApolⅠ的→合成活性补齐缺口。、  DNA切口的连接DNAligase动物、真核由ATP供能原核由NAD供能。、  DNA合成的终止环状DNA、线性DNA复制叉相遇即终止。 ★    小结:⑴DNA解螺旋酶解开双链DNA。⑵SSB结合于DNA单链。⑶DNA旋转酶引入负超螺旋消除复制叉前进时带来的扭曲张力。⑷DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。⑸DNApolⅢ在两条新生链上合成DNA。⑹DNApolⅠ切除RNA引物并补上DNA。⑺DNAligase连接一个冈崎片段。DNA复制过程中聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中此时U糖苷酶、AP内切酶、DNApolⅠ、DNAligase共同作用切除尿嘧啶接上正确的碱基。六、 真核生物DNA的复制P、  复制起点和单位真核生物染色体DNA是多复制子有多个复制起点可以多点起始分段进行复制。每个复制子大多在bp之间比细菌染色体DNA(单复制子)小得多。 ★试验证据:氟脱氧胞苷标记 真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢如哺乳动物复制叉移动的速度每分钟Kb细菌每分钟Kb。真核生物染色体全部复制完成前起点不再从新开始复制。而在快速生长的原核生物中起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时可采用更多的复制起点同时复制。如黑腹果蝇早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为kb而在培养的成体细胞中平均距离为kb成体细胞只利用一部分复制起点。、  复制过程中组蛋白的装配核小体的结构(bp左右)在真核生物的复制子上亲代染色体的核小体被逐个打开组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此DNA的复制是半保留的而组蛋白则是全保留的。★试验证据:环己酮亚胺抑制组蛋白合成电子显微镜下观察、  真核生物DNA复制的终止端粒:一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体是真核细胞染色体末端所特有的结构。功能:⑴保证线性DNA的完整复制⑵保护染色体末端⑶决定细胞寿命胚系细胞含端粒酶体细胞不表达端粒酶。端粒(telomeres)分布于线性真核染色体未端。酵母端粒约bp的重复序列形式为:(TxGy)n(AxCy)nx和y一般为。端粒末端的重复序列通过端粒酶(telomerase)将其加到染色体末端。端粒酶含有RNA和蛋白质(起DNA聚合酶的作用)两种组分RNA分子约b含有多个CyAx重复序列RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。人类体细胞的端粒长度随个体年龄增加而逐渐缩短。细胞每分裂一次端粒缩短bp短至Kbp时细胞就停止分裂。若能重建端粒则细胞可以永远分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达多。 ⑴杂交图 ⑵聚合图 ⑶转位再杂交图 ⑷进一步聚合图 ⑸非标准GG配对图七、 DNA复制的调控八、 DNA复制的真实性《杨岐生》P生物体DNA复制具有高度真实性复制碱基对,只有一个错误碱基。碱基对的自由能通常在KJmol这样的自由能相当于平均参入个核苷酸就可能出现一次错配仅靠WatsonCrick双螺旋的碱基配对原则突变率将高达。、  DNA聚合酶对碱基的选择作用酶的被动论:不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同正确的dNTP能长时间停留而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸选择正确的dNTP掺入引物末端。酶积极参与理论:DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸不仅亲和性不同而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。动力学校正阅读:在新的磷酸二酯键未形成时dNTP结合在酶与模板引物复合物的聚合位点上DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。DNA聚合酶对底物的识别作用DNA聚合酶有两种底物一种是DNA模板引物另一种是dNTP。DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的未端再识别底物dNTP是一种有序的识别过程。、  →外切活性的校正阅读EcoliDNApolⅠ和polⅢ有→外切活性可删除错误插入的核苷酸。缺失→外切活性的EcoliDNApolⅠ催化DNA合成时出现错误的几率增高倍。因此→外切活性可以使DNA复制的真实性提高个数量级。图 、  影响DNA合成真实性的因素⑴高浓度NMP(如AMP,GMP)NMP竞争酶的dNTP结合位点抑制→外切活性。⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物末端离开外切活性中心。⑶dNTP一般与二价阳离子结合成活化形式Mg为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子(如Mn)代替Mg时会改变酶的主体结构影响聚合活性和→外切活性。、  为什么用RNA引物⑴从模板复制最初几个核酸时碱基堆集力和氢键都较弱易发生错配⑵新复制的最初几个核苷酸没有与模板形成稳定双链DNA聚合酶的→校对功能难发挥作用。第二节              DNA的损伤及修复DNA的损伤《罗纪盛》P 一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤破坏其结构与功能。然而在一定条件下生物机体能使这种损伤得到修复。紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体(TT)两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体(CT、CC)使复制、转录受阻。