冻干辐照对猪腹膜体外稳定性的影响

中国组织工程研究与临床康复 第 13 卷 第 8 期 2009–02–19 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research February 19, 2009 Vol.13, No.8 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 1459 Burn Center, First Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China Zhang You-lai★, Studying for master’s degree, Burn Center, First Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China youlaizhang@ yahoo.cn Correspondence to: Zeng Yuan-lin, Professor, Chief physician, Burn Center, First Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China Received: 2008-06-18 Accepted: 2008-08-27 冻干辐照对猪腹膜体外稳定性的影响★ 张友来，曾元临，辛国华，何 勇 Freeze-drying and irradiation effects on stability of the porcine peritoneum in vitro Zhang You-lai, Zeng Yuan-lin, Xin Guo-hua, He Yong Abstract BACKGROUND: Collagen membrane following 60Co γ ray germicidal treatment can promote the crosslinking of collagen molecule and affect its stability. OBJECTIVE: To determine the in vitro stability of freeze-dried and irradiated porcine peritoneum by assessing enzymolysis time of collagenase in porcine peritoneum following irradiated and freeze-dried treatment. DESIGN, TIME AND SETTING: This animal experiment was performed at the Burn Institute, Nanchang University, Association Mechanics Laboratory, Nanchang University-New Sans Company, Chinese Crude Drug Solid Preparation Nation Project Research Center of Jiangxi Traditional Chinese Medical College and Jiangxi Tianzhao Technology Development Company from July 2007 to June 2008. MATERIALS: Six healthy living pigs were used to sterilely obtain fresh porcine peritoneum. 60Co γ ray irradiation equipment was purchased from Jiangxi Tianzhao Technology Development Company. METHODS: Fresh porcine peritoneum was assigned into 4 groups. In the fresh group, fresh porcine peritoneum was washed in saline containing 1×105 U/L gentamicin, trimmed, and then immersed in protective solution for 15 minutes. Finally, samples were placed in 0-4 ℃ for use. In the freeze-dried group, fresh porcine peritoneum was placed in EMDE+10% glycerol for 15 minutes, placed in -78 ℃ to form ice crystal, froze and dried in a vacuum freeze-drying machine for 6 hours, and then took out at room temperature for use. In the irradiation group, on the basis of freeze-dried group, the porcine peritoneum was irradiated with 25 kGy 60Co γ ray in an irradiation equipment for 72 hours, and then maintained in 0-4 ℃ for use. In the freeze-dried + irradiation group, on the basis of irradiation group, the porcine peritoneum was irradiated with 25 kGy 60Co γ ray in an irradiation equipment for 72 hours, and then maintained at room temperature for use. MAIN OUTCOME MEASURES: 5-mm wafer of each group porcine peritoneum were dealt with typeⅠ collagenase, and digested time was recorded. RESULTS: Collagenase enzymolysis time