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03 蛋白质.ppt

03 蛋白质

小猴o0
2011-07-02 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《03 蛋白质ppt》,可适用于高等教育领域

第三章蛋白质第三章蛋白质第一节        蛋白质概论一、 蛋白质的化学组成与分类、  元素组成碳氢氧氮硫微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮:粗蛋白质含量=蛋白氮×、  氨基酸组成蛋白质是由种L型α氨基酸组成的长链分子、  分类()按组成:简单蛋白:结合蛋白:详细分类P表表。(注意辅基的组成)。()、按分子外形的对称程度:球状蛋白质纤维状蛋白质、膜蛋白质()、按功能分:酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。二、 蛋白质的大小与形状少于个aa的低分子量aa多聚物称为肽寡肽或生物活性肽有时也罕称多肽。多于个aa的称为蛋白质。蛋白质分子量=aa数目*三、 蛋白质分子的构象与结构层次蛋白质都有自己特有的天然空间结构称为构象。 一级结构:氨基酸顺序二级结构:α螺旋、β折叠、β转角无规卷曲三级结构:α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段四级结构:多亚基聚集四、 蛋白质功能的多样性.酶.结构成分(结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白).贮藏(卵清蛋白、种子蛋白).物质运输(血红蛋白、NaKATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体).细胞运动(肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白).激素功能(胰岛素).(抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白).接受、传递信息(受体蛋白味觉蛋白).调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达(组蛋白、阻遏蛋白)第二节          氨基酸第二节          氨基酸一、 蛋白质的水解(详见P)酸水解:色氨酸破坏天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基碱水解:消旋色氨酸稳定酶水解:水解位点特异用于一级结构分析肽谱二、 氨基酸的功能:()、组成蛋白质()、一些aa及其衍生物充当化学信号分子氨基丁酸色氨酸衍生物:羟色胺、褪黑激素都是神经递质甲状腺素(Tyr衍生物)吲哚乙酸(Trp衍生物)都是激素()、氨基酸是许多含N分子的前体物核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa()、一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸)尿素循环的中间物三、 氨基酸的结构与分类基本氨基酸(编码的蛋白质氨基酸):组成蛋白质种稀有氨基酸:是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。非蛋白质氨基酸:存在于生物体内但不组成蛋白质(约种)。(一)  编码的蛋白质氨基酸(种)结构通式:、按照R基的化学结构分类()、R为脂肪烃基的氨基酸(种)R基均为中性烷基R基对分子酸碱性影响很小它们几乎有相同的等电点。(±)Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸因此不具旋光性从Gly至IleR基团疏水性增加()、R中含有羟基和硫的氨基酸(共种)Ser的CHOH基(pKa=)在生理条件下不解离但在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。 Ser和Thr的OH往往与糖链相连形成糖蛋白。★Cys的R中含巯基(SH)具有两个重要性质:()在较高pH值条件巯基离解。()两个Cys的巯基氧化生成二硫键生成胱氨酸。 u     Cys与结石★Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。()、      R中含有酰胺基团(种)酰胺基中氨基易发生氨基转移反应()、R中含有酸性基团(种)Asp、GluAsp侧链羧基pKa为Glu侧链羧基pKa为它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个 氨基酸()、R中含碱性基团(种)Lys侧链氨基的pKa为生理条件下Lys侧链带有一个正电荷(NH)侧链的氨基反应活性增大。Arg是碱性最强的氨基酸侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱pKa值为生理条件下完全质子化。His是pKa值最接近生理pH值的一种(游离氨基酸中为在多肽链中为)是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。