复合菌在饲料发酵中的初步研究

2010年第 12期 饲料博览·技术版 武汉: 华中农业大学, 2005． [ 5 ] 张璐, 艾庆辉, 麦康森, 等． 植酸酶和非淀粉多糖酶对鲈鱼生长 和消化酶活性的影响[J]． 水生生物学报, 2009, 33（1）: 82-88． [ 6 ] 高春生, 刘忠虎, 肖传斌. 木聚糖酶对草鱼生长性能和消化率 的影响[J]. 饲料研究, 2006（8）: 48-49. [ 7 ] 王纪亭, 万文菊, 康明江, 等． 复合酶制剂对草鱼生长性能、饲 料养分消化率及免疫力的影响[J]． 大连水产学院学报, 2009, 24（5）: 417-422． [ 8 ] 乌兰, 齐景伟, 谢骏． 耐高温酶制剂对奥尼罗非鱼生长和消化 酶活性的影响[J]． 水产科学, 2009, 28（10）: 579-582． 微生物发酵饲料是利用微生物的新陈代谢和繁 殖菌体来生产和调制的饲料，其主要通过微生物的 发酵作用改变饲料的理化性状，增加适口性及营养 价值，提高消化利用率[ 1 ]。在生猪养殖过程中使用 发酵饲料，使全程饲料转化效率（饲料/增重）由 3.6 降至 3.3，价格比普通猪肉高 10%～20%。在不增加 饲养成本的条件下，在猪用配合饲料中添加微生物 发酵饲料 15%～25%就可以实现从 20 kg 至出栏的 无抗生素饲养[ 2 ]。现在市场上有很多以有效微生物 菌群（EM）进行饲料的发酵，虽然都得到了很好的 使用效果，但是 EM中 80多种细菌的安全性存在 质疑，有些菌种并不包括在农业部 1126 号文件 中。本研究通过有益微生物发酵饲料技术检测饲料 成分与微生物菌群的变化。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 发酵菌 地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母均由上 海创博饲料科技有限公司自行分离保存。发酵饲料 含玉米粉 63%、豆粕粉 28%、小麦粉 5%、次粉 2%、糖蜜 2%。试验组饲粮以水 430 g+饲料 1 000 g 的比例配制。发酵菌（地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、 酿酒酵母）最终接种量为 1×106 cfu·g－1，将混合好 的饲料装入自封袋的铝箔袋中，排气压紧，密封袋 口。对照组发酵饲料、水、饲料的配比均与试验组 相同。试验组与对照组都置于恒温培养箱中进行厌 氧发酵。 1.2 发酵饲料 取试验组和对照组饲料各 3 袋，分别于 0、1、 2、3、5、7、10、14 d 进行地衣芽孢杆菌、乳酸 杆菌、啤酒酵母菌的活菌数以及纤维酶活力、蛋白 酶活力和 pH 的测定。地衣芽孢杆菌按行业标准 NY/T 1461-2007 进行测定；乳酸菌测定按国家标 准 GB/T4789.35-2010 进行测定；啤酒酵母测定按 国家标准 GB/T4789.15-2010 进行测定；纤维素酶 活力的测定按行业标准 NY/T 912-2004进行测定； 蛋白酶活力测定按行业标准 SB/T 10317-1999进行 测定；酸度检测采用雷磁 HS-3C 酸度计测定。 1.3 小分子肽含量的测定 发酵样品的小分子肽含量的测定采用双缩法。 将发酵饲料与蒸馏水 1： 8（m/v）稀释，超声 30 min， 复合菌在饲料发酵中的初步研究 收稿日期：2010-09-06 基金项目：上海市富民 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 项目（09dz1913400） 作者简介：张玉辉（1979—），男，上海人，高级实验师，主 要从事微生物发酵工程的研究工作。 