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细胞凋亡_Apoptosis_Apo_及其检测方法

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细胞凋亡_Apoptosis_Apo_及其检测方法 收稿日期: 2004 05 25 作者简介:任 � 平( 1964 ) , 女,黑龙江双城人, 副教授,本科. 细胞凋亡( Apoptosis, Apo)及其检测方法 任 � 平1,高明辉1,李慧姝2 ( 1.黑龙江畜牧兽医职业学院,黑龙江 双城 150111; 2.佳木斯铁路兽医卫生段,黑龙江 佳木斯 154007) 中图分类号: S851. 34 文献标识码: B 文章编号: 1004 7034( 2004) 12 0031 02 � � 细胞凋亡是指机体在一定生理、病理条件下为维持内环境 稳定, 通过...

细胞凋亡_Apoptosis_Apo_及其检测方法
收稿日期: 2004 05 25 作者简介:任 � 平( 1964 ) , 女,黑龙江双城人, 副教授,本科. 细胞凋亡( Apoptosis, Apo)及其检测方法 任 � 平1,高明辉1,李慧姝2 ( 1.黑龙江畜牧兽医职业学院,黑龙江 双城 150111; 2.佳木斯铁路兽医卫生段,黑龙江 佳木斯 154007) 中图分类号: S851. 34 文献标识码: B 文章编号: 1004 7034( 2004) 12 0031 02 � � 细胞凋亡是指机体在一定生理、病理条件下为维持内环境 稳定, 通过基因控制而使细胞主动有序的死亡, 表现一系列形 态和生化方面的特征。细胞凋亡是细胞正常的死亡,它涉及一 系列基因的激活、表达以及调控等作用, 不造成炎症和自体的 损伤,是细胞为了更好地适应自下而上环境而主动争取的死亡 过程。因这一死亡过程严格受到程序的控制,又称细胞程序性 死亡( Prog ammed cell death, PCD)。 随着分子生物学、细胞生物学、免疫学和肿瘤学的研究发 展,人体对细胞凋亡的重大理论意义和实际意义有了更深的理 解。为病原菌入侵机体而引起疾病的机理有了新的认识,为肿 瘤和自身免疫性疾病的防治等方面的研究提供了新的思路。 1� 细胞凋亡(Apo)与细胞程序性死亡(PCD)、细胞坏死 从严格的词意来讲, PCD 与 Apo是有区别的。早在 1956 年 PCD的概念就被提出, 是胚胎学家在观察胚胎发育过程中 及幼儿体到成体发育中,发现某些细胞在发育到某一阶段自然 就死亡了, 并且可以预测, 是严格受到程序控制的正常组成部 分。如蝌蚪在变成青蛙的过程中,其尾部常伴有大量的细胞死 亡或消失,所以 PCD是发育学功能上的变化,而 Apo是形态学 上的概念, 它描述体内细胞形态上的变化特征, 同细胞坏死不 同。但是一般情况下 Apo与 PCD这两个概念可以交互使用, 具有同等意义。 Apo与细胞坏死是两种不同的死亡方式。细胞坏死是指 细胞在各种致损伤因素的作用下, 引起细胞无序死亡的过程。 形态特征为细胞胀大,特别是细胞器肿大, 胞膜破裂,胞浆内容 物外泄, 而核变化较慢, DNA 降解不充分, 进而引起局部严重 的炎症反应。细胞凋亡是正常细胞受基因调控的主动、有序的 死亡过程。形态学变化为早期胞体缩小, 胞膜结构完好, 胞核 浓缩集于核膜边缘。晚期染色体断裂,核膜与细胞膜均内陷, 包裹胞内成分(胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜)形成� 泡 样结构,为� 凋亡小体 。最后整个细胞均裂解成这种� 小体 , 很快被邻近的组织细胞吞噬, 形成吞噬溶酶体, 在溶酶体中被 消化降解,不引起周围组织炎症与损伤。Apo形态变化维持时 间很短,通常在几分钟、十几分钟内即可完成。细胞发生凋亡 时, Ca2+ 内流,胞内 Ca2+ 浓度增高; 内源性核酸内切酶被激活, DNA 从核小体连接处被水解,形成多个 180~ 200 对碱基对或 其整倍数的核小体。(核小体约由 180~ 200 对碱基由 DNA 双 螺旋片段和八分子组蛋白聚合而成)。 