辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选

中国生物防治Chin雠JoIIrn8lofBiologic日lContrd 2002年11月 辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选 何红，蔡学清，洪永聪，关雄，胡方平 (福建农林大学植保学院．福州350002) 摘要：对健康辣椒植株体内的内生细菌及拮抗菌进行了分离筛选。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，不同品种、部位 及种植地，内生细菌的数量有所不同，品种间内生细菌的数量变化为2．83x103～1，346× 104cⅣz(FW)；各品种以叶片中内生细菌的数量最多，其次为根，再次为茎，果最少；不同种植 地中，前作为水稻田种植辣椒叶片中内生细菌的数量比旱地种植的多，而根、茎、果中内生细菌 的数量正相反。拮抗、防病测定表明，108株辣椒内生细菌中，有28．7％的菌株对香蕉枯萎菌 和黄瓜枯萎菌有拮抗作用；来自辣椒叶片和茎杆内的Bs-2和BS．1两菌株，对13种植物病原 真菌有较强和稳定的拮抗作用，其中对辣椒炭疽病有57．34％一94．08％的防病效果，并可以 在辣椒体内定殖。经鉴定该两菌株为枯草芽孢杆菌。 关键词：辣椒；内生细菌；鉴定；拮抗菌；筛选 中图分类号：s436．418．1；s476文献标识码：A文章编号：1005．9261(2002)04—0171—05 许多研究已证明，健康植物体内存在大量的内生细菌，它们是植物病害生物防治的潜在资 源菌【1，⋯，已在棉花Ⅲ、马铃薯-“、水稻[Ij等多种作物体内分离筛选到具有防病或诱导抗病作 用的内生细菌。广东粤西地区和海南省是我国主要冬季辣椒种植区，种植面积较大，仅湛江每 年种植面积就达4．5万hm2以上。但辣椒内生细菌尚未见详细研究报道。本研究对辣檄内 生细菌及其拮抗菌进行了分离筛选。 1材料与方法 1．1供试辣椒品种 选广东粤西地区普遍种植的辣椒(Capsicum一Ⅱ∽∞m)中椒5号、新丰5号、9919、9802 和湖光尖椒等品种进行内生细菌分离。 1．2分离和培养用培养基 细菌分离用KB，培养用NA，液体培养用NB(条件为28％，180ffmin，48h)；真菌培养及拮 抗测定用PDA(其中加入蛋白胨59／L)_5J。 1．3内生细菌分离方法 从不同种植地采集长势良好无病的辣椒植株，其根、茎、叶、果分别用自来水冲洗晾干后， 各称取59(果159)，70％酒精表面清洗后，再用0．1％升汞表而消毒1．5—3．0rain(叶片 1 5min，根、茎、果3．0min)，无菌水冲洗晾干。每样品加10ml无菌水碾碎静止15min后，各取 收稿开期：2001—10—23 蕈台项目：福建省教育厅资助项目(K2001050) 作者简介：何红(1963一)，男，博士生．副教授．工作单位为湛汀海洋大学农学院 17l 万方数据 中国生物防治 第ls卷 50m涂平扳，每处理重复3次，27℃黑暗培养48—72h，计算菌落数。根据菌落形态、颜色等挑 取单菌落，按常规方法纯化后保存。供测试鉴定。 1．4室内拮抗病原真菌蔫定 先在直径为9cm的培养皿中倒入约3mlPDA，凝固后加入1ml菌株培养液，摇匀后加入 约12mlPDA。中央加lml无菌水为对照，然后在平板上接入直径为5mm的真菌(表2)菌丝 块，28℃黑暗培养72h测量菌落直径，计算抑制率。 1．5细菌鉴定 常规革兰氏染色，芽孢染色，55t生长测定后，用Bialog细菌自动化鉴定仪鉴定。 1．6茵株在辣椒体内定殖测定 用逐步筛选法，筛选出在含300×10“p∥mlRifI的NA培养基平板上能稳定生长的Bs． 2和BS．1菌株；用含有同浓度的Rif．NB培养24h后，用涂抹叶片、注射茎杆、浸种、浇灌土壤 等方法接种。分别于不同时间取根、茎、叶，经70％酒精和0．1％升汞表面消毒后，用含300× 10～“g／mlRif．的NA培养基分离菌株，测定其定殖情况，以清水处理组织为对照。 1．7对辣椒炭疽病防治试验 选无病辣椒果(品种为皱皮尖椒)，70％酒精表面消毒后，分单果放入塑料盆，再用内生细 菌的NB活菌培养液喷雾接菌(以果面布满菌液为度)，于果面菌液自然晾干后0、24、48h喷雾 接种辣椒炭疽菌(Colletotriehumgloeosporioides)分生孢子悬浮液(浓度为4．0×106—5．0× 106孢子／m1)，同样以果面布满雾点为度。各处理分别以喷清水后接种炭疽菌为对照，每处理 5次重复。23～25。C下保湿培养，待对照发病后，记录发病结果。 2结果与分析 2．1不同品种和种植地辣椒内生细菌的数量 结果表明(表1)，辣椒根、茎、叶、果内均存在大量的内生细菌，各品种间内生细菌的数量 为2．