His在酶的酸碱催化机制中起重要作用在nm处Trp吸收最强Tyr次之Phe最弱。()、 芳香族氨基酸()、杂环族氨基酸(种)Pro的α亚氨基是环的一部分因此具有特殊的刚性结构。一般出现在两段α螺旋之间的转角处Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化u     必需氨基酸:成年人:Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、Met婴儿期:Arg和His供给不足属半必须氨基酸、按照R基的极性性质可以分为类:侧链极性(疏水性程度)()、非极性氨基酸种在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用(蛋白质的疏水核心)。()、 不带电何的极性氨基酸种这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键因此很容易溶于水()、带负电荷的aa(酸性aa)()、带正电何的aa(碱性aa)胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胚基碱性很强与NaOH相当。His是一个弱碱是天然的缓冲剂它往往存在于许多酶的活性中心。非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心带电荷的aa和极性aa位于表面。酶的活性中心:His、Ser、Cys(二) 非编码的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸是在蛋白质合成后由基本氨基酸修饰而来。()羟脯氨酸 ()羟赖氨酸这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。 ()N甲基赖氨酸(存在于肌球蛋白中) ()г羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有结合Ca离子功能的蛋白质中。 ()Tyr的衍生物:二碘酪氨酸、甲状腺素(甲状腺蛋白中)()锁链素由个Lys组成(弹性蛋白中)。(三) 非蛋白质氨基酸P不组成蛋白质但有生理功能()L型α–氨基酸的衍生物L瓜氨酸、L鸟氨酸是尿素循环的中间物()D型氨基酸DGlu、DAla(肽聚糖中)、DPhe(短杆菌肽S)()β、γ、δ氨基酸βAla(泛素的前体)、γ氨基丁酸(神经递质)。三、 氨基酸的构型、旋光性和光吸收、  氨基酸的构型与旋光性Gly一种构型,无旋光性Thr和Ile有四种光学异构体。其余种氨基酸有两种光学异构体:L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L型(L苏氨酸)。 ★氨基酸的旋光性(符号和大小)取决于它的R基的性质并与溶液的PH值有关。 P表蛋白质中L型氨基酸的比旋光度★ 外消旋物:D型和L型的等摩尔混合物。L苏氨酸和D苏氨酸组成消旋物。L别一苏氨酸和D别苏氨酸组成消旋物★内消旋物:分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体:L胱氨酸、D胱氨酸、内消旋胱氨酸。L胱氨酸和D胱氨酸是外消旋物、  氨基酸的光吸收性Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键在nm近紫外区有吸收。λ(nm)εTyr×Phe×Trp×LambertBeer:在nm有最大光吸收四、 氨基酸的酸碱性质(重点)、  氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在 ①晶体溶点高→离子晶格不是分子晶格。②不溶于非极性溶剂→极性分子③介电常数高→水溶液中的氨基酸是极性分子。α羧基pK在左右当pH>α羧基以COO形式存在。α氨基pK在左右当pH<时α氨基以αNH形式存在。在pH时带有相反电荷。、  氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线HA→AHpH=pKaLogA/HA()pKa就是HA解离(碱=酸)时溶液的pH值Ka就是此时溶液的H()当HA解离时溶液的pH值等于pKa()pH=pKa时碱=酸(解离)pH>pKa时碱>酸(>解离)pH<pKa时酸>碱(<解离)KaKa=HAHA在pH和pH处Gly具有缓冲能力。 起点:Gly净电荷:第一拐点:GlyGly±平均净电荷:pH=pKlgGly±Gly=pK=第二拐点:Gly±净电荷:等电点pI第三拐点:Gly±Gly平均净电荷:pH=pKlgGlyGly±=pK=终点:Gly净电荷:Gly的等电点:★pH>pI时氨基酸带负电荷COOH解离成COO向正极移动。 pH=pI时氨基酸净电荷为零 pH<pI时氨基酸带正电荷NH解离成NH向负极移动。 问题:()pH=pKa时缓冲能力最大等电点时缓冲能力最小。为什么?