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表观遗传学课件.ppt

表观遗传学课件

msl200
2011-06-18 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《表观遗传学课件ppt》,可适用于高等教育领域

表观遗传学及其几种常见研究方法病原生物学系张祖萍年月内容纲要表观遗传学概述表观遗传学主要内容几种常用表观遗传学研究方法Epigenetics一、表观遗传学概述(一)常见表观遗传学现象同卵双生的双胞胎虽然具有相同的DNA序列却存在表型和疾病易感性的差异。一、表观遗传学概述(一)常见表观遗传学现象克隆动物未老先衰多莉:生于年月日死于年月日一、表观遗传学概述(一)常见表观遗传学现象组织特异性基因的表达一、表观遗传学概述(二)表观遗传学起源一、表观遗传学概述(三)表观遗传学确切定义表观遗传学:基因的DNA序列不发生改变的情况下基因的表达水平与功能发生的可遗传的改变。(四)表观遗传学的特点可遗传的即这类改变通过有丝分裂或减数分裂能在细胞或个体世代间遗传可逆性的基因表达调节也有较少的学者描述为基因活性或功能的改变没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。一、表观遗传学概述一、表观遗传学概述(五)表观遗传学与经典遗传学表观遗传学是对经典遗传学的补充和完善丰富了传统的遗传学内容。一、表观遗传学概述(五)表观遗传学与经典遗传学基因组含有两类信息遗传信息:它提供了产生生命所必需的所有蛋白质的全部核昔酸序列表观遗传信息:它提供了何时、何地和如何应用遗传学信息的指令以确保基因表达在时间和空间上的有序性的。二、表观遗传学主要内容DNA甲基化修饰组蛋白修饰染色质重塑非编码RNA的调控二、表观遗传学主要内容(一)DNA甲基化修饰DNA甲基化(DNAmethylation)是研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式主要是基因组DNA上的胞嘧啶在DNA甲基转移酶(DNMTs)催化下甲基从S腺苷甲硫氨酸(SAM)转移至胞嘧啶位碳原子上形成甲基胞嘧啶(mC)。在发生甲基化的胞嘧啶后通常紧跟着一个鸟嘌呤(G)碱基。因此通常称CpG的甲基化。二、表观遗传学主要内容(一)DNA甲基化修饰在结构基因的’端调控区域,CpG二连核苷常常以成簇串联形式排列这种富含CpG二连核苷的区域称为CpG岛(CpGislands)其大小为bp约的编码基因含该结构。基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合。二、表观遗传学主要内容(一)DNA甲基化修饰二、表观遗传学主要内容(一)DNA甲基化修饰DNA全新甲基化DNA主动去甲基化DNA甲基化状态的保持二、表观遗传学主要内容(一)DNA甲基化修饰肿瘤细胞的甲基化特点总体甲基化水平低局部甲基化水平高即抑癌基因的甲基化水平高二、表观遗传学主要内容(一)DNA甲基化修饰生物学意义胚胎发育X染色体失活寄生DNA序列抑制基因印记基因组稳定二、表观遗传学主要内容(二)组蛋白修饰每个核小体由核心组蛋白(HA,HB,H,H)构成异源八聚体和缠绕在八聚体之外的约bp的DNA组成。核小体结构示意图二、表观遗传学主要内容(二)组蛋白修饰基因正常表达除了需要相应转录因子的诱导和启动子区处于低甲基化状态外还需要具备另外一个表观遗传学条件即组蛋白修饰处于激活状态。组蛋白对特定氨基酸的修饰可以间接提供某些蛋白的识别信息然后通过蛋白质和染色质的相互作用改变染色质的结构从而调控基因的表达。组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型被称为组蛋白密码(histonecode)。(二)组蛋白修饰二、表观遗传学主要内容二、表观遗传学主要内容(二)组蛋白乙酰化修饰(Acetylation)乙酰化修饰大多发生在H、H的Lys残基上在组蛋白乙酰基转移酶(HAT)的作用下将乙酰基转移到其残基上消除了氨基酸上的正电荷这时DNA分子本身所带的负电荷有利于DNA构象的展开核小体的结构变得松弛使得转录调控的各种蛋白因子能够与DNA结合进而发挥转录调控作用。组蛋白中不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质(euchromatin)和有表达活性的基因相关联。组蛋白乙酰化是可逆的过程可在组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的作用下去乙酰化。二、表观遗传学主要内容(二)组蛋甲基化修饰(Methylation)组蛋白甲基化可以与基因抑制有关也可以与基因的激活相关这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置。组蛋白H的个Lys(K、K、K、K、K)和H的一个Lys(K)可被甲基化:HK、HK、HK甲基化可以抑制基因表达HK、HK、HK甲基化具有激活效应。二、表观遗传学主要内容(二)组蛋白磷酸化修饰(Phosphorylation)二、表观遗传学主要内容(二)组蛋白泛素化修饰(Ubiquitin)泛素化修饰是一个由多种酶共同参与调控的级联酶促反应过程ATP依赖导致S蛋白酶复合体对修饰蛋白的水解HA和HB是泛素化修饰最集中的地方参与基因调控的机制:改变染色质高级结构暴露DNA起始转录。E:泛素活化酶E:泛素结合酶E:泛素连接酶二、表观遗传学主要内容(三)染色质重塑(chromatinremodeling)染色质重塑是指染色质位置和结构的变化(核小体的置换或重新排列),改变了核小体在基因启动序列区域的排列增加了基因转录装置和启动序列的可接近性。