2 � 细胞凋亡的检测方法 建立 Apo 的检测方法有多种。目前常用的检测方法有形 态学观察法、琼脂糖疑胶电泳法、末端标记法、ELISA 法、细胞 分析仪检测法等,且还在继续发展和完善。但经过人们多年的 研究发现,原位末端转移酶标记法能检出早期未发生典型变化 的凋亡细胞,具有灵敏度高, 特异性强等特点。 2. 1 � 形态学观察法 对组织切片或细胞悬液进行形态学观察, 常用的方法有普 通光镜观察法、活细胞悬滴荧光染色镜检法、凋亡小体电镜观 察法等。 下面仅介绍光镜下 Apo 与细胞坏死的差异。在光镜下观 察 Apo 的细胞都是单个散在分布,呈现胞体缩小, 染色质广泛 固缩, 常聚集于核膜呈界限分明的颗粒块状或新月牙形小体, 而后核碎裂形成凋亡小体。因凋亡小体的完成约数分钟, 因此 在组织切片上不易看到。而发生细胞坏死的细胞在光镜下, 常 是某一区域内的一群细胞或一块组织。早期也可发生核固缩, 但染色质分布不规则、边界不清。到后期胞浆肿胀明显,核溶 解消失,不形成凋亡小体, 细胞器结构常被破坏。 本法优点是简便经济, 可定性定位。不足之处是特异性 差,无法定量, 在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下, 难以 判断结果。 2. 2 � 琼脂凝胶电泳法 细胞发生凋亡时,细胞染色体的DNA被降解, 产生不同长 度的寡聚核苷酸片段,把降解的片段置于含溴化乙锭的 1. 5% 琼脂糖凝胶中进行电泳, Apo 呈现特征性典型的� 梯状 条带。 而细胞坏死时,常由细胞损伤而引起的DNA无规律的断裂, 伴 有组蛋白降解,在琼脂凝胶电泳上呈模糊的弥漫膜状条带。 本法优点是操作简便易行, 定性准确,并可进行定量检测。 但无法显示组织细胞形态结构,也不能反映凋亡细胞与周围组 织的关系。 2. 3 � 酶联免疫吸附试验( DLISA)方法 凋亡细胞内裂解的 DNA片段含组蛋白(核小体 ) , 而 DNA 与组蛋白结合紧密不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶 联免疫法,应用抗组蛋白抗体和抗 DNA 抗体裂解片段结合形 成夹心结构,再经显色及比色判断结果。该法可定性、定量, 但 不能定位。 2. 4 � 原位末端转移酶标记法 凋亡细胞 DNA 被降解后, 其每个片段均含有 3!- OH 黏 性末端,在末端转移酶或 DNA多聚酶的作用下, 将生物素标记 的核苷酸原位掺入 DNA 缺口, 再用辣根过氧化物酶标记抗生 物素抗体与之结合, 经显色剂显色可原位特异显示凋亡细胞。 阳性凋亡细胞核呈棕褐色, 部分细胞浆也可因核 DNA 碎片的 逸出呈阳性着染。少数坏死细胞也可呈阳性反应, 但位于坏死 灶内,可鉴别。该法特异性强, 灵敏度高,可用定量检测。 3 � 细胞凋亡与临床 Apo与组织器官的发育、机体正常生理活动的维持、某些 31� ∀黑龙江畜牧兽医#2004年第 12期 � � � � � � � 畜禽生产 � � � � � � � � � � � � � 疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切关系。机体内细胞 在凋亡过程中,严格受到基因调控, 如果调控的基因出现了问 题,该死亡的细胞没有死亡, 细胞就会继续分裂增殖,导致肿瘤 细胞的出现。反之不该死亡的细胞死亡了,机体正常的组织或 免疫系统将会出现瘫患, 如 HIV (免疫缺陷型病毒)进入人体 导致艾滋病,就是不该死亡的 T 淋巴细胞大批死亡, 出现免疫 能力低下,引发多种疾病, 最终导致死亡。因此有学者提出, 细 胞恶性转化或癌细胞的产生均是由细胞增殖与细胞死亡调控 功能失调所致。不少致畸物,如细胞生长依赖激素、乙醇、抗癌 药等也能促进细胞凋亡,使用时要慎重。 ( 007) 收稿日期: 2004 08 10 作者简介:关绵来( 1960 ) , 男,辽宁岫岩人, 畜牧师,大专. 0. 25 毫升种公牛微型细管冷冻精液 应用技术推广效果 关绵来 (辽宁鞍山市岫岩满族自治县畜牧技术推广站, 辽宁 鞍山 114000) 中图分类号: S823. 