83×103。1．346x104cfu／g(FW)，水田(前作为水稻)种植的辣椒内生细菌比旱地多；从 不同部位来看，叶片中比其它部位多(9919除外)，根中比茎中多，果中最少；水田种植的叶片 中数量最多，但根、茎、果中的数量正相反，旱地种植的比水田多。由此可见，辣椒内生细菌的 数量与辣椒品种及其种植环境密切相关，不同种植地、不同品种及部位，其内生细菌数量不同= 裒1不同品种和种植地辣椒内生细曹的数■(1旷c"g‘Fw) 2．2拮抗植物病原真菌的辣椒内生细菌筛选 从上述分离获得的内生细菌中挑取、纯化得108个菌株。先以香蕉枯萎病菌和黄瓜枯萎 病菌为目标菌，用对峙生长法，测试了内生细菌各菌株对病原真菌的拮抗作用。结果有31株 (28．7％)对香蕉枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌均具有拮抗作用。各品种根、茎、叶中均含有对2种 病原真菌具拮抗作用的菌株，但果中未发现拮抗性菌株，其原因可能是挑取菌落时，未能挑取 172 万方数据 第4期 何红等：辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选 所有菌落所致。进一步测试上述菌株对炭疽菌等13种植物病原真菌的拮抗作用表明，它们对 测试的病原真菌均有不同程度的拮抗效果。其中以分别来自湖光尖椒品种叶片和茎杆的BS． 2和BS．1两菌株拈抗作用较强(表2)，尤其对植物炭疽病菌的拮抗作用最强，共同培养72h 后，对3种炭疽菌的抑制率达99％以上。 寰2 Bs．2和BS-I对13种檀栩病原真菌的抑制作用 植物病原真菌 学名 苗落直径(mm) 抑制率(％) BS．2 ‘B5-1 CK BS．2 BS一1 白菜黑斑病菌 Alfernarlabrasslecm 10．5 6．0 370 71．62 8378 白菜炭疽病菌 Coltetotrichumhigginsianum 0 0 230 100 100 辣般炭疽病菌 c gloeosporloldes 0 0 l 210 100 9952 香蕉炭疽病菌 Cm堋00 43．0 100 100 香蕉枯萎病菌 Ftuariumoxyspo⋯f州Pn如，瑚 10．0 120 410 7561 70．73 西瓜枯萎病菌 F．oxyspo胁f宴pniveHm 115 16．5 41．5 7229 6024 甜瓜枯萎病菌 F．oxysporumf spe眦umerinum13．5 140 375 640 6267 黄瓜枯萎病菌 F．oxysporuraf．帅．eucu附rinum135 135 325 5846 5846 棉花黄萎病菌 Verlei2liumdahliac 0．1 0 1 8．s 98．82 98，82 茄子黄萎病菌 r．n／greacenn 45 20 8．5 4706 76．47 辣椒疫霉菌Pttytophthoraoapslci 9．5 31．0 390 7564 17．95 烟草疫霉菌P．ndccahmae 9．0 120 30．5 7049 6066 水稻纹桔病菌 Rhi：otoniaso／an／ 22．0 240 355 3803 3239 苎塑旦塑壅堕 !!!型!!!!E盘! !!! !-! !!：! !!：!! !!：竺 2．3拮抗内生细菌的鉴定 形态观察和常规染色表明，上述对两种枯萎病菌具拮抗作用的3l株菌株的菌体均为杆 状，菌落乳白色、圆形，有的中央隆起．革兰氏染色阳性，周生鞭毛，产芽孢，芽孢椭圆形、在菌体 中央或一端形成，兼性厌氧，接触酶阳性等。参照东秀珠等f6一的方法，确定均为芽孢杆菌 (Bacillussp．)；其中BS．2和BS．1两菌株进一步鉴定为枯草芽孢杆菌(Baeill“ssubtilis)。 2．4118-2和115-1在辣椒体内的定殖 用BS．2和BS-1拮抗利福平菌株接种表明(表3)，不同方法接种后，在辣椒根、茎、叶等组 织中均可以分离到与原始菌株相同菌落的细菌菌株，经Biolog鉴定，这些菌株均为枯草芽孢杆 菌。对照组织中未分离到细菌。这表明BS．2和BS．1两菌株可以在辣椒体内定殖。分离中还 发现，两菌株能在各组织间传导，同时对寄主植物还有促进生长作用，详细内容另文报道。 裹3不同接种方法辣椒各组织中115-2和B$-I曹株分离结果 BS一2 BS一1 BS-2 BS．J 接种方法 接种方法 根 茎 叶 根 茎 叶 根 茎 叶 根 茎 叶 涂抹叶片 一 + + 一 + + 浸 种 十 + + + + + 注射叶腋 一 + + 一 + + 浇灌土壤 + + + + + + 2．5118-2和BS-1两菌株对辣椒炭痘病的防治效果 结果表明(表4)，BS．