张玉辉，王戌晋，张仁数，张小峰，江 翰 （上海创博饲料科技有限公司，上海 201101） 摘 要：分别接种地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母 1.0×106 cfu·g－1，对饲料进行厌氧发酵 5 d，第 5天 地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母分别为 1.26×108、1.59×107和 7.94×108 cfu·g－1，pH 4.52，纤维素酶和蛋白 酶酶活力为 22.4 U·g－1和 224 U·g－1，小肽含量为 9.8 mg·L－1，总氨基酸含量提高了 12.69%。 关键词：复合菌；发酵饲料；地衣芽孢杆菌；植物乳杆菌；酿酒酵母 中图分类号：S816.6；Q939.11+7 文献标志码：A 文章编号：1001－0084（2010）12－0023－04 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 添加剂世界 23 苍南县金坝包装工艺品厂 产品：菌种包装袋 苍南县金坝包装工艺品厂专业生产菌种包装袋，菌种包装袋专门 应用于微生物、菌种产品的包装，本包装袋与传统包装袋相比具有以 下优点： 1. 完美解决微生物包装中菌种排气导致的包装袋涨袋、进而导致包 装破裂的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。应用本包装袋可以解决发酵生产、菌种包装过程 中气体控制的难题，同时也保证了微生态产品包装的长期储运。 2. 通过包装袋中单向排气装置确保微生物的生命活动中产生的气体 不断排出袋外，保持袋内气体压强的相对稳定，同时不让外界气 体进入，保持袋内的无氧状态，保证了微生物的活性。 3. 本包装袋综合厌氧发酵和好氧发酵的优点用于解决一些菌群难以 共处的难题（例如微生物组合发酵），包装袋独有厌氧控制很好的 应用于固态厌氧等发酵方式。 4. 通过本包装袋可以解决发酵散热、杂菌污染等普通包装袋难以解 决的难题，广泛应用于无抗发酵饲料、生物发酵饲料、生物饲料 添加剂、em菌发酵的包装。 苍南县金坝包装工艺品厂专业致力于印刷、包装、复合材料 于一体的生产 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 企业，为客户提供各种软包装及复合包装袋的 印刷及制袋，为降低客户印刷包装品的成本而努力，欢迎新老客 户前来联系。 公司网站：http://wyjxtx.cn.alibaba.com 饲料博览·技术版 2010年第 12期 充分溶解，4 000 rpm离心 10 min，取上清 5 mL， 加入等量的 75%乙醇（pH 8.0）沉淀 2 h，4 000 rpm 离心 5 min，取上清液进行小分子肽含量测定[ 3 ]。 1.4 蛋白质 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶制备采用分离胶和浓缩胶组成的凝胶板。 上层为浓缩胶，含丙烯酰胺胶 5%；下层为分离胶， 含丙烯酰胺胶 15.0%。吸取离心的样品 20 μL，加 等量的 2×溴酚蓝上样液，混匀，水煮 5 min冷却 离心，移液枪吸取上清液 20 μL 加于凝胶凹槽中。 分别在电泳槽中注入 Tris-甘氨酸缓冲液，控制电 泳电压 110 V ，电泳约 2.0 h ，电泳胶用1%考马 斯亮蓝染色 2.0 h，乙醇-冰醋酸脱色[ 4 ]。 2 结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2.1 发酵时间对有益菌数量的影响 发酵时间对有益菌数的影响见图 1~2。 由图 1~2 可见，地衣芽孢杆菌和啤酒酵母在 发酵第 3 天菌数最高，分别为 1.58×108 cfu·g－1和 1.59×107 cfu·g－1，植物乳杆菌在发酵第 5天菌数达 到 7.94×108 cfu·g－1。对照组乳酸菌和酵母菌在第 5 天分别为 2.09×107 cfu·g－1和 1.60×106 cfu·g－1。