P图细胞内具有一系列起修复作用的酶系统可以除去DNA上的损伤恢复DNA的双螺旋结构。目前已知有种酶修复系统:光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复后三种不需要光又称为暗修复。一、 光复活年已发现光复活现象可见光(最有效nm)可激活光复活酶此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。 P图紫外线损伤的光复活过程 A形成嘧啶二聚体B光复合酶结合于损伤部位C酶被可见光激活D修复后释放酶二、 切除修复P图DNA损伤的切除修复过程 在一系列酶的作用下将DNA分子中受损伤部分切除并以完整的那一条链为模板合成出切去部分DNA恢复正常结构。I、结构缺陷的修复:()核酸内切酶识别DNA损伤部位在其附近将其切开。()核酸外切酶切除损伤的DNA。()DNA聚合酶修复。()DNA连接酶连接。图II、无嘌呤无嘧啶碱基缺陷或错配脱碱基(N糖苷酶):甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第位氮原子烷基化活化β糖苷键造成脱嘌呤作用酸也能使DNA脱嘌呤。DNA复制时DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高有少量dUTP掺入DNA链。细胞中的尿嘧啶N糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤N糖苷酶切掉次黄嘌呤。对于无嘌呤无嘧啶的损伤有两种修复方法:()   AP核酸内切酶切开核酸外切酶切除DNA聚合酶修复DNA连接酶连接。()   插入酶插入正确碱基三、 重组修复P图重组修复的过程 切除修复发生在DNA复制之前而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位可以先复制再重组修复。在重组修复过程中DNA链的损伤并未除去。重组修复至少需要种酶组分。重组基因recA编码一种分子量为的蛋白质它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。此外修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。四、 诱导修复和应急反应(SOS反应)诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下为求得生存而出现的一系列诱导性修复。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复(无差错修复)和倾向差错的修复。避免差错的修复:SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生从而加强光复活切除修复和重组修复的能力这属于避免差错的修复。倾向差错的修复:SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡可是却带来了高的突变率这属于倾向差错的修复。SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不仅在同源重组中起重要作用而且它也是SOS反应的最初发动因子。在有单链DNA和ATP存在时RecA蛋白被激活而表现出蛋白水解酶的活力它能分解λ噬菌体的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白(Kd)许多基因的阻遏物当它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因uvrA、uvrB、uvrC(分别编码核酸内切酶的亚基)以及recA和lexA基因本身还有单链结合蛋白基因ssb与λ噬菌体DNA整合有关的基因himA、与诱变作用有关的基因umuDC与细胞分裂有关的基因sulAruv和lon以及一些功能不清楚的基因dinABDF等。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。然而癌变有可能也是通过SOS反应造成的因为能引起SOS反应的作用剂通常都具有致癌作用如X射线紫外线烷化剂黄曲霉素等而某些不能致癌的诱变剂并不引起SOS反应如溴尿嘧啶。目前有关致癌物的一些简便检测方法就是根据SOS反应原理而设计的既测定细菌的SOS反应。第三节              RNA指导的DNA合成(反转录)反转录(reversetranscription):以RNA为模板合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。年Temin和Baltimore分别从致癌RNA病毒(劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒)中发现发反转录酶。致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。放线菌素D(抑制以DNA为模板的反应复制和转录)能抑制致癌RNA病毒的复制可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。Bader用嘌呤霉素(puromycin)来抑制静止细胞蛋白质的合成发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒(RSV)证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的而不是感染后在宿主细胞中新合成的。一、 反转录酶由一个α亚基和一个β亚基组成含有Zn具有三种酶活力。()RNA指导的DNA聚合酶活力(以RNA为模板合成一条互补的DNA形成RNADNA杂种分子)。()RNaseH酶活力水解RNADNA杂种分子中的RNA可沿’→’和’→’两个方向起外切酶作用。()DNA指导的DNA聚合酶活力。模板:RNA或DNA以自身病毒类型的RNA为模板时该酶的反转录活力最大但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。