of the porcine peritoneum was respectively (9.6±1.2), (6.1±1.6), (29.2±3.), (23.5±2.6) minutes in four groups. Enzymolysis time was significantly longer in the irradiation group and the freeze-dried + irradiation group compared with the fresh group and the freeze-dried group (P < 0.05). However, no significant differences in enzymolysis time of the porcine peritoneum were detected between the fresh group and the freeze-fried group, between the irradiation group and the freeze-dried + irradiation group (P > 0.05). CONCLUSION: Following 60Co γ-ray irradiation, antienzymolysis ability became strong. Irradiation can increase the stability of the porcine peritoneum. Freeze-frying does not have significant effects on porcine peritoneum stability. Zhang YL, Zeng YL, Xin GH, He Y.Freeze-drying and irradiation effects on stability of the porcine peritoneum in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(8): 1459-1462. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com] 摘要 背景：有实验表明 60Coγ射线灭菌处理的胶原膜会促使胶原分子产生交联，影响其稳定性。 目的：通过测定冻干辐照处理后猪腹膜胶原酶酶解时间，了解冻干辐照猪腹膜在体外的稳定性。 设计、时间及单位：动物实验观察，于 2007-07/2008-06 在南昌大学烧伤研究所、南昌大学-新三思公司联合力学实验室、 江西中医学院中药固体制剂国家工程研究中心与江西天兆科技发展公司完成。 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ：选用健康活体猪 6 只，无菌条件下取新鲜猪腹膜。60Coγ射线辐照装置为江西天兆科技发展公司生产。 方法：新鲜猪腹膜按照处理方式分成 4 组，新鲜组：将新鲜猪腹膜放入含有庆大霉素 1×105 U/L 的生理盐水中清洗修剪平 整后，再放入保护液中浸泡约 15 min，最后放入 0~4 ℃冰箱中保存、备用。冻干组：将新鲜猪腹膜放入 EMDE+10%甘油 中的猪腹膜浸泡 15 min 后，取出放入-78 ℃的冰箱中，使其形成冰晶，再放入真空冷冻干燥机内冻干 6 h，取出室温保存、 备用。辐照组：在冻干组基础上将猪腹膜放入剂量为 25 kGy 的 60Coγ辐照装置内，动态辐照 72 h 后取出，放入 0~4 ℃ 冰箱中保存、备用。冻干+辐照组：在辐照组基础上将猪腹膜放入剂量为 25 kGy 的 60Coγ辐照装置内，动态辐照 72 h 后 取出室温保存、备用。 主要观察指标：同时取直径为 5 mm 各组猪腹膜圆片用胶原酶Ⅰ型酶解，计算各片材料完全酶解时间。 结果：4 组猪腹膜胶原酶酶解时间：(9.6±1.2)，(6.1±1.6)，(29.2±3.0)，(23.5±2.6) mins。辐照组和冻干+辐照组猪腹膜 酶解时间比新鲜组和冻干组明显延长(P < 0.05)，但新鲜组和冻干组之间比较及辐照组和冻干+辐照组之间比较，猪硬脑膜 酶解时间无明显差别(P > 0.05)。 结论：经 60Coγ射线照射后的猪腹膜抗酶解能力增强；辐照均能增加猪腹膜的稳定性，冻干对猪腹膜的稳定性无明显影响。 关键词：60CO 辐照；胶原酶；交联；硬脑膜替代材料 张友来，曾元临，辛国华，何勇 .冻干辐照对猪腹膜体外稳定性的影响 [J].中国组织工程研究与临床康复，2009， 13(8):1459-1462. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com] 基础实验 张友来，等.冻干辐照对猪腹膜体外稳定性的影响 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 1460 www.CRTER.org 南昌大学第一附 属医院烧伤中心， 江西省南昌市， 330006 张友来★，男， 1983 年生，江西 省吉安市人，汉 族，南昌大学在读 硕士，主要从事组 织工程皮肤、烧伤 后期康复治疗及 循证医学等方面 的研究。 youlaizhang@ yahoo.cn 通讯作者：曾元 临，教授，主任医 师，从事组织工程 皮肤与烧伤创面 修复等方面研究， 南昌大学第一附 属医院烧伤中心， 江西省南昌市， 330006 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2009)08-01459-04 收稿日期：2008-06-18 修回日期：2008-08-27 (20081212034/D·Q) 0 引言 硬脑膜是保护脑组织的一道重要屏障，创 伤、肿瘤侵蚀及手术等均可造成硬脑膜缺损， 资料表明有10%~30%的神经外科需要实施硬 脑膜修补手术，其中又以颅底手术所占比例最 高[1-3]。 目前应用于硬脑膜修复的替代材料较多， 主要有自体筋膜、同种异体材料、天然及人工 合成材料、异种材料4类，前两类替代材料移植 后效果相对较好，但其来源有限，从而限制了 其临床中广泛应用[4-6]。异种替代物取材方便可 以有效地缓解同种供体移植材料的短缺。例如 猪，其来源方便，易于繁育，与人体解剖和生 理有很高的相似性，可作为一种很好的移植供 体；猪腹膜因其自身的优点、经处理后移植较 少发生感染及排斥反应等，被认为是一种较好 的硬脑膜移植的供体组织[7]。 