()pI的计算(氨基酸寡肽)等电点时各组分的比例()不同pH下的电泳行为和各组分比例 ()利用pI和pKa确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围()绘制滴定曲线(Glu) 根据P页表中Glu的数据(pKαCOOHpKαNHpKRRCOOHpI)①绘出滴定曲线②指出Glu和Glu=各一半时的pH值③指出Glu总是带正电荷的pH范围④指出Glu±和Glu能作为缓冲液使用的pH范围①解:见图②Glu和Glu=各时pH为③pH<时Glu总带正电荷④Glu±和Glu缓冲范围pH左右五、 氨基酸的化学性质(一)   αNH参加的反应、与亚硝酸反应PVanSlyke法测定氨基酸、  酰化反应苄氧甲酰氯(carbobenzyloxychloride,Cbzcl)叔丁氧甲酰氯对甲苯磺酰氯邻苯二甲酸酐多肽的人工合成中被用作氨基保护剂。★丹磺酰氯(DNScl二甲基氨基萘磺酰氯)常用于多肽链NH末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。NGlyAlaSerLeuPheC→→DNSGlyAlaSerLeuPheC水解DNSGly、Ala、Ser、Leu、PheDNSAA在紫外光激发后发黄色荧光。、  烷基化反应α氨基中的氮是一个亲核中心能发生亲核取代反应。★Sanger反应 一二硝基氟苯(DNFB)DNP氨基酸黄色层析法鉴定被Sanger用来测定多肽的NH末端氨基酸★Edman反应苯异硫氰酸酯PITC 苯乙内酰硫脲衍生物(PTH氨基酸)无色可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH末端氨基酸、生成西佛碱的反应(Schiff)西佛碱是某些酶促反应的中间产物(如转氨基反应的中间产物)。、脱氨基反应(二) α羧基参加的反应①成盐、成酯反应P ②成酰氯的反应P氨基被保护后羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应生成酰氯使羧基活化在多肽的人工合成中常用。  、叠氮反应P活化羧基可用于肽的人工合成、脱羧基反应PGlu脱羧形成γ氨基丁酸(三)αNH和αCOOH共同参加的反应、  与茚三酮反应茚三酮在弱酸中与α氨基酸共热引起氨基酸的氧化脱氨脱羧反应最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应生成紫色物质(λmax=nm)。Pro、HyPro与直接形成黄色化合物(λmax=nm)、成肽反应(四) 侧链R基参加的反应用于蛋白质的化学修饰(一)基于电荷性质差异的分离方法六、 氨基酸的分离和分析、  电泳分离电泳的基本原理 Glu、Leu、His、Lys种混合样在pH时泳动方向及相对速度:GluLeuHisLyspI 、  离子交换柱层析P磺酸型阳离子交换树脂氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用(二)基于分配系数(极性)差异的分离方法分配层析、纸层析P★在流动相中分配系数越大移动越快。固定相:吸附水流动相:丁醇、醋酸、水分配系数★基本步骤:点样、展层、现色、定性(定量)、薄层层析P★支持剂:纤维素粉、硅胶、氧化铝粉★基本步骤:铺板、点样、展层、现色、定性(定量)、分配柱层析支持剂:纤维素、淀粉、硅胶固定相:吸附水流动相苯酚、正丁醇固定相:涂有薄层液体的惰性颗粒流动相:H、N、CO★前提:样品能汽化、热稳定(三)气液层析(气相层析、气相色谱)P分配层析、离子交换层析吸附层析凝胶过滤层析(四)高效液相层析(HPLC)P第三节    蛋白质的一级结构(共价结构)一、 蛋白质结构层次一级结构(共价结构):蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)二级结构:多肽主链中各个肽段借助于相邻氨基酸之间的氢键形成的构象。主要有α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲。超二级结构:由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。结构域:大的球蛋白分子中多肽链形成几个紧密的球状构象彼此以松散的肽链相连此球状构象是结构域结构域是多肽链的独立折叠单位一般由个氨基酸残基构成。三级结构:整条多肽链或亚基通过盘旋、折叠形成紧密的、借各种次级键维持的球状构象。四级结构:寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。单链蛋白质只有一、二、三级结构无四级结构。二、 肽和肽键的结构肽:一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。肽键:氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键(酰氨键)肽单位:酰胺平面肽单位间以αC原子相隔构成肽链P肽 名称:丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸写法:NSerGlyTryAlaLeu或SGYAL★肽键的结构特点:()酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。()肽键具有部分双键性质不能自由旋转。()肽键具有平面性组成肽键的个原子和个Cα几乎处在同一平面内(酰氨平面)。()肽键亚氨基在pH内不解离。()肽链中的肽键一般是反式构型而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型.