引物:RNA或DNA底物:dNTP二价阳离子:Mg或Mn真核mRNA’端有polyA加入oligodT后可以作为反转录酶的模板合成cDNA。二、 病毒RNA的反转录过程所有已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶因此被称为反转录病毒(retrovirus)反转录病毒的复制需要经过一个DNA中间体(前病毒)。、  反转录病毒的基因组结构P图()            反转录病毒基因组通常由两条相同的()RNA链组成。’端附近区域以氢键结合在一起全长Kb。()            每一条RNA链的两端具有相同的序列形成正向重复序列。()            ’端有帽子结构’端有polyA与真核mRNA相似。()            ’端带有分子的宿主tRNA作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp鼠类是tRNApro、  反转录过程。当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时病毒RNA及反转录酶一起进入宿主细胞病毒自身带入的反转录酶使RNA反转录成双链DNA。()   以病毒()RNA为模板合成互补的()DNA。()   切除RNADNA杂种分子中的RNA。()   以()DNA链为模板合成()DNA链最后形成两端带有LTR(长末端重复序列)的双链DNA。反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA后才能被转录转录产物经拼接可以产生不同的病毒mRNA。LTR(长末端重复序列)对前病毒DNA整合到宿主染色体DNA以及整合后的转录均起着重要作用。 反转录病毒合成的过程:图缺口的模板(基因组)RNA在U旁生成一个正链DNA的合成RNA的引物而其余的模板RNA被降解。正链DNA合成开始复制。图、  反转录病毒的生活周期P图()   病毒粒子侵染细胞病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。()   RNA被反转录成双链DNA(前病毒)环化进入细胞核。()   反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。()   前病毒DNA进行复制转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。()   基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子转移到质膜通过出芽方式释放新病毒粒子。三、 反转录的生物学意义。.反转录酶存在于所有致癌RNA病毒中它的存在与RNA病毒引起细胞恶性转化有关。.艾滋病毒(AIDS)人类免疫缺陷病毒(HIV)也是一种反转录病毒主要感染T淋巴细胞和B淋巴细胞。病毒粒子直径nm球状粒子外包被两层脂质质膜膜上有糖蛋白(gp、gp)另有两层衣壳蛋白p、p。HIV基因组由两条单链正链RNA组成每个链长kbRNA端有帽子结构’端有PolyA链上结合有反转录酶。.乙肝病毒大蛋白、中蛋白、主蛋白(表面抗原)核心抗原双链环状DNA 乙肝病毒与反转录病毒的区别:P、真核生物正常细胞内也存在反转录过程真核生物的谈色体基因组中存在为数众多的逆假基因和逆基因。逆假基因:无启动子和内含子但有polyA的残基推测是由mRNA反转录后整合到基因组中去的。逆基因:具有启动子和转录功能无内含子。可能是由于mRNA反转录后刚好整合到启动子的下游处或者是带启动子的RNA序列反转录后整合到基因组中第四节    DNA合成技术一、   cDNA合成、     cDNA文库的构建cDNA:以mRNA为模板用反转录酶合成第一链去除mRNA合成第二链。cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法成熟的mRNA无内含子。()、 真核mRNA的分离纯化特点:含量少不均一表达具有发育阶段性和组织特异性。总RNA:rRNA~mRNA~tRNA及其它小分子RNA~不均一:在~的mRNA中有­种mRNA。分离、纯化:用OligodT纤维素柱(亲和层析法)加入总RNA高盐洗脱先流出非mRNA降低盐浓度加入OligodA竞争可洗出mRNA混合物。免疫法可分离特定的mRNA。()、cDNA合成(反转录酶)A自身引物法(S核酸酶降解法)图Oligo(dT)个核苷酸mRNA’端序列有丢失。B取代合成法(较常用)图 Oliyo(dT)与mRNA’端AAA杂交作为引物合成第一条DNA链。RNaseH在mRNA上产生多个切口。DNApolⅠ切口平移DNAligase连接合成出第二条DNA链。TDNApol切去端头的RNADNA杂交链。C引物合成法可以合成全长cDNAmRNA的’端不丢失。图D、末端转移酶法()、           cDNA与载体连接()、           重组体的转化()、           扩增、保存、     获取特定mRNA的cDNA()免疫法分离特定的mRNA()PCR法二、   PCR技术(聚合酶链式反应)PolymerasechainReaction以目的基因或DNA片段为模板在引物介导及TaqDNA聚合酶催化下在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。、     反应物()模板单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板若以RNA为起始材料则须经反转录获得第一条cDNA后才能用于PCR。()TaqDNA聚合酶DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键从水生栖热菌(ThermusaquaticnsVT)分离出来。TaqDNA聚合酶有很好的热稳定性℃处理min仍保留的酶活性在℃活性最高错误掺入核苷酸的比率为。()引物引物是决定PCR结果的关键它由寡核苷酸组成个b()核苷酸dNTPdNTP的浓度umulL。()镁离子Mg、     PCR原理图 变性℃复性℃延伸℃

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