8+ 9 文献标识码 : B 文章编号: 1004 7034( 2004) 12 0032 01 � � 0. 25 mL 种公牛微型细管冷冻精液是目前发达国家普遍 应用并已成型的先进技术,该技术在我国只处于试点阶段。为 了尽快应用推广这项肉牛改良技术,辽宁鞍山市岫岩县畜牧技 术推广站被确定为省级农业推广试点单位,承担了试验推广任 务。在生产中应用该技术,取得了较好的预期效果。现将实施 情况报道如下。 1 � 主要技术内容 1. 1 � 试点任务 推广应用 0. 25 mL细管冻精冷配母牛 500 头。 1. 2 � 试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 进行有效精子数为 800万个的0. 25 mL 细管冻精、有效精 子数 1 000万个的 0. 25 mL 细管冻精、有效精子数为 1 000 万个 的 0. 50 mL细管冻精等三种剂型的精子活率和受胎效果的对 比试验。 2 � 主要技术措施 2. 1 � 推广地区、数量 为实施好该项目,从 2002 年开始,遵照辽宁省肉牛繁育中 心下达的推广 500 头的任务要求,将指标分解到历年来肉牛改 良成绩较好的前营子和杨家堡两个乡镇, 并分别由技术过硬、 工作能力强的人工授精员沙玉刚和杨成涛两人, 采用 0. 25 mL 细管冻精实际输配母牛 507 头,完成任务指标的 101. 4%。 2. 2 � 应用的细管冻精品种 在试验过程中,为了减少品种间的差异,采用多年来推广 数量较多的夏洛来牛的细管冻精,实施直肠把握对本地黄牛进 行人工授精。 2. 3 � 试验分组 该试验以有效精子数 1 000 万个的 0. 50 mL 细管冻精为 对照组;有效精子数 1 000 万个的 0. 25 mL 细管冻精为试验 ∃ 组,有效精子数 800 万个的 0. 25 mL 细管冻精为试验%组(见 表 1)。 表 1 � 三种细管冻精输精数量 头 实施单位 对照组 试验∃组 试验%组 前营子镇 133 128 136 杨家堡 135 124 119 合计 268 252 255 2. 4 � 试验结果 首先,三种剂型细管冻精, 在输精前解冻之后, 随机镜检观 察精子活力,均获得良好的效果 ,三者之间经过方差分析, 差异 不显著( P> 0. 05) , (见表 2)。 表 2 � 三种细管冻精解冻精子活力比较 镜检次数 对照组 试验∃组 试验%组 56 0. 48 0. 49 0. 47 � � 其次,三种剂型细管冻精液输精后的情期受胎率达 63% 以上,总受胎率达到 92%以上。经方差分析, 情期受胎率组间 差异不显著( P> 0. 05) , (见表 3)。 表 3 � 三种细管冻精输精效果 组别 细管冻精类型/ mL 输精母牛 头数/头 情期数 怀胎数 情期受胎率 / % 受胎率 /% 对照组 0. 50 268 389 250 64. 3 93. 3 试验∃组 0. 25 252 365 233 63. 8 92. 5 试验%组 0. 25 255 372 235 63. 2 92. 2 3 � 结论与建议 在试点过程中,对三种剂型细管冻精,解冻后精子活力的 检查,以及配种结束后, 妊娠检查结果表明, 精子的活力和受胎 情况差异不显著。即三种细管冻精的质量是相近的, 受胎效果 相差无几。但是,由于该试验中, 所用种公牛冻精的个体不同, 母体存在的差异,还有技术人员输精水平的差异可能造成一定 的偏差。 因此,根据试验结果,建议含有效精子数800 万个的 0. 25 mL 细管冻精可以逐步取代有效精子数 1 000 万个的 0. 25 mL 细管 冻精,可完全可取代含有效精子数 1 000 万个的 0. 5 mL 细管 冻精。这样处理后,除了保留细管冻精优点外, 可以节约生产 成本,扩大配种数量。 ( 007) 32 Heilongjiang Animal Science 畜禽生产 and Veterinary Medicine� NO. 12, 2004
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