2和Bs．1两菌株对辣椒果炭疽病均有良好的防治效果。喷施菌株培 养液后0、24和48h接种炭疽病菌，其10d后的防病效果为57．34％一94．08％；13d的防病效 果为24。68％．82，55％。但试验中发现，在喷菌液前24～36h接种炭疽病菌，两菌株对炭疽 病无防治效果。说明两菌株对辣椒炭疽病可能只有预防作用，无治疗效果。另外，在田间自然 173 万方数据 中国生物防治 第18卷 条件下，用两菌株培养液喷雾，防治辣椒炭疽病发现，菌液处理20d后未见椒果发病，而对照发 病率达15％以上。表明两菌株在田间也有防病效果(另文发表)。对此有待进一步研究。 表4 BS-2和酪I对鼻体椒果炭疽病防治效果 喷渡后lOd 13d 喷液后 IOd 13d 需黼病黜瑟病斑数譬 菌时问斑敷病斑敷数(％) 病斑数 (％)菌时间 病斑数 ；ij 病斑数 ；；； Oh BS．2 067B 9408a 7．65b 48908 24h CK 13．00A 2I．43A Oh RS一1 1 00B 9117a 5．12b 6580Ⅱ 48h BS一2 3 00B 86．77a 1622c 5377b Oh CK 11 33A 1497a 48h BS-I 967B 5734a 2643b 2468a 24h RS-2 1 00B 9231a 5 45B 74．578 48h CK 2267A 3509a 24h BS_1 1 00B 92．318 3．74B 82．553 3讨论 植物内生细菌分离因取样、消毒方法及培养基选择不同，其数量存在较大差异。目前尚无 统一的定量分析方法n]。本研究采用酒精和升汞表面消毒后，碾碎植物组织．取其汁液在KB 培养基上涂平板，对辣椒根、茎、叶和果内的内生细菌进行了初步定量分离。结果除叶中细菌 的数量与Fisher等人[8]认为植物根及其它地下组织内生细菌的数量可能比植物地上组织多 的观点有所不同外，其它与前人的报道基本相同。说明该方法在了解植物各部位内生细菌数 量趋势方面可能有一定的价值。但其准确定量分析方法尚有待进一步研究。 以前分离植物病害拮抗菌绝大部分是从土壤或植物根际土壤分离，但由于这些土壤拮抗 菌易受外界条件的影响，防病效果不稳定，有的甚至无效-9J。本研究表明，辣椒体内含有对多 种植物病原菌具有拮抗作用、并对植物病害有防治效果的内生细菌，这些细菌可以在植株体内 定殖和传导，并对寄主植物有促进生长作用。前人研究认为-l’2J，植物内生细菌由于存在植物 体内，不易受外界环境的影响，可以较长时间发挥生物学作用，同时它们还可以作为载体转移 外源防病抗虫基因，构建多功能内生生防工程菌植物疫苗等。因此，从植物内生细菌中分离筛 选植物病害生防菌，具有广阔的研究和应用价值，应进一步加强研究。 致谢：华南农业大学周而勋博士后、山东农业大学张广民教授等赠送部分菌株，在此一并致谢。 参考文献 [1】扬海莲．孙晓璐，宋未植物内生细菌的研究[JJ．微生物学通报，1998，25(4)：224—227． 【2]Sturz^v，ChristieBR，Nowakj．Bseterlalendophytes：potentlalroleinderekI曲19suelainablesystemsof付oPpn⋯luutl [J]CriticalReviewsiplantSclon,．es．2000，19(1)：1—30 F3]夏正俊，顾本康，是蔼民．植物内生菌及根际土壤细菌诱导棉花对大丽轮技菌抗性的研究!J]中国生物防治，1996， 12(1)：1—10j4]㈣BurAM，AndreC，IshimruC^Biologicalcontrolofthebacterialringmtpathogenbyendophytieb∞te6aisolated fromlmtato[J]．Phytopathology．1993，83：1406． [5j 方中选植病研究法【M]北京：农业出版社，1999． [6] 东秀璩．蔡妙英．常见细蓖鉴定手册[M]北京：科学出版社，2001． 『7] 刘云霞植物内生细菌的研究与应用[J]植物保护，1994．20(5)：30—32 [8] FisherPJ，Pgtriulo，L印由scottl4MTkedigtdhutlonof90mefun“a【Idbacterialendophyt糌mmaize(z阳maysI) ‘Jj N!wPhytol，1992，122：299—305 ：9j 李长橙拈抗细菌生物防治植物士传病害的研究进屉[J]．