★多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个酰胺平面组成P图Pro形成的肽链三、 肽的重要性质、  旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。、  肽的酸碱性质短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。肽的酸碱性质主要取决于N端α-NH2和C端α-COOH以及侧链R上可解离的基团。在长肽或蛋白质中可解离的基团主要是侧链基团。pH优势离子的净电荷:<>等电点:Pi=()=问题:求出二肽LysLys及三肽LysLysLys的pI值。  问题:把一个氨基酸结晶加入pH的纯水中得到pH的溶液此氨基酸的pI值是大于?小于还是等于?(小于)、  肽的化学反应肽的α羧基α氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。★双缩脲反应凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应游离氨基酸无此反应。四、 天然存在的活性肽、  谷胱甘肽GluCysGly红细胞中的巯基缓冲剂。参与氧化还原过程清除内源性过氧化物和自由基维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。GSHGSSG HOGSHHOGSSG、  短杆菌肽(抗生素)由短杆菌产生的肽环。抗革兰氏阳性细菌临床用于治疗化浓性病症。 LOrnLLeuDPheLProLValLOrnLLeuDPheLProLVal、  脑啡肽(肽)Met脑啡肽:TyrGlyGlyPheMetLeu脑啡肽:TyrGlyGlyPheLeu具有镇痛作用。 生物体内寡肽的来源:①合成蛋白质的剪切、修饰②酶专一性逐步合成(如谷胱甘肽)、③动物肠道可吸收寡肽、肽类激素★噬菌体表面展示技术与随机多肽库的应用:靶功能筛选多肽药物研究大分子之间的相互作用五、蛋白质一级结构测定(一)蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质理想方法是从N端直接测至C端但目前只能测个N端氨基酸。、  直接法(测蛋白质的序列)两种以上特异性裂解法NCA法裂解AAAAB法裂解BBBB 、  间接法(测核酸序列推断氨基酸序列)(二)  蛋白质测序的一般步骤P()   测定蛋白质分子中多肽链的数目()   拆分蛋白质分子中的多肽链。()   断裂链内二硫键。()分析多肽链的N末端和C末端。()   测定多肽链的氨基酸组成。()   多肽链部分裂解成肽段。()   测定各个肽段的氨基酸顺序()   确定肽段在多肽链中的顺序。()   确定多肽链中二硫键的位置。(三)测序前的准备工作、  蛋白质的纯度鉴定纯度以上均一。⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNScl(二甲氨基萘磺酰氯)法测N端氨基酸、测定分子量估算氨基酸残基数确定肽链数SDSPAGE凝胶过滤法沉降系数法、  确定亚基种类及数目根据分子量和N末端数SDSPAGE、拆分多肽链并分别分离纯化⑴非共价键结合:molL尿素SDSPAGE⑵二硫键结合:过甲酸氧化:SSHCOOOH→SOHβ巯基乙醇还原、  测定氨基酸组成酸水解的同时辅以碱水解。确定肽链中各种aa出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。、  端基分析①N端分析★DNScl法:最常用黄色荧光灵敏度极高DNS多肽水解后的DNS氨基酸不需要提取。★DNFB法:Sanger试剂DNP多肽酸水解黄色DNP氨基酸有机溶剂(乙酸乙酯)抽提分离纸层析、薄层层析、液相等★PITC法:Edman法逐步切下。无色PTH氨基酸有机溶剂抽提层析。②C端分析★肼解法无水肼NHNH℃h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼C端游离氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。★羧肽酶法(Pro不能测)羧肽酶A:除Pro、Arg、Lys外的所有C端aa羧肽酶B:只水解Arg、LysNHN……………ValSerGlyC图P羧肽酶法测C末端(四)肽链的部分裂解和肽段的分离纯化、  化学裂解法①溴化氰MetX产率②亚碘酰基苯甲酸TrpX产率③NTCB(硝基硫氰苯甲酸)XCys④羟胺NHOHAsnGly约个氨基酸出现一次、  酶法裂解①胰蛋白酶LysX(X≠Pro)ArgX ②胰凝乳蛋白酶TyrX(X≠Pro)TrpXPheX胃蛋白酶Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu)③Glu蛋白酶GluX(Vs蛋白酶)④Arg蛋白酶ArgX⑤Lys蛋白酶XLys⑥Pro蛋白酶ProX、  肽段的分离纯化①电泳法SDS-PAGE根据分子量大小分离②离子交换层析法(DEAECellulose、DEAESephadex)根据肽段的电荷特性分离③反相HPLC法根据肽段的极性分离④凝胶过滤要求:SDS-PAGE单带HPLC单峰N端单一(常用DNS-cl法)(五)      肽段序列测定及肽链的拼接、  Edman法()耦联PITC+H2NABCDpH℃PTCABCD()裂解无水三氟乙酸(TFA)ATZAHNBCD()转化PTHA PTC肽:苯氨基硫甲酰肽ATZ:噻唑啉酮苯胺(一氨基酸)PTH:苯乙内酰硫脲(一氨基酸) 、  DNSEdman法用DNS法测N末端用Edman法提供(n)肽段。