二、表观遗传学主要内容(三)染色质重塑(chromatinremodeling)染色质重塑方式主要包括两种:一种是含有组蛋白化学修饰(乙酰化、甲基化及磷酸化等)另一种是依赖ATP水解释放能量解开组蛋白与DNA的结合使转录得以进行二、表观遗传学主要内容(三)染色质重塑(chromatinremodeling)ATP依赖的染色质重构机制二、表观遗传学主要内容(四)非编码RNA的调控无论是DNA修饰还是组蛋白修饰都是基因活性调节的中间参与者而真正诱导基因活性改变者是功能性非编码RNA。非编码RNA在调节基因表达、基因转录、调整染色质结构、表观遗传记忆、RNA选择性剪接以及蛋白质翻译中都发挥重要作用。不仅如此RNA在保护机体免受外来核酸的侵扰中也扮演着重要的角色被认为是最古老的免疫体系。二、表观遗传学主要内容(四)非编码RNA的调控非编码RNA可依据大小分为:长链非编码RNA:在基因簇以至整个染色体水平发挥顺式调节作用,甚至可以介导单条染色体的失活。短链非编码RNA(smallinterferingRNA和microRNA):主要是在转录后水平对基因的表达进行调控。二、表观遗传学主要内容(四)长链非编码RNA的调控X染色体失活就是长链非编码RNA所介导的一个重要表观遗传学现象可以说是表观遗传学中由RNA引导的DNA甲基化和组蛋白修饰共同参与的一个复杂的过程。失活的X染色体是由自身的一个失活中心调控的Xic长约Mb包括个已知基因:Xist、Xce、Tsix和DXPasXist:X染色体失活特异性转录因子是X染色体上启动转录最早的基因。Xce:在基因组中的组成与X染色体随机失活中的选择有关当Xce处于纯合状态时体细胞中的X失活是完全随机的而杂合态时失活不是完全随机的。Tsix:位于Xist下游的瞬时调控元件与CTCF可能协同起着Xist的外源开关功能。DXPas:富含CpG包括一个Kb的微卫星重复序列对X失活有一定调控作用。二、表观遗传学主要内容(四)长链非编码RNA的调控二、表观遗传学主要内容(四)长链非编码RNA的调控X染色体失活过程:Xic失活基因编码出对应的RNA这些RNA包裹在合成它的X染色体上当达到某一水平后在DNA甲基化和组蛋白修饰的参与下共同导致并维持X染色体的失活。二、表观遗传学主要内容(四)短链非编码RNA的调控主要是在转录后水平对基因的表达进行调控,又称为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)。siRNA介导的RNAimiRNA对靶gene的调控二、表观遗传学主要内容(四)短链非编码RNA的调控siRNA介导的RNAi特点:往往是外源性的如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生siRNA是双链RNA,端有个非配对碱基与靶mRNA一般要求完全互补,siRNA可作用于mRNA的任何部位,降解目标mRNA。二、表观遗传学主要内容(四)短链非编码RNA的调控microRNA途径特点:内源性基因编码单链小分子RNA长约nt是生物体自身的一套正常的调控机制控制发育进程、细胞分化、凋亡、分裂以及器官的发育miRNA主要作用于靶标基因´UTR区当miRNA和靶基因mRNA的’UTR几乎完全配对时导致靶基因mRNA降解miRNA与靶基因不完全互补导致靶基因mRNA翻译抑制。二、表观遗传学主要内容(四)短链非编码RNA的调控第一个miRNA是Lee等在年在秀丽新小杆线虫发现的::::::::::Pubmed收录关于miRNA论文篇数二、表观遗传学主要内容(四)短链非编码RNA的调控miRBase数据库显示目前人类成熟microRNA约条约左右的脊椎动物基因表达受miRNA的调控。一个miRNA分子能调控多个靶基因而一个靶基因又同时受到多个miRNA分子的协同调控它们之间组成了错综复杂的调控网络实现了对人体生命活动以及疾病发生发展和转归过程的精细调控。。表观遗传学渗入生命科学的各个领域三、几种常用表观遗传学研究方法甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR,MSP)亚硫酸氢钠依赖的基因测序(BisulfiteGenomicDNASequencing)凝胶迁移实验(ElectrophoreticMobilityShiftAssayEMSA)染色质免疫沉淀分析(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)三、几种常用表观遗传学研究方法(一)甲基化特异性PCR(MSP)该方法是由Herman等于年提出的一种检测甲基化的方法。将DNA先用重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变,随后进行引物特异性的PCR。MSP方法的关键点是引物的设计一般设计二对引物:甲基化特异引物(MPrimer):是根据待测序列的CpG位点甲基化时经亚硫酸盐修饰后的核苷酸序列设计的该引物能扩增引物位点发生甲基化的序列非甲基化特异引物(UPrimer):是根据待测序列的CpG位点无甲基化时经亚硫酸盐修饰后的核苷酸序列设计的该引物能扩增引物位点未发生甲基化的序列。三、几种常用表观遗传学研究方法(一)甲基化特异性PCR(MSP)三、几种常用表观遗传学研究方法(一)甲基化特异性PCR(MSP)MSP引物设计常用两种软件:MethylPrimerExpressSoftware(ABI公司)MethPrimer(在线软件):wwwurogeneorgmethprimerindexlhtml引物通常是带有CpG序列越多特异性就越好。该方法只能作定性研究不能作定量检测。引物的选择和设计、重亚硫酸盐处理是否完全非常关键否则容易导致假阳性。