因为 发酵没有灭菌，杂菌也随之生长，但是随着有益菌 大量生长，杂菌数量从发酵第 1天的 1.60×106 cfu·g－1 降低到第 14天的 1.26×104 cfu·g－1。啤酒酵母是好 氧菌，在厌氧条件下生长比较缓慢，地衣芽孢杆菌 和植物乳杆菌都是兼氧菌，在厌氧条件下活菌总数 比较高。 2.2 发酵时间对发酵 pH的影响 发酵时间对发酵 pH 的影响见图 3。 由图 3可见，厌氧发酵随着乳酸菌的生长，产 生大量乳酸和有机酸，pH也随之降低，到第 14天 对照组和试验组 pH分别为 4.85、3.86。pH的降低 也能有效抑制杂菌的生长，发酵饲料能长期保存。 2.3 发酵时间对纤维素酶活力的影响 发酵时间对纤维素酶活力的影响见图 4。 由图 4可见，随着有益菌的大量繁殖，纤维素 酶活力也随之增加，试验组在发酵第 5天酶活力达 到 22.4 U·g－1，对照组为 3.6 U·g－1。随着发酵时间 图 1 发酵时间对对照组有益菌数量的影响 活 菌 数 /lo g 试验组活菌量 地衣芽孢杆菌 植物乳杆菌 酿酒酵母 杂菌 发酵时间/d 图 2 发酵时间对试验组有益菌数量的影响 0 1 3 5 7 10 14 活 菌 数 /lo g 10 9 8 7 6 5 4 对照组活菌量 发酵时间/d 0 1 3 5 7 10 14 10 9 8 7 6 5 4 杂菌 乳酸菌 酵母 图 3 发酵时间对发酵 pH的影响 图 4 发酵时间对纤维素酶活力的影响 pH 发酵时间/d 0 1 3 5 7 10 14 7 6.5 6 5.5 5 4.5 4 3.5 3 对照组 试验组 发酵时间/d 0 1 3 5 7 10 14 25 20 15 10 5 0 对照组 试验组 纤 维 素 酶 酶 活 力 /U · g－ 1 添加剂世界 24 2010年第 12期 饲料博览·技术版 的延长，纤维素酶酶活力有所下降，到第 14天时 纤维素酶酶活为 19.6 U·g－1。 2.4 发酵时间对蛋白酶活力的影响 发酵时间对蛋白酶活力的影响见图 5。 由图 5可见，地衣芽孢杆菌的蛋白酶活力比较 高，在发酵第 5天试验组蛋白酶活力达到 224 U·g－1， 对照组在发酵第 7天蛋白酶活力为 45 U·g－1。随着 发酵时间的延长，试验组蛋白酶活力降低，到第 10 天蛋白酶活力为 178 U·g－1，到第 14天又上升到 195 U·g－1。 2.5 发酵时间对小分子肽的影响 发酵时间对小分子肽的影响见图 6。 由图 6可见，随着发酵时间的延长，小肽含量 也逐步提高，发酵第 14天时试验组的小肽含量达 到 14.1 mg·g－1，对照组为 7.9 mg·g－1，蛋白酶的活 力直接影响小肽的含量。 发酵第 5天蛋白电泳结果见图 7，氨基酸变化 见附表。 由图 7可见，试验组的可溶性蛋白明显高于对 照组，特别是分子量约为 20 K的蛋白明显较多， 在 7.8 K处也有大量小肽。 由附表可见，经过 5 d的复合菌厌氧发酵，17 种不同的氨基酸有不同程度的提高，特别是谷氨 酸、丙氨酸、亮氨酸和精氨酸分别提高了 31.0%、 12.0%、7.3%、16.2%，总氨基酸的含量提高了 12.69%。 A M CK B A—未发酵饲料，M—Marker条带，CK—对照组，B—试验组 附表 发酵第 5天氨基酸的变化 图 7 发酵第 5天蛋白电泳图 20.1K 14.4K 7.8K 项 目 空白（未发酵） 对照组 试验组 天冬氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸 甘氨酸 丙氨酸 胱氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 组氨酸 赖氨酸 精氨酸 脯氨酸 总氨基酸 3.563 1.198 2.018 5.470 1.557 1.742 0.282 1.821 0.227 1.391 2.789 0.686 1.918 1.366 1.936 1.909 0.873 30.744 