、  有色Edman法荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。N、N二甲基氨基偶氮苯’异硫氰酸酯。、  用自动序列分析仪测序仪器原理:Edman法。液相测序仪自旋反应器适于大肽段。固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球可耦连肽段的C端。气相测序仪用Polybrene反应器。(聚阳离子)四级铵盐聚合物液相:nmol肽气相:pmol肽、  肽段拼接成肽链肽N端HC端SA法裂解:ONSPSEOVERLAHOWTB法裂解:SEOWTONVERLAPSHO重叠法确定序列:HOWTONSEOVERLAPS(六)二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定、  二硫键的确定(对角线电泳法)碘乙酰胺封闭SH胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化SS生成SOH第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽测序与拼接出的肽链比较定出二硫键的位置。、  酰胺的确定Asp–Asn、GluGln酶解肽链产生含单个Asx或Glx的肽用电泳法确定是Asp还是Asn举例:LeuGlxProVal肽在pH=时电荷量是LeuProVal此肽除Glx外净电荷为可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。、  糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接N糖苷糖苷脂类:Ser、Thr、Cys磷酸:Ser、Thr、His经验性序列:Lys(Arg)SerAsnSer(PO)ArgThrLeuSer(PO)Lys(Arg)–AlaSer(PO)六、 蛋白质的一级结构与生物功能(一)   蛋白质的一级结构决定高级结构和功能★牛胰RNase变性一复性实验:个aa残基个链内二硫键。 分子量: (M尿素β硫基乙醇)变性、失活→透析后构象恢复活性恢复以上而二硫键正确复性的概率是。(二)同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质:在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如:血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。同源蛋白质的特点:①同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性(序列同源性)②有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的称不变残基不变残基高度保守是必需的。除不变残基以外其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化称可变残基可变残基中个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。③多肽链长度相同或相近通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。亲源关系越远同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。、  细胞色素CP  分子量:左右氨基酸残基:个左右单链。种生物中细胞色素C的不变残基个。种生物中细胞色素C的不变残基个。亲源关系越近的其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的其细胞色素C的差异越大。人与黑猩猩人与猴人与狗人与酵母、胰岛素●有个氨基酸残基位置始终不变:A.B链上个Cys不变其余个氨基酸多数为非极性侧链对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。●其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大但对免疫反应起作用。●猪与人接近而狗则与人不同因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。(三)蛋白质一级结构的突变分子病分子病:基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变功能部分或全部丧失。镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的链第位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val 正常人血红蛋白βNGlu镰刀型贫血βNVal生理条件下电荷:GluVa亲水疏水(四)一级结构的部分切除与蛋白质的激活、  血液凝固的机理凝血因子(凝血酶原致活因子) 凝血酶原凝血酶纤维蛋白原A纤维蛋白B凝胶()、凝血酶原P图在凝血酶原致活因子催化下凝血酶原分子中的ArgThr、ArgIle断裂释放出个aa产生活性凝血酶。