三、几种常用表观遗传学研究方法(一)甲基化特异性PCR(MSP)三、几种常用表观遗传学研究方法(二)亚硫酸氢钠依赖的基因测序该方法原理是DNA进行硫化处理后亚硫酸盐能将DNA中的C转变为U而已经甲基化的C则不会发生这种变化用针对修饰后的序列设计引物进行扩增。PCR使用的引物(BSP)必须避开CpG二核昔酸序列这样才能保证该序列是否甲基化序列都能得到同等程度的扩增。引物设计软件同MSP。对PCR产物进行克隆测序(至少个)分析能明确每个甲基化位点情况。此方法是一种可靠性及精确度均很高的定量检测方法能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态但需要大量的克隆测序,操作过程繁琐且费用昂贵。三、几种常用表观遗传学研究方法(二)亚硫酸氢钠依赖的基因测序三、几种常用表观遗传学研究方法(三)凝胶迁移实验(EMSA)一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。这项技术是基于DNA蛋白质或RNA蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中有不同迁移率的原理。当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。三、几种常用表观遗传学研究方法(三)凝胶迁移实验(EMSA)凝胶迁移实验基本原理图标记了的DNA由于与同一种蛋白结合于是在凝胶电泳中移动速度变慢放射显影中呈滞后的条带。如果加入该蛋白的抗体后其移动速度更慢形成更滞后的条带。三、几种常用表观遗传学研究方法(三)凝胶迁移实验(EMSA)EMSA基本五个反应体系三、几种常用表观遗传学研究方法(三)凝胶迁移实验(EMSA)成功EMSA试验:把握整体,注意细节!EMSA试验关键因素:试验设计:主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间梯度的问题。核蛋白样品的制备:注意使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像掌握好核蛋白的浓度和纯度,否则影响结合反应拿不到结果。探针的制备:生物素标记’端和’端两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度。制胶:必须是非变性PAGE凝胶,一般用的非变性胶制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在分钟凝固的效果。结合反应条件要合适:离子浓度PH值等预电泳和电泳:XTBE在冰上V预电泳小时务必换掉预电泳的缓冲液,用新的XTBE低温下V电泳约分钟。电转运:在XTBE中mA电转移分钟,注意转运膜的选择。三、几种常用表观遗传学研究方法(三)凝胶迁移实验(EMSA)紫外交联:正规的应该是交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那紫外就用无菌操作台上的紫外灯下cm处交联分钟就可以了化学发光反应:没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!!!二是StreptavidinHRP不能加在膜上,而是加在液体中混匀后在将膜放在液体中孵浴化学发光图像显示:两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和Western试验操作相当,只是这个膜是一次性的,不能重复使用。三、几种常用表观遗传学研究方法(三)凝胶迁移实验(EMSA)三、几种常用表观遗传学研究方法(四)染色质免疫沉淀分析(ChIP)是基于体内分析发展起来的方法也称结合位点分析法在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。通过该方法可获得蛋白质与DNA在体内相互作用的信息它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。三、几种常用表观遗传学研究方法(四)染色质免疫沉淀分析(ChIP)ChIP基本原理图是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段然后通过免疫学方法沉淀此复合体特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段通过对目的片断的纯化与检测从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。三、几种常用表观遗传学研究方法(四)染色质免疫沉淀分析(ChIP)ChIP基本步骤三、几种常用表观遗传学研究方法(四)染色质免疫沉淀分析(ChIP)CHIP与其他方法的结合CHIPonchip:是CHIP与基因芯片相结合建立的方法将ChIP富集得到的DNA片段与芯片杂交已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。CHIPsequencing:是CHIP与目前高通量测序技术的结合的方法将ChIP异性地富集目的DNA片段进行纯化与文库构建然后进行高通量测序。将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。RNACHIP:用于研究RNA在基因表达调控中的作用具体方法和ChIP差不多只是实验过程中要注意防止RNase最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA。三、几种常用表观遗传学研究方法(四)染色质免疫沉淀分析(ChIP)CHIP与其他方法的结合

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