生物防治垴报，1992，8(4j：168—172 174 万方数据 第4期 何红等：辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选 SelectionofEndophyticAntifungalBacteriafromCapsicum HEHong，CAIXueqing，HONGYongeong，GUANXiong，HUFangping (CollegeofPlantProtection，FujianAgri．andForestryUniv．，Fuzhou350002，China) Abstract：Theendophyticantifungalbacteriawereisolatedandscreenedfrom Capsicumfru6∞cem．Resultsindicatedthatpopulationofendophyticbacteriaranged from2．83×103to13．46×103efupergramoffreshweightalthoughitmightvary dependingonvariety，tissueandplantinglocationoftheplant．Populationoftheen— dophyticbacteriawerebiggestinleaf，secondlyinroot，thirdlyinstemandsmallest infruit．Leaftakenfromcapsicumplantedinirrigatedfieldharboredabiggerpopula— tionofendophyticbacteriathanthatfromnon—irrigatedfield．Butfortheendophytie bacteriainroot，stemandfruit，plantsgrowingnon—irrigatedfieldharboredmore thanthatfrowinginirrigatedfield．Ofthe108strainsisolated．28．7％expressedan— tagonismagainstgrowthofFusariumoxysporumf．8p．cubenseandFusarium oxysporumf．sp．cueumerinum．Twoofthem(BS-2andBS一1)werefoundnotonly tobeinhibitivetothegrowthofsomefungalpathogens，butalsohave57．34％一 94．08％controleffecttotheanthracnosecausedbyColletotrichumgloeosporioides． ThesetwostraluswereidentifiedasBacillussubtilis． Keywords：capsicum；endophyticbacteria；selection；identification；antifungalbac— teria 欢迎订阅2003年农业科技期刊 《甘肃农业科技) 由甘肃省农科院和甘肃省农学会 《广西农业科学) 是由广西农业科学院主办的综台 主办的综台性农业科技期刊，月刊，大16开56页，每性农业科技期刊。双月刊，大16开60页，每期定价4 期定价4元，全年48元．全国各地邮局均可订阒，邮元，全年24元。邮发代号：48—3，全国各地邮局均可 发代号：54—8。编辑部地址：兰州市安宁区农科院新订阅。编辑部地址：广西南宁市大学西路44号，邮 村1号，邮编：730070，电话：(0931)7614994。编：530007，电话：(0771)3243905。 《上海蔬菜)是上海市农科院与上海蔬菜经济研究《果都信息报)是以报道种植、养殖技术信息为主的 会共同主办的科技刊物。邮发代号：4～679。_双月农业科技信息撮。本报四开四版，旬刊，全年30元。 刊，16开48页。每册定价3．60元．垒年21．60元。自办发行，地址：江苏省徐州市丰县中阳大道果都信 编辑部地址：上海北理路2901号，邮编：201106，电息报马新存收，邮编：221700+电话：(0516)4208995。 话：(021)62208660—3165。 《山东农业科学>是由山东省农业科学院、山东枉学 《蔬菜)是北京市农林科学院农业科技信息所主办 会、山东农业大学、莱阳农学院联合主办的综合性农 的蔬菜专业期刊。月刊，大16开56贾。每册定价业科技期刊。双月刊，大16开56页。每期定价3，50 3．50元，全年42．00元。邮发代号：82—874。全国各元，全年21．00元，邮发代号：24—2．全国各地邮局均 地邮局均可订阕，编辑部地址：北京海淀板井北京市 可订闭。编辑部地址：济南市桑目路28号．扪编： 农林科学院．邮编：100089，电话：(0t0)51503567．250100，电话：(0531)5199268。 175 万方数据