A链aaB链aa()、纤维蛋白原 P图αβr 从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键ArgGly释放出二个纤维肽A(个氨基酸)和二个纤维肽B(个氨基酸)它们含有较多的酸性氨基酸残基。 A、B肽切除后减少了蛋白质分子的负电荷促进分子间聚集形成网状结构。 在凝血因子XIIIa(纤维蛋白稳定因子)催化下纤维蛋白质单体间形成共价健(GlnLys结合)生成交联的纤维蛋白。P上、  胰岛素原的激活P图 ※ 前胰岛素原含信号肽。※ 胰岛素原内质网腔信号肽被信号肽酶切除。※ 活性胰岛素高尔基体切除C肽。七、 多肽与蛋白质的人工合成P氨基保护:叔丁氧甲酰氯(BOCCl)、苄氧酰氯(CBZCl)、对甲苯磺酰氯TosylCl)。羧基保护:苄酯、叔丁酯(成盐、成酯)羧基活化:酰氯法(PCL)、叠氮法、混合酸酐法、活化酯法。缩合剂:DCCI(二环己基碳二亚胺)直接接肽★多肽的固相合成支持介质:聚苯乙烯树脂 合成方向:C端→N端。合成程序:挂接→去保护→中和→缩合→断裂与去保护第四节蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质第四节蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质一、 多肽主链折叠的空间限制从理论上讲一个多肽主链能有无限多种构象。但是只有一种或很少几种天然构象且相当稳定。因为:天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转、  肽链的二面角★只有α碳原子连接的两个键(CαN和CαC)是单键能自由旋转。 ★环绕CαN键旋转的角度为Φ 环绕CαC键旋转的角度称Ψ★当Φ(Ψ)旋转键两侧的主链呈顺式时规定Φ(Ψ)=° ★从Cα沿键轴方向看顺时针旋转的Φ(Ψ)角为正值反之为负值。 、  拉氏构象图:可允许的Φ和Ψ值Φ和Ψ同时为的构象实际不存在二面角(Φ、Ψ)所决定的构象能否存在主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和ΨP表蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。◆ 拉氏构象图:Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离确定了哪些成对二面角(Φ、Ψ)所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的哪些是不允许的并且以Φ为横坐标以Ψ为纵坐标在坐标图上标出该坐标图称拉氏构象图。⑴实线封闭区域一般允许区非键合原子间的距离大于一般允许距离此区域内任何二面角确定的构象都是允许的且构象稳定。⑵虚线封闭区域是最大允许区非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间立体化学允许但构象不够稳定。⑶虚线外区域是不允许区该区域内任何二面角确定的肽链构象都是不允许的此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离斥力大构象极不稳定。对非Gly氨基酸残基一般允许区占全平面的最大允许区占全平面%二、 二级结构的基本类型、  α螺旋()、  α螺旋的一般特征:★多肽主链按右手或左手方向盘绕形成右手螺旋或左手螺旋★相邻的螺圈之间形成链内氢键★构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。典型的α螺旋有如下特征:①二面角:Φ=°,Ψ=°是一种右手螺旋②每圈螺旋:个aa残基高度:nm③每个残基绕轴旋转°沿轴上升nm④氨基酸残基侧链向外⑤相邻螺圈之间形成链内氢链氢键的取向几乎与中心轴平行。⑥肽键上C=O氧与它后面(C端)第四个残基上的NH氢间形成氢键。典型的α螺旋用表示表示每圈螺旋包括个残基表示氢键封闭的环包括个原子。 封闭环原子数=n(n=、、)(n:后边第n个aa)螺旋(n=)螺旋(n=)螺旋(n=)螺旋(n=)n=n=n=n=()、  R侧链对α螺旋的影响①多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys或Asp或Glu)不能形成稳定的α螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。②Gly在肽中连续存在时不易形成α螺旋。③R基大(如Ile)不易形成α螺旋④Pro、脯氨酸中止α螺旋。⑤R基较小且不带电荷的氨基酸利于α螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH的水溶液中自发卷曲成α螺旋。()、  pH对α螺旋的影响()、  右手α螺旋与左手α螺旋右手螺旋比左手螺旋稳定。蛋白质中的α螺旋几乎都是右手但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α螺旋由AspAsnGlyGly()组成(φ°、Ψ°)。