理想的硬脑膜替代材料除了要求生物相容 性好、术后不引起感染、新生组织生成后替代 材料能完全被吸收等之外，还要求替代材料缝 合后能够防止脑脊液渗漏[8-10]，这又说明另一方 面，要保持经处理后硬脑膜物理性能的良好性， 使其具有一定的弹韧性及抗张能力[11-12]。有实 验表明60Coγ射线灭菌处理的胶原膜会引起胶 原断裂变性，也会促使胶原分子产生交联，但 经60Coγ射线照射处理的猪腹膜是胶原变性还 是交联为主文献中未见报道，有资料表明胶原 酶酶解时间长短即胶原抗胶原酶酶解能力大小 反映了胶原交联度的大小[13]。实验将通过测定 经辐照等处理后的猪腹膜的胶原酶Ⅰ型酶解时 间，了解处理后的猪腹膜在体外的稳定性，初 步评价冻干、60Coγ射线照射等处理后猪腹膜 在硬脑膜移植中的适用性。 1 材料和方法 设计：动物实验观察。 时间及单位：于2007-07/2008-06在南昌 大学烧伤研究所、南昌大学-新三思公司联合力 学实验室、江西中医学院中药固体制剂国家工 程研究中心（BSL-1实验室）与江西天兆科技 发展公司完成。 材料：选用健康活体猪6只，雄雌不限，8~10 个月龄，体质量150~180 kg，普通级，由南昌市 青云谱区肉联厂提供，实验过程中按照国家科技 部2006年颁发的《关于善待实验动物的指导性意 见》进行[14]。 方法： 实验分组与材料制备：在相对无菌条件下， 健康活体宰杀后一二个小时内取出新鲜猪腹 膜，按如下不同处理，分为4组： 新鲜组：将新鲜猪腹膜放入含有庆大霉素 1×105 U/L的生理盐水中清洗干净并将边沿修 剪平整。再放入保护液（EMDE+10%甘油） 中浸泡约15 min，最后放入0~4 ℃冰箱中保 存、备用。 冻干组：将新鲜猪腹膜放入EMDE+10%甘 油中的猪腹膜浸泡15 min后，取出放入-78 ℃ 的冰箱中，使其形成冰晶，再放入真空冷冻干 燥机内冻干6 h(冻时-40 ℃，上限温度-20 ℃)， 取出室温保存、备用。 辐照组：按照冻干组得到的形成冰晶的猪 腹膜放入剂量为25 kGy的60Coγ辐照装置内， 动态辐照72 h后取出，放入0~4 ℃冰箱中保 存、备用。 冻干+辐照组：按照冻干组制备后的猪腹膜 放入剂量为25 kGy的60Coγ辐照装置内，动态 辐照72 h后取出室温保存、备用。 主要观察指标：胶原酶Ⅰ型酶解时间的测 定，参照林晓艳等[13]的实验方法，用自制打孔 器将4组腹膜替代材料制成直径5 mm的圆片 各10片，再将小圆片和酶解缓冲液以及酶活力 单位为3.57×105 U/L胶原酶液加入小试管中， 37 ℃恒温酶解至小圆片分解所需的时间，即 为酶解时间(mins)。 设计、实施、评估者：由第2作者设计、 评估，全部作者共同实施，均经过培训。 统计学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ：数据由第1作者采用SPSS 15.0统计软件进行处理，以x _ ±s表示，对测得 数据采用两样本均数比较t 检验。取α=0.05， 主要试剂及仪器 胶原酶Ⅰ型 Tris-HCl 缓冲液(pH 7.4) GIL1BY 真空冷冻干燥机 60Coγ射线辐照装置 DMEM 液 10%甘油 -78 ℃深低温冰箱 pH 试纸 直径 5 mm 硬脑膜替代物 圆片打孔器 来源 Sigma 公司，美国 南昌东湖强生生物公司 江西中医学院中药固体制剂 国家工程研究中心 江西天兆科技发展公司 Gibco 公司, 美国 深圳南粤药业有限公司 sanyo 公司,日本 成都西蒙环境检测仪器有限公司 南昌大学第一附属医院 烧伤研究所 Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 本页已使用福昕阅读器进行编辑。 福昕软件(C)2005-2009，版权所有， 仅供试用。ഀ 张友来，等.冻干辐照对猪腹膜体外稳定性的影响 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 1461 www.CRTER.org P < 0.05为差异有显著性意义；P < 0.01为差异有非常 显著性意义。 2 结果 各组猪腹膜胶原酶酶解时间的测定结果 4组猪腹膜胶原酶酶解时间： 新鲜组为(9.6±1.2) min，冻干组为(6.1±1.6) min，辐照组为 (29.2±3.0) min，冻干+辐照组为(23.5±2.6) min。 组间比较： 辐照组和冻干+辐照组酶解时间比新鲜组和冻干组长(P < 0.05)， 但新鲜组和冻干组之间，辐照组和冻干+辐照组之间差别无显著 性意义 (P > 0.05)。 3 讨论 理想的硬脑膜替代材料定义中对材料的生物力学 有一定的要求，即要求其有一定有韧性与弹性，这样有 利于缝合与防止脑脊液外漏[15-16]，因为脑脊液是否外漏 仍是硬脑膜移植的一个重要的监测指标[17-19]，如果经处 理后的替代材料变得脆弱、不能缝合，那将容易产生脑 脊液漏。 实验表明辐照处理后的猪腹膜在体外的稳定性增 强，究其主要原因，作者认为主要与辐照能使材料胶原 产生交联和蛋白质空间构象修饰有关，辐照后能增加胶 原分子β-折叠和β-链数量[20-21]。高分子交联是使分子 间原有的链之间形成新键，使之成为网状结构高分子的 反应，交联还会使纤维变粗[22]；交联有着十分重要的作 用：首先胶原纤维交联能提高其机械强度，其次交联能 有效缓解材料变形及易碎等特性，交联缺乏时材料易随 意变形，而增加交联密度可使原纤维变得更强[23-24]。 最后，文献表明交联后的胶原抗原性降低或无明显抗原 性及交联处理是改善冻干材料不足的重要途径[25-27]。 60Coγ照射能通过与水反应生成的自由基加强分子间 的交联及激发电子的间接反应引起蛋白链断裂这2种作 用影响其生物力学特性，但是前者还是后者起主要作 用，主要取决于辐照剂量、温度和替代材料自身的干湿 性等，并且与辐照剂量有依赖现象[28-30]。相关资料表明， 采用常规25 kGy 60Coγ射线灭菌胶原膜时,γ射线将能 量传递给胶原分子，引起电离和激发，使胶原分子产生 交联[3]，而辐照剂量大于3 kGy时，胶原以变性为主[31-33]。 在本实验中，作者发现，冻干组比新鲜组，冻干+辐照 组比单纯辐照组酶解时间均低，这主要和干性材料有 关；但冻干+辐照和单纯辐照替代材料的抗酶解能力无 明显差别，却比冻干组明显增强，说明60Coγ照射能明 显提高材料的抗酶解能力，因冻干后材料有更易于保 存、便于运输与手术操作等优点，所以认为冻干辐照是 一种较好的生物材料处理方法。 4 参考文献 [1] Bejjani GK, Zabramski J; Durasis Study Group. 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