3.661 1.201 2.020 5.475 1.560 1.748 0.293 1.811 0.227 1.390 2.786 0.616 1.918 1.373 1.979 1.909 0.903 30.868 3.801 1.325 2.356 7.165 1.623 1.951 0.327 1.897 0.235 1.416 2.993 0.696 2.416 1.282 2.001 2.219 0.942 34.645 图 5 发酵时间对蛋白酶活力的影响 发酵时间/d 0 1 3 5 7 10 14 250 200 150 100 50 0 对照组 试验组 蛋 白 酶 酶 活 力 /U · g－ 1 图 6 发酵时间对小分子肽的影响 发酵时间/d 0 1 3 5 7 10 14 15 10 5 0 对照组 试验组 小 肽 含 量 /m g· L－ 1 添加剂世界 25 饲料博览·技术版 2010年第 12期 3 讨论和结论 益生菌是一种安全、稳定且高效的动物肠道微 生态调节剂，长期使用能够增强动物免疫力和抗应 激能力，减少疾病发生、淘汰率、抗生素使用，并 能显著提高饲料效率，改善养殖环境，有效地保障 畜禽产品的食用安全性，提高养殖的经济效益[ 5-6 ]。 饲料中添加益生菌能有效降低抗生素的残留，植物 乳酸杆菌添加到饲料中，可以抑制饲料中寄生曲霉 孢子的活性，从而抑制寄生曲霉的生长以及 AFB1 的产生[ 7-8 ]。因此，进行饲料复合厌氧发酵，可以 利用菌种的协同作用，有效降低饲料 pH，增加纤 维素酶和蛋白酶活力、小肽以及氨基酸含量。正常 情况下，动物体内的有益菌及有害菌处于相对平衡 状态。如果有害菌群侵入或大量繁殖，这种平衡状 态就会打破，动物健康会受到影响。酸性环境有利 于有益菌生长，而不利于有害菌生长。酸性发酵饲 料可以人为改善动物肠道环境，使其处于偏酸性状 态，为有益菌创造适宜的生存环境，同时抑制有害 菌群侵入和繁殖，降低动物腹泻等疾病的发生机 率。动物肠道中的微生物可以降解部分纤维素外， 单胃动物不能分泌断裂 β-1, 4 糖苷键的内源酶， 所以饲料中含有的纤维素对其而言几乎不具有营养 价值。由于纤维素的交铅、缠绕和黏附，阻碍营养 物质的消化和吸收，影响肠道微生物菌群的平衡， 单胃动物日粮中添加纤维素酶具有营养和保健的双 重功效。小肽能完整地被吸收并以二、三肽形式进 入血液循环，在蛋白质营养中有着重要的作用[ 9-10 ]。 接种地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母 1.0×106 cfu·g－1 的饲料，厌氧发酵 5 d，在第 5天， 地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母含量分别为 1.26×108、1.59×107、7.94×108 cfu·g－1，pH 为 4.52， 纤维素酶和蛋白酶酶活力为 22.4和 224 U·g－1，小 肽含量为 9.8 mg·L -1，总氨基酸含量提高了 12.69%。有益菌发酵饲料产品有利于提高饲料利 用率，安全性提高，其作为新型的饲料产品将具有 广阔的应用前景。 [ 参 考 文 献 ] [ 1 ] 饶辉. 国内外微生物发酵饲料的研究进展[J]. 湖南饲料, 2009 （2）: 31-33. 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" 《饲料博览》杂志技术版主要栏目设有：试验研究、综述、问题探讨、动物营养、工 艺与设备、疾病防治、饲养管理、品质控制、分析检测、添加剂世界、水产养殖、资 源开发等。管理版主要栏目设有：本期聚焦、观察与思考、经营策略、管理纵横、营 销天地、企业文化、行业动态、职场生涯、市场分析等栏目。 《饲料博览》技术版———饲料科技人员的首选 《饲料博览》管理版———企业管理者、经营者的伙伴 欢迎投稿 欢迎订阅 添加剂世界 26