()、  α螺旋结构的旋光性α螺旋结构是一种不对称的分子结构:()α碳原子的不对称性()构象本身的不对称性。天然α螺旋能引起偏振光右旋α螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。、  β折叠 两条或多条几乎完全伸展的多肽链(或同一肽链的不同肽段)侧向聚集在一起相邻肽链主链上的NH和C=之间形成氢链这样的多肽构象就是β折叠片。()氢键与肽链的长轴接近垂直。()多肽主链呈锯齿状折叠构象()侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。平行式:所有参与β折叠的肽链的N端在同一方向。反平行式:肽链的极性一顺一倒N端间隔相同反平β折叠比平行的更稳定、  β转角(βturn)也称β回折(reverseturn)、β弯曲(βbend)球状蛋白质分子中出现的°回折由第一个aa残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH间形成氢键。 β转角的特征:①由多肽链上个连续的氨基酸残基组成。②主链骨架以°返回折叠。③第一个aa残基的C=O与第四个aa残基的NH生成氢键④Cα与Cα之间距离小于nm⑤多数由亲水氨基酸残基组成。、  无规卷曲没有规律的多肽链主链骨架构象。往往与生物活性有关α螺旋β转角β折叠在拉氏图上有固定位置而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。三、 超二级结构由若干个相邻的二级结构单元(α螺旋、β折叠、β转角及无规卷曲)组合在一起彼此相互作用形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。、  复绕α螺旋(αα结构)由两股或三股右手α螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。存在于α角蛋白肌球蛋白原肌球蛋白和纤维蛋白原中。、  βxβ结构两段平行式的β折叠通过一段连接链(x结构)连接而形成的超二级结构。①βcβx为无规卷曲②βαβx为α螺旋最常见的是βαβαβ称Rossmann折叠存在于苹果酸脱氢酶乳酸脱氢酶中。、  β曲折(βmeander)由三条(以上)相邻的反平行式的β折叠链通过紧凑的β转角连接而形成的超二级结构。 、  回形拓扑结构(希腊钥匙)、  β折叠桶由多条β折叠股构成的β折叠层卷成一个筒状结构筒上β折叠可以是平行的或反平行的一般由条β折叠股组成。超氧化物歧化酶的β折叠筒由条β折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。、  α螺旋β转角α螺旋两个α螺旋通过一个β转角连接在一起。λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构四、 纤维状蛋白质含大量的α螺旋β折叠片整个分子呈纤维状广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内起支架和保护作用。、  角蛋白源于外胚层细胞包括皮肤及皮肤的衍生物(发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝)。α角蛋白β角蛋白。()、  α角蛋白(毛发)主要由α螺旋结构组成三股右手α螺旋向左缠绕形成原纤维原纤维排列成“”的电缆式结构称微纤维成百根微纤维结合成大纤微。()、β角蛋白(丝心蛋白)以β折叠结构为主。片层结构:反平行式β折叠片以平行的方式堆积。链间主要以氢键连接层间主要靠范德华力维系。、  胶原蛋白、  弹性蛋白、  肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白第六节 结构域、三级结构与球状蛋白质第六节 结构域、三级结构与球状蛋白质一、 结构域domainmotif(模块)在二级结构及超二级结构的基础上多肽链进一步卷曲折叠组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。结构域一般有100-200氨基酸残基。结构域之间常常有一段柔性的肽段相连形成所谓的铰链区使结构域之间可以发生相对移动。结构域承担一定的生物学功能几个结构域协同作用可体现出蛋白质的总体功能。例如脱氢酶类的多肽主链有两个结构域一个为NAD结合结构域一个是起催化作用的结构域两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。结构域间的裂缝常是酶的活性部位也是反应物的出入口★EF手:钙结合蛋白中含有HelixLoopLelix结构★锌指:DNA结合蛋白中个His、个Cys结合一个Zn★亮氨酸拉链:DNA结合蛋白中由亮氨酸倒链形成的拉链式结构二、三级结构:●整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠形成的特定的整个空间结构。●三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。、  三级结构有以下特点:许多在一级结构上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。球形蛋白的三级结构很密实大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。大的球形蛋白(aa以上)常常含有几个结构域、  维持三级结构的作用力:()氢键()范德华力(分子间及基团间作用力):定向效应:极性基团间诱导效应:极性与非极性基团间分散效应:非极性基团间()疏水相互作用()离子键(盐键)()共价健主要的是二硫键二硫键不指导多肽链的折叠三级结构形成后二硫键可稳定此构象。四、球状蛋白质三维结构特征P、含有丰富的二级结构元件、具有明显的折叠层次、分子呈现球状或椭球状、疏水侧链埋藏在分子内部亲水侧链暴露在外表、表面常常有空穴配体结合部位(活性中心)第六节、亚基缔合与四级结构 P一、有关四级结构的一些概念、亚基与单体、单体蛋白质、原体(protomer)☆有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成这种等同的结构成分称为原体。如血红蛋白αβ就是由两个原体αβ组成。有时也把原体称为单体。二、四级结构缔合的驱动力疏水作用极性基团之间的氢键和离子键二硫桥三、亚基之间的缔合方式、同多聚与杂多聚(homomultimericandheteromultimeric)、同种缔合与异种缔合(isologusandheterologus)同种缔合:亚基间相互作用的表面是相同的形成的结构是对称的P异种缔合:亚基间相互作用的表面是不同的形成线形或螺旋形的高聚物如微管病毒外壳。四、四级缔合在结构和功能上的优越性、降低比表面积增加蛋白质的稳定性、丰富蛋白质的结构以行使更复杂的功能。、提高基因编码的效率和经济性。、使酶的催化基团汇集提高催化效率。、形成一定的几何形状如细菌鞭毛。、适当降低溶液渗透压。、具有协同效应和别构效应实现对酶活性的调节五、 寡聚蛋白与别构效应★别构蛋白:除了有活性部位(结合底物)外还有别构部位(结合调节物)。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基(活性亚基和调节亚基)活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。★别构效应:别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象从而对活性部位产生的影响。★同促效应(同位效应):一种配体的的结合对于其它部位结合同种配体的能力的影响包括(正)协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础别构效应可以看成`是对同位效应的一种修饰★异促效应(异位效应):就是别构效应别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。★正协同效性:一种配基的结合促进后续配基的结合S型配体结合曲线。★负协同效性:一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。★正效应物:促进活性部位与配基结合的别构效应物。★负效应物:抑制活性部位与配基结合的别构效应物。第七节蛋白质结构与功能的关系第七节蛋白质结构与功能的关系一、   肌红蛋白的结构与功能:、  肌红蛋白的三级结构哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。由一条多肽链(珠蛋白)和一个血红素辅基组成。球状分子单结构域。  段直的α螺旋组成分别命名为A、B、C…H拐弯处是由~个氨基酸组成的松散肽段(无规卷曲)。个Pro残基各自处在一个拐弯处另外个是Ser、Thr、Asn、Ile。 血红素辅基扁平状结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。 p、  肌红蛋白的氧合曲线解离平衡常数:氧饱和度:Y=时肌红蛋白的一半被饱和PO=K=P=torr解离常数K也称为P即肌红蛋白一半被饱和时的氧压。、  Hill曲线和Hill系数 P图Hill曲线LogY(Y)=时的斜率称Hill系数(nH)表示配体结合部位之间在结合配体时的同促效应。肌红蛋白的nH=二   血红蛋白的结构与功能在血液中结合并转运O、  血红蛋白的结构:成人:HbA:αβHbA:αδ胎儿:HbFαγ早期胚胎:αε▲接近于球体个亚基分别在四面体的四个角上每个亚基上有一个血红素辅基。▲α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似、血红蛋白的氧合曲线四个亚基之间具有正协同效应因此它的氧合曲线是S型曲线血红蛋白P=torr肺泡氧压:Po=torrY=肌肉毛细血管:Po=torrY=释放氧:△Y==肌红蛋白(无协同效应):△Y不足协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量使它能有效地输送氧气。nH=,无协同性nH>,正协同性nH<,负协同性、  波耳效应及其生理意义血红蛋白上有CO和BPG结合部位因此血红蛋白还能运输CO。波耳效应:增加CO的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应降低血红蛋白对O的亲和力促进O的释放反之高浓度的O也

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